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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
在生物间的各种相互作用中，生物的化学防御
（共生化学防御）是特别有趣的，因为它既是保持
生物物种分布平衡的基本因素，也是促进生物协同
进化的重要因素。共生通过水平基因转移来影响基
因库，并且对次生代谢的进化施加影响 ；更重要的
是，共生微生物产生次生代谢产物可能是共生微生
物影响其宿主的一种重要适应机制［1］。过去研究较
多的是植物和土壤微生物的化学防御，例如，植物
与固氮菌 Frankia 的相互关系［2］，而植物与其内生
放线菌的化学防御［3］，尤其是与链霉菌的化学防御
研究得较少［4，5］。滑桃树（Trewia nudiflora L.）是大
戟科滑桃树属植物，热带大乔木，该植物的主要化
学成分为具有抗肿瘤活性的美登木素类化合物［6-8］。
Streptomyces sp. WXC（S. sp. WXC）菌株是从滑桃树
种子中分离到的一株内生链霉菌。前期试验发现，
收稿日期 ：2013-12-03
作者简介 ：吴欣，女，博士，工程师，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：careless78@gmail.com
滑桃树种子化学组分对其内生菌影响的研究
吴欣
（国家海洋局第三海洋研究所，厦门 361005）
摘 要： Streptomyces sp. WXC 菌株是从滑桃树（Trewia nudiflora L.）种子中分离到的一株内生菌。提取植物种子的化学成分，
对其进行溶剂分组，检测各组分对内生放线菌 S. sp. WXC 的生长、代谢和活性化合物的影响，结果表明，滑桃树种子水溶性提取
物 Water ext. 对 S. sp. WXC 的生长、次生代谢产物和活性化合物都有明显的促进作用。
关键词 ： 滑桃树种子化学组分 Streptomyces sp. WXC 菌株 活性化合物 化学防御
The Research on the Influence of Trewia nudiflora Seed Chemical
Components on Its Endophyte
Wu Xin
（Third Institute of Oceanography State Oceanic Administration，Xiamen 361005）
Abstract:  Streptomyces sp. WXC was an endophytic strain isolated from the seed of Trewia nudiflora. Trewia nudiflora seed chemical
components were extracted and classified. The results showed that the production of frenolicin B was induced by the addition of the Water ext.,
which was correlated to the upregulation of growth and secondary metabolites. Therefore, we speculated that the inducible production of the
antifungal frenolicin B may be an important adaptation mechanism allowing the symbiont, S. sp. WXC, to affect its host, T. nudiflora, through the
function of symbiotic chemical defense.
Key words:  Trewia nudiflora seed chemical components Streptomyces sp. WXC Active compound Chemical defence
S. sp. WXC 菌株在常见的培养基上生长缓慢，菌株
生物量低，当培养基中加入滑桃树种子提取物后，
菌株生长良好，生物量明显增加，菌株发酵产物的
抗菌活性也随之提高。因此，我们推测很可能是植
物种子中的化学成分诱导 S. sp. WXC 菌株提高了生
物量和活性化合物的产量。本研究提取植物种子的
化学成分，对其进行溶剂分组，检测各组分对内生
放线菌 S. sp. WXC 的生长、代谢和活性化合物的影
响，旨在探究滑桃树种子化学成分对其内生菌 S. sp.
WXC 菌株的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
滑桃树（T. nudiflora L.）种子由云南西双版纳
植物园提供。
2014年第6期 107吴欣 ：滑桃树种子化学组分对其内生菌影响的研究
分析纯级石油醚、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇，
色谱级甲醇，无水 Na2SO4 均购于英杰生命科技有限
公司。
1.2 方法
1.2.1 滑桃树内生菌 S. sp. WXC 菌株的分离和保
藏 S. sp. WXC 菌株是由滑桃树无菌苗中分离到的
一株内生菌。用含有赤霉素（1 mg/mL）的琼脂培养
基诱导滑桃树无菌苗，当其生长到 5-6 cm 时，将其
切成 5 mm 的片段，置于高氏一号培养基上，28℃
培 养 分 离 得 到 WXC 菌 株。 该 菌 株 的 形 态 特 征 和
GenBank 序列比对结果表明，该菌株属于链霉菌属
（Streptomyces sp.）。菌株置于 10% 甘油中，密封于安
培管中，-70℃保藏。
1.2.2 滑桃树种子化学组分的提取 将滑桃树种子
去壳，称重得 100 g，研磨成细小的碎块，用石油醚
浸泡，在 50℃水浴中加热大约 2 h，待冷却后过滤，
共提取 3 次，获得石油醚提取液，减压回收溶剂，
获得石油醚提取物 1（PE ext.1）。将石油醚加热回
流提取过滤后获得的种子残渣用乙酸乙酯加热回流
提取并过滤，方法同前，提取 3 次，获得乙酸乙酯
提取液，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯提取物。用
石油醚∶甲醇＝ 1∶1 对乙酸乙酯提取物进行萃取，
获得甲醇提取物 1（MeOH ext.1）和石油醚提取物 2
（PE ext.2），将 PE ext.1 和 PE ext.2 合并得到石油醚
提取物（PE ext.）。将经过石油醚和乙酸乙酯加热回
流提取后的种子残渣用 80% 的甲醇进行加热回流提
取，重复 3 次，获得稀甲醇提取液，减压回收溶剂，
得到甲醛提取物 2（MeOH ext.2）。将 MeOH ext.1 和
MeOH ext.2 合并，减压回收溶剂，并用乙酸乙酯∶
水＝ 1∶1 萃取 3 次，得到乙酸乙酯萃取液和水相。
在乙酸乙酯萃取液中加入过饱和的无水 Na2SO4，静
置、过滤后，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯提取物（EA
ext.）。水相部分用等体积正丁醇萃取 3 次，获得正
丁醇萃取液和水相，分别减压回收溶剂，得到正丁
醇提取物（Bu ext.）和水溶液提取物（Water ext.）。
将 PE ext.、EA ext.、Bu ext. 和 Water ext. 定容至 250
mL 溶液中，每组分浓度相当于 400 mg/mL 滑桃树种
子的浓度。
1.2.3 滑桃树种子化学组分对 S. sp. WXC 菌株生长
状态的影响 蘸取 S. sp. WXC 菌株的孢子于 10 mL
无菌水中，制成菌悬液，将菌悬液涂布于高氏一号
培养基上，用微量注射器分别吸取 25 μL 的化学组
分（EA ext.，Bu ext.，Water ext.）于纸片上，待纸
片吹干后，平铺于培养基上，并用空白的纸片作对
照（blank control），将平板置于 28℃培养 10 d，观
察菌株生长状态。
1.2.4 滑桃树种子化学组分对 S. sp. WXC 菌株生
物量的影响 在 100 mL 高氏一号培养基中分别加
入 250 μL 滑桃树种子化学组分（EA ext.，Bu ext.，
Water ext.），将 S. sp. WXC 菌株接种在添加了滑桃树
种子化学组分的高氏一号培养基和未添加任何化学
组分的高氏一号培养基中分别进行培养，在 28℃，
180 r/min 的条件下，分别培养 3、4、5 和 6 d。根据
不同培养时间收菌，4℃，6 000 r/min，15-20 min，
菌体经过冷冻抽干后，称菌体干重。以上每个样品
分别作 3 个重复。
1.2.5 不 同 浓 度 的 滑 桃 树 种 子 化 学 组 分 与 S. sp.
WXC 菌液浓度的关系 将不同浓度的滑桃树种子
化学组分加入高氏一号培养基中（终浓度分别为 0、
1、5、25、125、250、500 和 1 000 μg/mL），将 S. sp.
WXC 菌株接种到培养基中，于 28℃，180 r/min，培
养 48 h。通过检测菌体的 OD600 值判断滑桃树种子
化学组分的浓度与菌液浓度的关系。以上每个样品
分别作 3 个重复。
1.2.6 滑桃树种子化学组分对 S. sp. WXC 菌株次生
代谢产物的影响 在 100 mL 高氏一号培养基中分别
加入 250 μL 滑桃树种子化学组分（EA ext.，Bu ext.，
Water ext.），将 S. sp. WXC 菌株接种在添加了滑桃树
种子化学组分的高氏一号培养基和未添加任何化学
组分的高氏一号培养基中分别进行培养，在 28℃，
180 r/min 的条件下，分别培养 3、4、5 和 6 d。根据
不同培养时间，收集菌体，4℃，6 000 r/min，15-20
min，上清用等体积乙酸乙酯萃取 2 遍，浓缩得到胞
外的乙酸乙酯相 ；菌体经过冷冻抽干后，用乙酸乙
酯提取得到胞内的乙酸乙酯相。以上每个样品分别
作 3 个重复。
1.2.7 滑桃树种子化学组分对 S. sp. WXC 菌株活性
化合物的影响 对胞内和胞外的乙酸乙酯相，分别
用 HPLC 技术来检测其中活性成分 frenolicin B 的含
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期108
量。以纯品 frenolicin B 作为标准样，分别取 3、6、
12、25 和 50 μg 上样，洗脱剂为甲醇∶水（60∶40），
洗脱条件为 1 mL/min，27℃。根据所得的数据制
作 frenolicin B 的标准曲线。将胞内和胞外的乙酸
乙酯相分别经过 HPLC 检测，洗脱剂为甲醇∶水
（60∶40），洗脱条件为 1 mL/min，27℃。根据标准
曲线，算出各样品中 frenolicin B 的含量，frenolicin
B 的产量与 S. sp. WXC 菌株的生物量的比值，即为
frenolicin B 的相对表达量。
2 结果
2.1 滑桃树种子化学组分对S. sp. WXC菌株生长和
生物量的影响
本研究在前期试验现象基础上，提取了滑桃
树种子的化学成分，根据成分的化学极性，对其进
行溶剂分组，排除组分 PE ext.（主要为常见的脂溶
性化学成分），通过纸片法研究滑桃树种子化学组
分（Water ext.、EA ext. 和 Bu ext.）对 S. sp. WXC 菌
株生长状态的影响。结果（图 1）表明，位于 Water
ext. 纸片周围的菌株生长较多且紧密，其次为 Bu
ext.，EA ext. 对菌株生长并没有明显的作用，说明滑
桃树种子中的水溶性物质对 S. sp. WXC 菌株的生长
起到明显的促进作用。
且 S. sp. WXC 的菌液浓度随着 Water ext. 浓度的提高
而升高，当 Water ext. 浓度在 1-25 μg/mL 时，菌株
WXC 的菌液浓度急剧上升，但在 125-1 000 μg/mL 时，
菌液浓度增加较为平缓（图 3）。
EA ext. Blank
Bu ext. Water ext.
图 1 滑桃树种子化学组分对 S. sp. WXC 菌株生长状态的
影响
除此以外，与不加种子化学成分的培养条件相
比，S. sp. WXC 菌株在添加种子化学成分后，菌株
生物量发生了较大的变化，从 3、4、5 和 6 d 的数
据来看，添加 Water ext. 的菌株干重几乎是不添加时
的 3 倍（图 2）。Bu ext. 对菌株干重的影响次之，EA
ext. 对菌株干重并没有明显的作用。该结果进一步确
定了滑桃树种子的水溶性成分能刺激菌体生长。而
0
40
80
120
160
200
3 4 5 6ษޫཙᮠd
␫࣐Water ext.
␫࣐EA ext.
␫࣐Bu ext.
ᵚ␫࣐种子化学组分
㧼փ
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mg

图 2 滑桃树种子化学组分对 S. sp. WXC 菌株生物量的影响
2.2 滑桃树种子化学组分对S. sp. WXC菌株次生代
谢产物的影响
从 S. sp. WXC 菌株胞内和胞外次生代谢产物的
产量来看，滑桃树种子的 Water ext. 对胞外的产物有
明显的促进作用，相比之下，Bu ext. 和 EA ext. 对胞
外的产物没有明显的作用。在第 3 天添加 Water ext.
的菌株胞外次生代谢产物的产量与不加种子成分的
菌体产量一致，但在菌体的指数生长期，添加 Water
ext. 的菌株胞外次生代谢产物的产量逐渐增加，到
第 6 天产量几乎是不添加种子成分的 2-3 倍（图 4）。
可见，种子的水溶性提取物对 S. sp. WXC 菌株胞外
的次生代谢产物有明显的诱导作用，而对胞内的次
生代谢产物无明显作用。
Water ext.⎃ᓖμg/mL
0
0.0
0.5
1.5
2.5
2.0
1.0
200 400 600 800 1000
O
D
60
0
图 3 不同浓度 Water ext. 对 S. sp. WXC 菌液浓度的影响
2014年第6期 109吴欣 ：滑桃树种子化学组分对其内生菌影响的研究
2.3 滑桃树种子化学组分对S. sp. WXC菌株活性化
合物的影响
从 3-6 d HPLC 的检测结果（图 5）表明，添加
了 Water ext. 的 fenolicin B 的产量逐渐增加，而 Bu
ext. 和 EA ext. 对 fenolicin B 的产量影响并不大。在
第 6 天时，添加了 Water ext. 的 fenolicin B 的产量达
到不添加 Water ext. 的 3 倍左右，说明滑桃树种子的
水溶性提取物诱导内生菌提高了活性化合物 fenolicin
B 的产量。
相比，该菌的生长非常缓慢，并且呈现出各种不同
的形态［9］。本研究发现，滑桃树的种子水溶性提取
物 Water ext. 对 S. sp. WXC 菌株的生长有明显的促进
作用，并且菌株的生物量随着 Water ext. 浓度的升高
而提高。Water ext. 对 S. sp. WXC 菌株的次生代谢产
物也有明显的促进作用，诱导菌株提高了主要活性
化合物 fenolicin B 的产量。滑桃树种子的化学组分
Water ext.、Bu ext. 和 EA ext. 的分子极性由大到小，
各组分对 S. sp. WXC 菌株的影响程度中 Water ext. 最
明显，EA ext. 对菌株的影响不明显，说明对 S. sp.
WXC 菌株有诱导作用的植物成分是分子极性比较大
的物质，很可能是水溶性的成分。本试验为进一步
研究对其内生菌 S. sp. WXC 有影响的滑桃树种子化
学成分奠定了基础。
滑桃树水溶性化学组分对 S. sp. WXC 菌株的活
性化合物 fenolicin B 的影响，说明了 S. sp. WXC 菌
株作为滑桃树的内生菌，在与植物宿主的长期协同
进化过程中，通过产生具有抑制真菌活性的物质，
形成了共生化学防御，并且这种活性物质可以被植
物宿主所诱导。植物与土壤微生物的化学防御机制
主要应用于生物防治。由于植物内生菌分布于植物
的不同组织中，有充足的营养物质，同时受到植物
组织的保护，不受外部恶劣环境如强烈日光、紫外线、
风雨等的影响，具有稳定的生态环境。因此，相对
于附生菌内生菌更易于发挥生防作用［10］。而且植物
内生菌可以直接面对病菌的侵染，通过降解病菌菌
丝、产生拮抗物质或诱导植物产生系统抗性抑制病
原物，对病菌的致病因子或病菌本身发起攻击，而
植物本身的基因并未发生改变，仍然可以保持植物
的天然性状［11］。因此，植物内生放线菌是植物病害
生物防治的天然资源菌，具有广阔的理论研究价值
和开发应用前景。
4 结论
主要研究滑桃树种子不同化学组分对其内生菌
Streptomyces sp. WXC 生长、代谢和活性化合物的影
响。结果表明，滑桃树种子水溶性提取物 Water ext.
对 S. sp. WXC 的生长、次生代谢产物甚至是活性化
合物都有明显的促进作用。
ษޫཙᮠd3
0
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4
6
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ᵚ␫࣐Water ext.Ⲵ㜎޵҉䞨҉䞟⴨
ᵚ␫࣐Water ext.Ⲵ㜎ཆ҉䞨҉䞟⴨
图 4 滑桃树种子 Water ext. 对 S. sp. WXC 菌株次生代谢
产物的影响
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
3 4 5
ษޫཙᮠd
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6
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␫࣐Bu ext.
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␫࣐EA ext.
图 5 滑桃树种子化学组分对 fenolicin B 产量的影响
3 讨论
S. sp. WXC 菌株是从滑桃树种子中分离到的一
株内生菌，在长期与宿主植物相互作用的过程中，
S. sp. WXC 菌株已经适应了植物的内生小环境，当
将它从植物中分离出来，并培养在人工培养基上
时，其生长速度缓慢。大部分不可培养或难以培养
的内生菌也出现同样的现象，较为典型的如菌株
Frankia，在人工培养时，与大多数自由生长的细菌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期110
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）