全 文 ：·综述与专论· 2012年第11期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
高等生物基因的调控主要是在转录水平上进行，
受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作
用。基因启动子序列是与 RNA 聚合酶和一些反式因
子识别并结合的 DNA 序列，位于基因上游，参与下
游基因的调控表达，通常包含多种重要顺式调控元
件，这些元件是研究基因转录调控机制和表达模式
的关键。此外，在植物基因工程中常按功能将启动
收稿日期 : 2012-04-25
基金项目 : 国家转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08009-044B, 2009ZX08012-016B）
作者简介 : 马睿 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 植物病理学 ; E-mail: vipmarry@163.com
通讯作者 : 吴祖建 , 男 , 博士研究员 , 研究方向 : 植物病毒学 ; E-mail: wuzujian@162.com
何晨阳 , 男 , 博士研究员 ; 研究方向 : 分子植物病理学 ; E-mail: cyhe@caas.net.cn
病原物诱导型植物启动子的研究方法
马睿1，2  陈华民2  吴茂森2  吴祖建1  何晨阳2
（1 福建农林大学植物病毒研究所 福建省植物病毒学重点实验室，福州 350002 ；2 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家
重点实验室，北京 100193）
摘 要： 植物启动子是控制基因转录的 DNA 序列之一，按其表达方法可分为组成型（或非特异性）表达和诱导型（或特异性）
表达启动子两种类型。当受到病原物侵染时，植物通常通过诱导型启动子中的 W-box、RAV1 AAT 和 WRKY 等元件 / 位点、调控
下游基因的表达，作出相应的应答反应。近年来，通过计算机预测与试验测定方法的有效结合，发掘和鉴定出了一些病原物诱导
型启动子，并进行了调控功能的解析。此外，在通过转基因方法改良植物抗病性的途径中，利用病原物诱导型启动子可以实现对
抗病功能相关基因表达的精准控制，避免由组成型启动子持续驱动基因表达、对植株本身带来的负效应。结合本室对水稻启动子
OsBTF3-p 的研究结果，重点对近年来国内外有关病原物诱导型启动子及其调控元件 / 位点的研究方法和应用进展作一综述。
关键词 ： 诱导型启动子 调控元件 转基因途径
Progress in Pathogen-inducible Promoters of Plants
Ma Rui1，2 Chen Huamin2 Wu Maosen2 Wu Zujian1 He Chenyang2
（1Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province，Institute of Plant Virology of Fujian Agricultural and Forestry University，
Fuzhou 350002 ；2 State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）
Abstract:  Promoter controlling the gene transcription in plant can be classified constitutive promoter（non-specific promoter）and
inducible promoter（specific promoter）by the way of expression. When induced by pathogens, the W-box、RAV1AAT and WRKY elements
of inducible promoter in plant can regulate the expression of downstream genes, then the plant can make the appropriate responses. Recently,
many pathogen-inducible plant promoters were found and identified by computer prediction and experiment, at the same time, regulation function
of promoters was analyzed. In addition, in the process of improving the resistance of plant by transgenic approaches, the choice of pathogen-
inducible plant promoters can achieve the accurate regulation of resistance-related genes, avoiding the negative effect in plant due to consistent
expression of constitutive promoters. This paper reviews the research methods and application progresses of pathogen-inducible plant promoters
and regulatory elements, combining with the results of promoter OsBTF3p.
Key words:  Pathogen-inducible plant promoter Regulatory elements Transgenic approaches
子分为非特异性表达（或组成型）和特异性启动子。
组成型启动子在所有组织中都能启动基因的持续表
达，如目前使用最广泛的 CaMV35S。由于组成型启
动子不具时空特异性，会使驱动的目的基因在植物
各组织中恒定而持续的表达，过度消耗细胞内的物
质和能量，不利于植物生长发育。并且还不能从时
间和空间上有效地调控目的基因的表达，在应用中
2012年第11期 33马睿等 ：病原物诱导型植物启动子的研究方法
存在一定的缺陷。因此，受特定条件刺激才表达的
特异性启动子的研究和应用越来越受到重视。
1 植物特异性启动子及其调控元件类型
植物特异性启动子分为诱导型启动子和组织特
异性启动子。受信号刺激而使转录调控基因大量表
达的启动子称为诱导型启动子。该类启动子常用诱
导信号命名，可分为光、热、激素及病原菌诱导表
达基因启动子等。
组织特异性启动子调控基因只在某些特定的组
织部位或器官中表达，并往往表现出发育调控特性，
因此也称之为器官特异性启动子。这类启动子研究
较多的有根特异启动子、茎特异启动子、叶特异启
动子、花特异启动子、果实特异性表达启动子和种
子特异性表达启动子等。植物生长环境及基因表达
的复杂性，大多数基因的表达是受多种因素调控［1］，
所以特异性启动子的分类不具有绝对性，如绝大部
分果实特异性启动子同时存在乙烯应答元件［2］。有
些诱导型启动子同时也具有组织特异性，如水稻
OsBTF3-p 启动子既有 ABA 和病原菌调控元件，又
有叶片维管束组织特异性的表达特性［3］。植物特异
性启动子主要由保守的核心序列及其上游特异性的
顺式作用元件组成。一般情况下，基本启动子包含
转录起始位点和 TATA-box 结构。上游特异性的顺式
作用元件则控制转录水平，是表达调控的关键环节。
启动子序列中含有多种重要元件参与调控下游基因，
有利于植物适应复杂的环境。
受到真菌、细菌和病毒等病原物侵染时，植物
通过一系列的信号传导作用于抗病相关基因作出快
速的防御反应，抗病基因的表达又是依靠其上游启
动子的调控来实现的。病原诱导型启动子除包含转
录起始位点和 TATA-box 结构等基本成分外，还包含
W-box、RAV、WRKY、GCC 或 G-box 等特殊调控元
件［4］，该元件与不同的转录因子识别和结合以调节
转录，在病原物诱导基因的表达中起到主要作用。
其中研究较多的为 W-box 和 WRKY 作用元件。W-box
元件的保守序列为 TTGACC 或 TGAC-N-GTCA［4，5］，
研究发现病原诱导型启动子中通常都含有 W-box 元
件，并位于启动子的功能区域［6］。因此，W-box 是
病原诱导型启动子通用作用元件。同时，W-box 一
般串联存在并共同起调控作用［7］。WRKY 作为转录
因子外，还参与植物的抗逆反应［8，9］。水稻植株中
OsWRKY45，OsWRKY71 和 OsWRKY03 分别调控抗
逆信号的传导［9，10］。大量研究结果还显示，受病原
菌诱导后 WRKY 元件倾向与 W-box 调控元件结合，
相互作用调控基因表达［11，12］。作为乙烯诱导作用
元件 GCC-box 也存在于许多病原诱导型启动子中，
其保守序列为 AGCCGCC［13］。当病原物侵染植物时
会产生大量的乙烯诱导 GCC-box 元件以调控抗病基
因的表达，做出相应的防御反应［14］。G-box 可以分
为两类，一类是含有 ACGT 核心序列，当植株受到
病原物攻击时诱导表达，并常与其他调控元件共同
作用［15］；另一类含有类似 as-I 元件，保守序列为
CTGACGTAAGGGATGACGCAC［16］。
2 病原物诱导型启动子研究方法
病原物特异诱导性启动子因其诱导因素是病原
菌本身，当具体诱导因素不清楚，无相应蛋白或基
因信息时，研判诱导性启动子的调控元件或位点存
在一定的难度。研究病原物特异性启动子的调控元
件，需要找到一个快速、有效、方便、易操作、周
期短的研究方法。我们前期已发现一个受水稻白叶
枯病菌诱导的特异性启动子。结合这部分的研究工
作，将病原菌特异性启动子的研究思路和方法进行
介绍 ：病原菌植物特异性启动子的研究首先分为两
个步骤，即生物信息学预测和试验测定方法。
2.1 生物信息学预测分析
生物信息学分析与预测是一个重要的研究方法。
常用的植物启动子预测相关数据库和软件资
源 如 下 ：（1） 真 核 生 物 启 动 子 数 据 库（eukaryotic
promoter database，EPD）是一个较为综合性的数据
库，分为 6 大类，共 2 997 个条目。（2）转录调控
区域数据库（transcription regulatory regions database，
TRRD）是在连续积累的真核生物基因调控区结构
和功能特性信息基础上构建的，其数据均来源于已
发表的科学论文。（3）（transcriptional regulation from
patterns to profiles，TRANSFAC）转录因子数据库是
一个反式作用因子和真核顺式作用元件的数据库。
（4）植物顺式作用调控元件数据库（plant cis-acting
regulatory DNA elements，PLACE）包括维管植物和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期34
非植物体信息。（5）植物顺式作用元件数据库（plant
cis-acting regulatory elements，PlantCARE）收录了植
物顺式作用元件、增强子和抑制子，并提供调控元
件的位置和调控元件的保守序列。（6）PPDB（plant
promoter DB）是提供水稻和拟南芥启动子相关结构
信息和转录起始位点的数据库。（7）DoOP（databases
of orthologous promoters）是分析脊索动物和植物启动
子保守区域的数据库。
利用这些生物信息学软件分析启动子区域序列，
从中预测出与病原菌诱导功能相关的调控元件，如
PLACE 对水稻 OsWRKY19 基因启动子进行分析发
现，该序列含有 2 个 TATA box，9 个 CAAT box，9
个 W-box 多个顺式元件［17］。预测出的调控元件即是
下一步试验验证中的重点关注对象。
成表达载体，转化植物原生质体，再通过合适的检
测系统检测报告基因的表达，最终确定启动子表达
特性或调控元件。常用的报告基因有 β-葡聚糖酸醛
苷酶（GUS）、绿色荧光蛋白（GFP）、荧光素酶（LUC）
和氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因［9，11］。常用 PEG
介导的原生质体转化（包括拟南芥原生质体、烟草
原生质体和水稻原生质体）、基因枪轰击和农杆菌介
导的瞬时表达检测［13］。OsPR10a 基因是水稻系统中
获得与抗病性有关的关键基因，克隆 OsPR10a 启动
子及一系列 5 端缺失片段，结合报告基因 LUC，通
过基因枪轰击水稻叶片，SA 诱导 24 h 发现 WLE1
顺式元件在诱导中起重要作用［21］。
原生质体瞬时表达分析是一种快速的研究基因
表达、亚细胞定位及基因间互作的一种重要手段，
瞬时表达不需要整合到染色体上，因此具有简单、
快速、周期短、准确等优点。同时，瞬时表达不产
生可遗传的子代，生物安全性高。瞬时表达分析法
中常用的报告基因为 LUC，为避免瞬时表达分析受
到如原生质体的状态，移液误差和 DNA 的含量等内
在因素的影响，通常以萤火虫荧光素酶（fLUC）为
报告基因，同时以海肾荧光素酶（rLUC）作为系统
内参，以消除系统因素造成的误差。
2.3 稳定表达分析
稳定表达分析通过构建启动子与报告基因融合
的植物表达载体进行植物遗传转化，获得转基因植
株，通过转基因植株中报告基因的表达来判断启动
子功能。研究水稻启动子 PD540 功能时利用组培技术
将启动子转入水稻植株中获得转基因植株 T0 代，与
野生型相比发现转基因植株对稻纵卷叶螟有明显的
抗性［16，20］。研究启动子 AmCBL1 的功能，将启动子
全长及一系列缺失片段连接到含有 GUS 报告基因的
表达载体上并转入到烟草植株中，检测获得的转基
因烟草中 GUS 表达量，发现启动子 AmCBL1 具有维
管束表达的特性［25］。与瞬时表达分析法相比，其操
作过程复杂，周期长，但在植物体内表达效率稳定，
结果更准确可靠。
2.4 突变分析法
通过数据库和软件分析预测后，通常缺失启动
子部分序列构建缺失表达载体后进行植物转化，以
表 1 植物启动子预测相关数据库和软件资源
名称 网址 文献
EPD http://www.epd.isb-sib.ch ［18］
TRRD http://www.mgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/trrd ［19］
TRANSFAC http://www.gene-regulation.com ［20］
PLACE http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE ［21］
PlantCARE http://www.plantcare.com ［22］
PPDB http://ppdb.gene.nagoya-u.ac.jp/cgi-bin/index.cgi ［23］
DoOP http://doop.abc.hu/ ［24］
2.2 瞬时表达分析法
原生质体瞬时研究系统操作方便，周期短，是
研究病原菌诱导启动子特异调控位点的一种有效方
法。原生质体需要特定的系统溶液提供细胞培养所
需营养和维持细胞的渗透压，这些溶液中含有多种
无机和有机化合物。测定病原菌诱导型启动子活性
时，需要将病原菌加入系统溶液中以诱导启动子活
性。为了保证试验的真实性，需要明确系统溶液对
病原菌活性和致病性的影响。如将病原菌接种到系
统溶液中培养，在启动子诱导活性发生前病原菌大
量死亡或致病性降低，则需要优化原生质体的溶液
配方，找到一个既不影响原生质体状态又不影响病
原菌活性的溶液。
瞬时表达是外源基因进入受体细胞后未整合进
受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物。该技
术是将全长或缺失序列的启动子与报告基因融合构
2012年第11期 35马睿等 ：病原物诱导型植物启动子的研究方法
具体分析不同调控区域内的顺式作用元件。突变分
析包括片段缺失突变和点突变。首先通过 100-200
bp 片段缺失突变确定启动子的调控区域边界，再经
过 5-10 bp 片段的进一步缺失突变确定调控区域内
的重要调控元件，最后对调控元件的保守位点进行
精确的点突变，用以确定蛋白的作用位点。
片段缺失突变通常从 5 端或 3 端进行缺失，是
用于确定启动子调控区域的常用方法。分别是从启
动子 5 端或 3 端通过 PCR 扩增或酶切的方法缺失
成不同长度的片段，再将这些缺失片段与报告基因
相连，构成表达载体，进行植物转化，确定不同缺
失片段的诱导活性。 整段缺失法是缺失启动子内的
某一个具有调控功能的区域，通过植物转化研究缺
失区域功能。此方法不如 5 端缺失法、3 端缺失法
操作方便，一般常用于调控区域的进一步验证。水
稻 Osgrp-2 启动子的研究中，通过 5 端缺失分析发
现启动子 -1405/-1022 区域含有负调控元件。为了进
一步确定该区域的活性功能，整段缺失 -1405/-1022
区域后，发现报告基因 GUS 的表达产物明显增加，
因此确定此区域含有负调控元件［26］。
当确定调控元件后，通过碱基点突变的方法确
定起决定作用的碱基序列，突变时通常遵循碱基颠
换的原则。
3 其他常用研究方法
研究诱导型启动子还可利用凝胶阻滞、酵母
单杂交、DNase Ⅰ足迹分析和免疫共沉淀方法等。
因病原菌诱导启动子的具体诱导因素不清楚，无
具体的蛋白或基因信息。凝胶阻滞、酵母单杂交、
DNase Ⅰ足迹分析等方法均是通过分析 DNA 与蛋白
质之间作用。因此，这几种常用的启动子分析法在
研究病原菌诱导启动子时具有局限性。
3.1 凝胶阻滞分析法
凝胶阻滞试验是一种体外研究 DNA 与蛋白质
相互作用的特殊的凝胶电泳技术。基本原理为 ：在
凝胶电泳中，由于电场的作用，结合了蛋白质的
DNA 片段比未结合蛋白质的 DNA 片段移动的速度
慢，迁移距离近，由此来判断 DNA 片段是否可以和
蛋白质相结合。因此，标记短的 DNA 片段，将其
与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，检测标记
DNA 片段的迁移变化。凝胶阻滞分析法常用于研究
启动子与蛋白的结合情况，从中确定启动子中的顺
式作用元件和顺式元件与转录因子的相互作用［27］。
因为病原菌与水稻细胞互作存在多种蛋白质，并且
功能尚不明确。因此，导致试验量大，周期长，针
对性差等不足之处。此方法常受到核蛋白提取质量、
DNA 与蛋白结合体系条件、结合时间等因素影响，
容易造成试验不确定性。此法适用于确定蛋白质与
DNA 片段结合的验证。
3.2 酵母单杂交法
酵母单杂交技术是一项分析 DNA 与蛋白质之间
相互作用的重要技术。酵母单杂交试验是先将含有
启动子序列和报告基因的质粒转化酵母细胞，再将
文库 cDNA 片段与转录激活结构域融合构建质粒并
重复转化同一酵母细胞，最后根据下游报告基因的
表达情况分析与启动子相互作用的蛋白。酵母单杂
交法主要用于大规模研究启动子与转录因子之间的
相互作用［28］。酵母单杂交法通常很少用于启动子特
异调控位点的研究。
3.3 DNase I足迹分析法
DNase I 足 迹 原 理 是 蛋 白 结 合 在 DNA 片 段
上，保护结合部位不被 DNase I 破坏，这样蛋白质
在 DNA 片段上留下了“足迹”，在放射性自显影图
片上，相应的蛋白质结合的部位没有放射性标记条
带。DNase I 足迹分析法是研究 DNA 与蛋白质相互
作用的一种方法，其除能确定顺式元件与蛋白结合
外还能确定顺式元件的长度和序列，也可与凝胶阻
滞试验结合使用，通过凝胶阻滞鉴定特异结合位点
后再做足迹试验确认具体结合的碱基［29，30］。目前，
DNase I 足迹法在启动子顺式作用元件研究中的应用
较少，在病原物诱导启动子顺式作用元件的研究中
尚未见报道。
3.4 免疫共沉淀法
免疫共沉淀法也是研究启动子经常用的方法，
这种方法通常结合基因芯片技术或实时荧光 PCR 技
术来分析与特定蛋白相结合的 DNA 序列，从而获得
启动子及调控元件的序列信息。此外，随着基因芯
片技术的发展，在免疫共沉淀技术基础上，扩大到
基因组范围内研究 DNA 与蛋白的相互作用。目前此
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期36
方法在植物启动子顺式作用元件研究中尚未见报道。
4 植物特异性启动子的应用
与非特异性组成型启动子相比，特异性启动
子受外界刺激后可有效调控下游基因的表达，或在
特定部位高效表达，减少过量表达蛋白在体内的积
累对植株生长发育造成的损害。在植物的遗传改良
上，通常将抗性基因导入植物体中，从而提高植物
抗性，但抗性基因持续表达将对植物的生长较不利。
因此，利用病原物诱导型启动子来驱动抗性基因的
表达，将为解决这一问题提供一条有效的途径。单
一的特异性启动子作用范围有限，通过构建更加高
效、广谱、灵敏的多诱导因子人工启动子，从而提
高植物抗病虫的能力成为启动子研究的重要方向。
因此，研究特异性诱导启动子的调控位点，构建多
调控活性的联合启动子将是一个新的研究目标。将
病原物特异性的两个特异启动子 EAS4 和 hsr203J 串
联驱动 GUS 基因，构建植物表达载体。受疫霉激发
子（parasiticein）、疫霉孢子悬浮液和植物青枯病菌
悬液诱导后，转基因植株检测到明显的 GUS 活性，
表明双病原物诱导启动子均有良好的诱导活性［31］。
植物基因工程研究和应用过程中遇到的一个主
要问题就是转入的基因发生沉默或表达活性不高。
与只含有一种作用元件相比，含有两个不同顺式作
用元件 F 和 E17 的人工启动子受到立枯丝菌诱导后
GUS 活性明显增强［32］。研究表明，增加启动子和
顺式作用元件数目均能提高目的基因的表达效率。
将 gusA 和 gfp 与双向启动子两端融合，构建成双可
视报告基因融合双向启动子的植物二元表达载体。
GUS 和 GFP 分析显示该双向启动子可在毛白杨中实
现双向表达［33］。因此，在双向启动子的两端，分别
联接不同的功能基因及其组合，如植物抗性改良、
产量提高和品质改进等，可以实现多个单基因性状
的组合转化和表达。此外，启动子还可以应用于农
产品的检测，研究发现一个受镰刀菌产生的毒素玉
米烯酮 ZEA 诱导的启动子 ZEAR，连接 GFP 报告基
因的载体导入玉米赤霉菌中，通过 GFP 荧光的测定
用于检测农产品中玉米烯酮毒素的积累［34］。
5 展望
利用诱导启动子改良作物产量、品质和抗性已
成为研究的热点。近年来，通过计算机预测和实验
测定方法的有效结合，克隆了大量的特异性启动子，
并对其功能进行了相关研究。然而，目前能应用于
转基因研究的特异性启动子仍然很少，理想的病原
物诱导型启动子几乎没有。因此，发掘和研究能够
应用于植物改良的新型病原物诱导启动子将是今后
研究的一个重要内容。
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（责任编辑 狄艳红）