全 文 ：第５２卷第３期
２　０　１　２年５月
大 连 理 工 大 学 学 报
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｌｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．５２， Ｎｏ．３
Ｍａｙ　２　０　１　２
文章编号：１０００－８６０８（２０１２）０３－０３３８－０５
变构菌素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ接合转移体系建立与优化
王 　 芬，　邱 荣 国，　唐 　 莉＊
（大连理工大学 分子药物研究中心，辽宁 大连　１１６０２４）
摘要：以整合型质粒ｐＳＥＴ１５２为出发质粒，建立并优化了变构菌素产生菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）与Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）的属间接合转移体系，
确定了适用于变构菌素产生菌灰产色链霉菌的最佳接合转移条件．研究发现Ｃａ２＋和甘氨酸
都能够提 高 接 合 转 移 的 效 率，尤 其 是 甘 氨 酸 的 效 果 非 常 显 著．这 一 工 作 对 于 Ｓ．
ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ的基因操作、小分子药物生物合成机制的研究以及具有自主知识产权的药
物衍生物的开发具有普遍的应用价值．
关键词：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ；接合转移；甘氨酸；钙离子
中图分类号：Ｑ８１３ 文献标志码：Ａ
收稿日期：２０１０－１０－１３；　修回日期：２０１２－０３－１４．
基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目（３０６８８００３）．
作者简介：王 芬（１９８１－），女，博士；唐 莉＊（１９６３－），女，教授，博士生导师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｌｉ６３ｂ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．
０　引　言
变构菌素（ｔａｕｔｏｍｙｃｅｔｉｎ，ＴＭＣ）是一种首先从
灰产色链霉菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
（Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）的发酵液中分离得到的
聚酮类化合物［１、２］．ＴＭＣ是蛋白磷酸酶１（ＰＰ１）的
特异性抑制剂，具有抗真菌和免疫抑制活性，近年
来还发现ＴＭＣ能够干扰 ＭＡＰＫ信号途径和抑
制肿瘤细胞的生长［３～８］．因此，ＴＭＣ既是细胞分
子生物学研究的重要工具，也是一种新的作用机
制的抗肿瘤候选药物，并具有其他潜在的临床应
用价值．因此，建立一种高效的变构菌素产生菌遗
传操作系统，对于阐明其合成机制，开展ＴＭＣ的
组合生物合成研究，开发新的药物先导化合物是
非常必要的．
链霉菌中常用的外源遗传物质导入的方法有
ＰＥＧ介导的原生质体转化法、接合转移法和电击
转化法［９］，其中接合转移法不仅可以避开胞外核
酸酶对外源ＤＮＡ的降解作用，而且操作程序简
单，是放线菌属的遗传操作的重要手段［９～１１］．穿
梭质粒ｐＳＥＴ１５２含有整合酶和ｏｒｉＴ 位点，这就
使得该质粒可通过接合转移方法从大肠杆菌转入
链霉菌，并且整合进入链霉菌的基因组，用于早期
链霉菌接合转移系统的建立和优化．
虽然接合转移方法已经成熟，但是受体菌种
的不同，其最优化的条件也不同．为了能方便快捷
高效地对变构菌素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
进行基因操作，本文建立并优化变构菌素产生菌
Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ的接合转移系统，以使外源
ＤＮＡ 能 更 高 效 地 进 入 变 构 菌 素 产 生 菌
Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ．
１　材料和方法
１．１　材　料
（１）菌种和质粒
大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２、整合型质粒ｐＳＥＴ１５２
均 由 本 实 验 室 保 藏．变 构 菌 素 产 生 菌
Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ购自美国菌种保藏中心．
（２）培养基
大肠杆菌培养基为ＬＢ；链霉菌液体培养基
为ＴＳＢ，固体培养基为ＩＳＰ２；大肠杆菌和链霉菌
属间接合转移操作的培养基有 ＴＳＢ、ＹＰＤ、ＭＳ、
Ｒ５和改良高氏一号．
（３）抗生素与生化试剂
本研究所用ＬＡＴａｑ聚合酶和检测用引物购
于ＴａＫａＲａ公司（大连）；阿泊拉霉素和萘啶酮酸
均购自Ｓｉｇｍａ公司（美国）．
１．２　培养和基本的遗传操作
（１）链霉菌的培养、ＤＮＡ的提取
链霉菌的培养、总ＤＮＡ的提取见文献［１２］；
质粒提取等基本操作见文献［１３］．
（２）大肠杆菌与链霉菌的属间接合转移
大肠杆菌与链霉菌的属间接合转移方法见文
献 ［１２］；将 质 粒 ｐＳＥＴ１５２ 转 化 入 Ｅ．ｃｏｌｉ
ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２，转 化 子 Ｅ．ｃｏｌｉ　ＥＴ１２５６７／
ｐＵＺ８００２／ｐＳＥＴ１５２作为供体菌．供体菌接种于
ＬＢ培养基（含有５０μｇ／ｍＬ卡那霉素、２５μｇ／ｍＬ
氯霉素和５０μｇ／ｍＬ阿泊拉霉素）中，３７℃培养
过夜．次日按１∶５０的比例接种于含相同抗性的
新鲜ＬＢ培养基中，继续培养至ＯＤ６００＝０．４～
０．６；该培养物用ＬＢ培养基洗涤２次后，用新鲜
的ＬＢ培养基悬浮备用．刮取新鲜的灰产色链霉
菌孢子，打散后用灭菌水洗１遍，加入等体积的
ＴＳＢ培养基，于５０℃水浴热激处理１０ｍｉｎ，孢子
悬液放置到３７℃的摇床预萌发直至长出芽管，将
处理好的大肠杆菌和长出芽管的孢子悬液混合，
涂布于含有１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２的 ＭＳ平板，于３０
℃培养约２４ｈ后用含有５０μｇ／ｍＬ萘啶酮酸和
阿泊拉霉素的１ｍＬ水溶液均匀覆盖平板表面．
将平板继续置于３０℃培养直至观察到接合转移
子为止．
（３）ＰＣＲ扩增反应验证接合转移子
为了对阳性接合转移子进行ＰＣＲ验证，在所
选用质粒ｐＳＥＴ１５２阿泊拉霉素抗性基因内部设
计ＡＭＦ和ＡＭＲ　１对引物，扩增ａａｃ（３）ＩＶ基因
中大小约为７００ｂｐ的片段．
筛选得到的阳性接合转移子接种于含有抗生
素的液体 ＴＳＢ培养基中培养约２４ｈ，收集菌丝
体，提取总 ＤＮＡ 作为模板，野生型菌株的总
ＤＮＡ为阴性对照，ｐＳＥＴ１５２质粒为阳性对照，以
ＡＭＦ、ＡＭＲ为引物，进行ＰＣＲ扩增验证．所用的
ＰＣＲ条件反应程序为９６℃，２．５ｍｉｎ；９４℃，３０
ｓ；５０℃，４０ｓ；７２℃，１ｍｉｎ；３０个循环；７２℃延伸
１０ｍｉｎ．
引物序列如下：
ＡＭＦ：５′－ＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧ－３′
ＡＭＲ：５′－ＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＧＡ－３′
２　结果和分析
２．１　培养基的优化
在接合转移系统中，含有可转移质粒的大肠
杆 菌 作 为 供 体 （Ｅ．ｃｏｌｉ　ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／
ｐＳＥＴ１５２），受体可以是链霉菌孢子或营养菌丝．
据文献报道，孢子的接合转移效率比菌丝高３～４
个数量级．因此本研究选择孢子悬浮液作为受体．
常用的链霉菌接合转移系统为含１０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ２ 的 ＭＳ培养基，本研究同时选用了含有１０
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２ 的 ＭＳ、ＴＳＢ、ＹＰＤ、Ｒ５和改良高
氏一号培养基进行接合转移效率的比较．
研究结果表明，以ｐＳＥＴ１５２为供体质粒时，
ＭＳ培养基的接合转移效率为其他培养基的５～１０
倍，因此对变构菌素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
进行接合转移操作时选择 ＭＳ培养基．
２．２　大肠杆菌与链霉菌数量比的优化
在大肠杆菌－链霉菌的接合转移中，供体菌和
受体孢子的混合比例非常重要，如果供体大肠杆
菌用量过大，则受体孢子的生长受到抑制难以生
长，使接合转移效率显著下降甚至失败；如果受体
孢子的量过大，供体不足，则易造成链霉菌生长过
快，致使接合转移效率低下．
在 本 研 究 中 发 现 变 构 菌 素 产 生 菌
Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ的生长会明显抑制大肠杆
菌的生长，因此为了能够得到较多的接合转移子，
比较了受体与供体比例１∶１、１∶２、１∶３、１∶４、
１∶６、１∶８、１∶１０、１∶１５几个不同梯度．当变构
菌素 产 生 菌 Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ 与 Ｅ．ｃｏｌｉ
ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ｐＳＥＴ１５２按照１∶１、１∶２
的比例混合培养１２ｈ后，ＭＳ平板上会出现一层
白色的链霉菌菌丝体，也就是说受体过多，生长过
快，该浓度不适合用于接合转移体系；当浓度比达
到１∶１０时，接合转移的效率最高，分别约是浓度
比为１∶３时的１０倍，约是１∶４时的６倍，约是
１∶６时的３．５倍，约是１∶８时的１倍；将比例调
整到１∶１５，接合转移效率降低，其原因可能是大
９３３　第３期　 王 芬等：变构菌素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ接合转移体系建立与优化
肠杆菌和链霉菌混合培养时互相竞争，而链霉菌
的生长速度明显慢于大肠杆菌，供体大肠杆菌用
量过大，则受体孢子的生长受到抵制，使得接合转
移效率下降．
２．３　预处理条件的优化
进行接合转移遗传操作时，为了促进孢子萌
发，抑制菌体对外源质粒的限制性，通常需要对孢
子进行热激处理，所以热激的温度是影响接合转
移效率的重要因素．为了确定适合于变构菌素产
生菌孢子的热激处理条件，本文对经典的链霉菌
接合转移的热激条件５０℃、１０ｍｉｎ和４５℃、１０
ｍｉｎ进行对比．热激处理后，将孢悬液置于３７℃
摇床进行预萌发，每隔１５ｍｉｎ取样镜检，于２ｈ
后能看到芽管，将萌发出芽管的孢子和供体细胞
混合后涂布于 ＭＳ平板上以筛选接合转移子．
如图１所示，经过４５℃热激处理的孢悬液的
接合转移效率（η）明显高于５０℃的，并且经过４５
℃热激处理的孢子萌发率是５０℃热激的孢子萌
发率的１．５倍．
图１　不同热激温度对接合转移效率的影响
Ｆｉｇ．１　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈｅａｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
ｏｎ　ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
２．４　抗生素浓度的选择
在接合转移体系中，以 Ｅ．ｃｏｌｉ　ＥＴ１２５６７／
ｐＵＺ８００２／ｐＳＥＴ１５２为供体菌时，阿泊拉霉素和
萘啶酮酸用来筛选接合转移子．研究表明，变构菌
素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ对萘啶酮酸非常
敏感，当培养基中萘啶酮酸的浓度为５０μｇ／ｍＬ
时，变构菌素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ几乎
不能生长，使得接合转移效率低下；当萘啶酮酸的
浓度为３３μｇ／ｍＬ时不影响接合转移的效率；而
当萘啶酮酸的浓度为２０μｇ／ｍＬ时，无法抑制大
肠杆菌的生长，影响接合转移子的筛选．
阿泊拉霉素的浓度同样会影响接合转移的效
率．变构菌素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ在含
有３３μｇ／ｍＬ和５０μｇ／ｍＬ阿泊拉霉素的培养基
中产生接合转移子的效率不同，前者约是后者的
３倍；当阿泊拉霉素覆盖的终浓度为２０μｇ／ｍＬ，
萘啶酮酸的浓度为３３μｇ／ｍＬ时，野生型链霉菌
的生长不受到抑制，无法筛选接合转移子．
２．５　钙离子和甘氨酸对接合转移效率的影响
在接合转移系统中，含有可转移质粒的大肠
杆菌是供体，受体可以是链霉菌孢子或营养菌丝．
也就是说影响接合转移效率的因素除了质粒和外
界环境外，还包括供体和受体．一般情况下，接合
转移的 ＭＳ培养基中都加入１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２
以提高接合转移的效率．
变构菌素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ的生
长周期非常短，代谢快，而甘氨酸能够延长细菌生
长周期的延迟期（ｌａｇ　ｐｈａｓｅ）［１４］；另外Ｃａ２＋能够增
加大肠杆菌细胞膜的通透性．因此本研究中尝试
在 ＭＳ培养基内加入一定量的Ｃａ２＋和甘氨酸以
观察这些因素对接合转移效率的影响，并且在同
一条件下比较了 Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋和甘氨酸３种因素
对接合转移效率的影响．
如图２所示，当 ＭＳ培养基内只添加 Ｍｇ２＋
时，含３０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋的 ＭＳ能够得到相对较
多的 接 合 转 移 子；ＭＳ 培 养 基 中 同 时 含 ３０
ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋和５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｃａ２＋ 时，接合转移
的效率约是仅含有 Ｍｇ２＋或Ｃａ２＋时的２倍；仅含
３０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋ ＭＳ培养基的接合转移效率和
仅含５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｃａ２＋ ＭＳ培养基的接合转移效
率基本相同．
甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使
菌丝体片段更短，在研究过程中首先选择含０．３３％
甘氨酸的 ＭＳ培养基进行接合转移，但是得到的接
合转移子不能产生孢子或者产生的孢子很少，于
０４３ 大 连 理 工 大 学 学 报 第５２卷　
是将甘氨酸的质量分数降低到０．２％，该条件下
接合转移的效率高而且接合转移子长势良好．
本研究还比较了仅含有３０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋的
ＭＳ培养基和同时含有３０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋与０．２％
甘氨酸的 ＭＳ培养基，后者的接合转移效率约是
前者的１０倍；而仅含有甘氨酸的 ＭＳ培养基的接
合转移效率约是仅含有 Ｍｇ２＋的６倍．
综上，变构菌素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
在含有３０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｃａ２＋ 和
０．２％甘氨酸的 ＭＳ培养基上接合转移的效率比
较高．同时也表明了甘氨酸和Ｃａ２＋都能够提高接
合转移的效率，而甘氨酸对接合转移效率的影响
更加显著．
图２　在 ＭＳ培养基上生长的接合转移子
Ｆｉｇ．２　Ｅｘｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ
２．６　 接 合 转 移 子 （Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ／
ｐＳＥＴ１５２）的ＰＣＲ检测
本研究所设计的引物ＡＭＦ、ＡＭＲ用来扩增
位于质粒ｐＳＥＴ１５２上约７００ｂｐ的片段，因此以
接合转移子（Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ／ｐＳＥＴ１５２）的
总ＤＮＡ为模板时，能够扩增得到７００ｂｐ的阳性
条带，而野生菌株并不能扩增出相应条带（图３），
此结果足以证明质粒ｐＳＥＴ１５２已经整合入灰产
色链霉菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ的基因组中．
１ｐＳＥＴ１５２质粒的 ＰＣＲ 扩增产物（阳性对照）；
２ｐＳＥＴ１５２ 整 合 入 基 因 组 的 接 合 转 移 子
Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ／ｐＳＥＴ１５２的ＰＣＲ扩增产物；
Ｍ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００；３野生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
的ＰＣＲ扩增产物（阴性对照）
图３　接合转移子的ＰＣＲ鉴定结果
Ｆｉｇ．３　ＰＣＲ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ
３　结　论
本文建立并优化了适合于变构菌素产生菌
Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ的遗传操作接合转移方法．
确定了灰产色链霉菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ的最
佳接合转移条件为Ｅ．ｃｏｌｉ　ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／
ｐＳＥＴ１５２于３７℃培养至ＯＤ６００＝０．４～０．６收集
菌体，用ＬＢ培养基洗涤菌体２次．刮取新鲜的孢
子用灭菌水洗１遍后，加入等体积的 ＴＳＢ培养
基，４５℃水浴热激处理１０ｍｉｎ，冷却至室温后在
３７℃条件下预萌发约２ｈ至长出芽管，将处理好
的大肠杆菌和长出芽管的孢悬液按照１０∶１的比
例混合，涂布于含有３０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋、５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃａ２＋和０．２％甘氨酸的 ＭＳ平板，３０℃培养１６～
１８ｈ后用终浓度为３３μｇ／ｍＬ 阿泊拉霉素和
３３μｇ／ｍＬ萘啶酮酸进行覆盖，３０℃继续培养约
３６ｈ后即可观察到接合转移子．
到目前为止，已经报道的变构菌素产生菌
Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ的遗传操作均采用接合转移
方法，但本文的研究对常规方法进行了改进和优
化，尤其是发现甘氨酸和Ｃａ２＋能够提高接合转移
的效率，特别是甘氨酸对接合转移效率的影响非
常显著，使变构菌素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
的接合转移易于操作，大大提高了效率，节约了时
间，具有普遍的应用价值．
参考文献：
［１］ＣＨＥＮ　Ｘｉａｏ－ｌｏｎｇ，ＺＨＥＮＧ　Ｙｕ－ｇｕｏ，ＳＨＥＮ　Ｙｉｎ－ｃｈｕ．
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ｎｏｎａｄｒｉｄｅｓ，ｔａｕｔｏｍｙｃｉｎ，ｃｈａｅｔｏｍｅｌｉｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ　ａｎｄ
１４３　第３期　 王 芬等：变构菌素产生菌Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ接合转移体系建立与优化
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ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉａ　Ｔ　ｃｅｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
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ＰＴＤ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｒｕｇｓ ［Ｊ］．Ｙｏｎｓｅｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ
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ｔａｕｔｏｍｙｃｅｔｉｎ　ｏｆ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ
ｉｎ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ
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ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）
ｆｒｏｍ　Ａｅｑｕｏｒｅａ　Ｖｉｃｔｏｒｉａ　ａｓ　ａ　ｍａｒｋｅｒ ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，
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Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｎａｔｕｒａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ
［Ｍ］／／ＭＡＲＳＨＡＬＬ　Ｋ　Ｃ．Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
Ｅｃｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，１９９２：３８３－４３０
［１１］吴 胜，夏焕章．链霉菌基因转移的方法［Ｊ］．生物
工程进展，２００２，２２（１）：９１－９５
［１２］ＫＩＥＳＥＲ　Ｔ，ＢＩＢＢ　Ｍ　Ｊ，ＢＵＴＴＮＥＲ　Ｍ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｍ］．Ｎｏｒｗｉｃｈ：Ｊｏｈｎ
Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，２０００
［１３］ＳＡＭＢＲＯＯＫ　Ｊ，ＲＵＳＳＥＬＬ　Ｄ　Ｗ．分子克隆实验指
南［Ｍ］．３版．黄培堂，译．北京：科学出版社，２００２
［１４］ＩＬＬＩＮＧ　Ｇ　Ｔ，ＮＯＲＭＡＮＳＥＬＬ　Ｉ　Ｄ，ＰＥＢＥＲＤＹ　Ｊ
Ｆ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８９，１３５（８）：２２８９－２２９７
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｃｏｎｊｕｇａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ
ｏｆ　ｔａｕｔｏｍｙｃｅｔｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
ＷＡＮＧ　Ｆｅｎ，　ＱＩＵ　Ｒｏｎｇ－ｇｕｏ，　ＴＡＮＧ　Ｌｉ＊
（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄａｌｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ　１１６０２４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ　ｃｏｎｊｕｇａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ （Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｏ　ｔａｕｔｏｍｙｃｅｔｉｎ－
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ｉｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｎｄ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｕｓｅｓ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＳＥＴ１５２ａｓ　ｓｔａｒｔｉｎｇ　ｐｌａｓｍｉｄ．Ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃｏｎｊｕｇａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ａｒｅ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ．Ａｎｄ　ｉｔ　ｉｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　Ｃａ２＋ ａｎｄ　ｅｓｐｅｃｉａｌｙ
ｇｌｙｃｉｎｅ，ｃａｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｅｘｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ａｒｅ　ｖｅｒｙ　ｈｅｌｐｆｕｌ　ｔｏ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ，ｂｉｏ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｆｏｒ　ｓｍａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ　ｆｏｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｎｅｗ　ａｎａｌｏｇｓ　ｏｆ　ｄｒｕｇ　ｗｉｔｈ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ；ｃｏｎｊｕｇａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ；ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｃａ２＋
２４３ 大 连 理 工 大 学 学 报 第５２卷