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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):69-73
食物过敏是食品安全面临的严峻问题［1］，是由
食物中致敏物质引起的免疫介导不良反应。食物过
敏性疾病发病率呈逐年上升趋势，据统计全球约有
3%-5% 的成年人和 5%-8% 的儿童受过敏性疾病的
困扰［2，3］。为保障公众健康，美国和欧盟从 2007 年
开始执行新的食品致敏原标签法规，要求生产企业
明确标明其产品中是否含有 8 大类和 12 种主要的食
物致敏原，包括小麦、大豆、花生、芝麻、芥末、
芹菜、坚果、畜禽产品和水产品等，我国国家标准
《预包装食品中的致敏原成分》和《预包装食品标签
通则》也对预包装食品中的主要致敏原成分及对这
些成分进行标识标注的要求作了具体规定［4，5］。大
收稿日期 ：2015-03-29
基金项目 ：安徽省质监局科研项目（13zj37003）
作者简介 ：汪永信，男，硕士，工程师，研究方向 ：分子生物学与食品安全检测 ；E-mail ：yxw118952@163.com
实时荧光 PCR 法同时检测食物中大豆和
芹菜致敏原成分
汪永信  程潇  安虹  聂磊  张波  刘娟娟
（国家农副加工食品质量监督检验中心 安徽省食品药品检验研究院，合肥 230051）
摘 要 ： 大豆、芹菜等食品原料是一些特殊人群的致敏原。根据大豆 atp A 基因和芹菜 mtd 基因设计特异性引物，利用不同
荧光素标记的 TaqMan 探针，建立了一种实时荧光 PCR 检测方法，可同时检测食物中大豆和芹菜致敏原成分。分别以大豆、芹菜、
大米、小麦、大麦、花生、芝麻、玉米、马铃薯、蕃茄、核桃、开心果、腰果、葵花籽、杏仁、苹果、梨、草莓、猪肉、牛肉、
羊肉及鱼肉等材料的基因组 DNA 作为模板，进行 PCR 扩增实验，结果发现该方法仅能特异性扩增大豆和芹菜致敏原成分。灵敏
度测试结果表明大豆和芹菜成分的检出限均达 0.01%。因此，本方法可以作为同时检测食品中大豆和芹菜致敏原成分的特异性方法。
关键词 ： 实时荧光 PCR ；大豆 ；芹菜 ；致敏原检测
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.012
Synchronously Detecting the Allergenic Ingredients of Soybean and
Celery in Food by Real-time Fluorescent PCR
WANG Yong-xin CHENG Xiao AN Hong NIE Lei ZHANG Bo LIU Juan-juan
（National Center for Quality Supervision and Test of Agricultural-avocation Processed Food，Anhui Institute for Food and Drug Control，
Hefei 230051）
Abstract: Soybean and celery as food ingredients are allergen for some special groups of people. Designing the specific primers based
on atp A gene of soybean and mtd gene of celery and utilizing TaqMan probes with different fluorescents, we set up a fluorescent real-time PCR
method allowing the simultaneous detection of allergenic constituents of soybean and celery in food. The specificity of the method was evaluated
using template DNAs from soybean or celery and other 20 species such as rice, wheat, barley, peanut, sesame, maize, murphy, tomato, walnut,
pistachio, cashew nut, sunflower seeds, almond, apple, pear, strawberry, pork, beef, mutton and fish, only the specific amplifications of soybean
and celery were observed. The limit of quantification was 0. 01% through sensitivity tests. In conclusion, the developed real-time PCR method is
a specific, sensitive and efficacious assay for the simultaneous detection of allergenic soybean and celery in food.
Key words: fluorescent real-time PCR ；soybean ；celery ；allergenic detection
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.170
豆和芹菜含有多种复杂致敏成分［6-10］，其食用致敏
症状主要表现为过敏性皮炎、鼻炎等，严重的可能
导致休克、甚至危及生命［1，11］。而目前尚没有食物
过敏的特效疗法，严格避免食入含这类成分的食物
是过敏患者的最佳选择，这很大程度上依赖于标签
标注。因此评价和检测食物致敏原日益受到重视。
致敏原的体外检测技术主要集中于依赖蛋白的
免疫学方法和依赖于核酸的 PCR 方法等［12］。而基
于时效性与准确性方面的优势，实时荧光 PCR 方法
已成为食品中致敏原检测的首选［13］，针对不同种类
的致敏成分，很多学者在此领域作过深入细致的研
究［14-16］。不过多数研究集中在传统 PCR 法或单重
实时荧光 PCR 法，每个反应仅能检测出一种致敏原
成分，而在一个 PCR 反应中同时检测出大豆和芹菜
两种致敏原成分的研究尚未见报道。而如何选择合
适的靶基因是进行 PCR 反应的前提，研究表明编码
大豆凝集素的核基因 lectin［17］，编码线粒体 ATP 合
成酶亚单位的 atp A 基因［18］都可以达到此目的，相
比核基因组 DNA，线粒体 DNA 是真核细胞核外遗
传物质，基因组中无间隔系列、无组织特异性、种
内遗传稳定、种间高度变异、个体不同组织中均含
有大量的线粒体，可以获得较高的拷贝数［18，19］，已
作为此类研究的首选。编码甘露醇脱氢酶的芹菜管
家基因 mtd 以其种类高度保守性一直受到此类研究
者的青睐［20］。因此，本研究特选择大豆 atp A 基因
和芹菜 mtd 基因作为研究对象，通过对反应条件优
化及方法参数评价等，建立能同时检测食品中大豆
和芹菜致敏原成分的实时荧光 PCR 方法，旨为食品
致敏原的标签监管、检测提供可靠的技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验样本 大豆、芹菜及各种动、植物样本
购自合肥市农贸市场。
1.1.2 主要试剂和仪器 Taq DNA 聚合酶、dNTP、
10×PCR 缓冲液购自 TaKaRa 生物工程公司，DNA
提取试剂盒购自基因科技（上海）有限公司（Cat
No ：526-050）。实时荧光 PCR 仪为 ABI 公司 7500
系列产品。
1.1.3 引物与探针序列 根据 GenBank 中公布的大
豆 atp A 基因（atp A，GenBank No. Z14031）和芹菜
mtd（mtd，GenBank No. AF067082） 基 因 序 列， 运
用 ABI Primer Express 软件，设计引物和探针序列（表
1），引物和探针由上海生工生物工程公司合成。待
测片段长度，如图 1 所示。
表 1 引物和探针序列
名称 序列
大豆 5 引物 GATTCCCGAACTTGACCTCC
大豆 3 引物 GAGTCGAGGATTCGCTCGTT
大豆探针 FAM-AGCAGAGCTCGCTGTTCGATTGAGGGCG-
TAMARA
芹菜 5 引物 TTGATCCACCGACTTACAGCCT
芹菜 3 引物 ATAAAAACAGATAACGCTGACTCATC
芹菜探针 HEX-ATTACATGCTGAGTCACGATGAGCGTGTA-
CTGTAMRA
1.2 方法
1.2.1 样品 DNA 的提取 采用 DNA 提取试剂盒（离
心柱型）进行，提取方法详见试剂盒使用说明书。
1.2.2 实时荧光 PCR 反应条件的建立 通过普通
PCR 方法，优化大豆 atp A 基因和芹菜 mtd 基因两
个单重 PCR 反应的退火温度。在此基础上建立单重
实时荧光 PCR 方法，反应体系 ：10×Taq Buffer（含
Mg2+）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，正、反
向引物（10 μmol/L）各 1 μL，探针（5 μmol/L）1 μL，
Taq 酶（5 U/μL）1.25 U， 模 板 DNA（1-100 ng/μL）
2.5 μL，补水至 50 μL。PCR 反应条件 ：37℃ 5 min ；
95℃预变性 5 min，95℃变性 15 s，适宜的退火温度
退火延伸 50 s，同时收集荧光，进行 40 个循环。
在上述反应体系基础上采用等量模板，引物与
探针两两组合（浓度同上），建立能同时扩增大豆和
芹菜成分的双重实时荧光 PCR 反应体系。以 Ct 值、
荧光增量为考察依据，优化 dNTP、Taq 酶在双重体
系中的最适浓度，其中 dNTP 的用量采用 4 μL、5
μL 和 6 μL 进行试验，Taq 酶的用量采用 1.25 U、2.5
U 和 5 U 进行试验，每次只改变一个变量。
1.2.3 大 豆 atp A 基 因 和 芹 菜 mtd 基 因 特 异 性 检
测 选取大豆、芹菜、大米、小麦、大麦、花生、芝麻、
玉米、马铃薯、蕃茄、核桃、开心果、腰果、葵花籽、
杏仁、苹果、梨和草莓等植物类样本和猪肉、牛肉、
2016,32(1) 71汪永信等：实时荧光 PCR法同时检测食物中大豆和芹菜致敏原成分
羊肉和鱼肉等动物类样本的基因组 DNA 作为 PCR
反应的模板，以去离子水作为阴性对照模板，进行
实时荧光 PCR 扩增。
1.2.4 大 豆 atp A 基 因 和 芹 菜 mtd 基 因 灵 敏 度 检
测 提取大豆、芹菜、大米基因组 DNA 后将浓度调
整为 100 ng/μL，然后将 1 μL 大豆 DNA、1 μL 芹菜
DNA 与 8 μL 大米 DNA 混合得到 10% 的大豆和 10%
芹菜 DNA 混和样本。用 TE 将 10% 的大豆和芹菜
DNA 混和样本进行 10 倍系列稀释从而获得同体积
条件下绝对含量相当于 1%、0.1%、0.01% 和 0.001%
的大豆或芹菜 DNA 样本，作为 PCR 反应的模板，
以去离子水作为阴性对照模板。
1.2.5 模拟实物样品检测 本研究采取摸拟实物样
本，以盲样的方式进行试验。按照大豆、芹菜制品
加工配方，制备含有大豆或芹菜的样本 4 组，每组
4 个平行，样本配方如表 2 所示。
表 2 摸拟实物样本配方
名称 配方
样本 1 5% 大豆、5% 芹菜、90% 小麦粉
样本 2 5% 大豆、95% 小麦粉
样本 3 5% 芹菜、95% 小麦粉
样本 4 100% 小麦粉
2 结果
2.1 实时荧光PCR反应体系的优化与建立
为了获得满意的退火温度，通过普通 PCR 方法，
发现大豆 atp A 基因在 60℃、58℃、芹菜 mtd 基因
在 62℃、60℃时均能有效扩增，所以选择 60℃为两
个单重反应适宜的退火温度。在此基础上，按 1.2.2
的反应体系和反应条件进行实时荧光 PCR 扩增，分
别收集 FAM 荧光和 HEX 荧光，两个单重反应都能
出现稳定的扩增曲线。
同时经优化筛选，在等量模板，两对引物和探
针浓度均一致的前提下，dNTP 的用量为 5 μL、Taq
酶的用量为 2.5 U 时，双重体系中的每个基因均能
稳定扩增，且 FAM 荧光增量和 HEX 荧光增量相接
近。其中阳性样本以大豆和芹菜基因组 DNA 作为模
板，阴性对照以去离子水作为模板，PCR 扩增结果
见图 2。
A: atpA
B: mtd
2281
2341
2401
2581
2641
2701
2761
A ：大豆 atpA 基因扩增片段（113 bp）；B ：芹菜 mtd 基因扩增片段（150 bp）
图 1 大豆（A）和芹菜（B）基因扩增片段
Cycle Number
1，2 ：阳性样本（大豆 FAM、芹菜 HEX）；3，4 ：阴性对照（去离子水）
图 2 大豆和芹菜致敏原成分实时荧光 PCR 扩增曲线
2.2 方法特异性研究评价
为了获得待选序列的特异性情况，按 1.2.3 进
行特异性实验，结果表明，仅大豆 atp A 基因和芹
菜 mtd 基因的 DNA 作为模板的阳性对照品能收集到
明显的荧光扩增曲线，而其余 20 种常见动植物种类
样本的 DNA 及去离子水作为模板时，FAM 和 HEX
荧 光 扩 增 均 为 阴 性（Ct>40）。 扩 增 结 果 如 图 3 所
示。因此本研究选择的引物和探针序列特异性符合
要求。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.172
2.3 方法灵敏度研究评价
为了获得方法的最低检出限，按 1.2.4 进行灵敏
度实验，结果表明，以含 10%、绝对含量相当于 1%、
0.1% 和 0.01% 的 大 豆 atp A 基 因 和 芹 菜 mtd 基 因
DNA 样本作为模板时，能收集到明显的 FAM 荧光
和 HEX 荧光扩增曲线，而以绝对含量相当于 0.001%
的大豆和芹菜的 DNA 样本和去离子水作为模板时，
FAM 荧光和 HEX 荧光扩增为阴性（图 4）。因此本
方法的最低检出限达 0.01%。
行均检出大豆成分，样本 3 四个平行均检出芹菜成
分，样本 4 四个平行均未检出大豆或芹菜成分，检
测结果与实际情况完全吻合。
3 讨论
传统的依赖于蛋白质的食品致敏原免疫学检测
方法，因食物在生产加工过程中蛋白质易变性和降
解而导致假阴性结果，使得依赖于核酸的检测方法，
尤其是 PCR 法已成为当前食品安全检测机构的主流
检测方法［13］。本研究运用双重实时荧光 PCR 技术，
首次将大豆和芹菜两种食品致敏原成分在同一个体
系中实现同时检测。方法主要从靶基因的选择，双
重体系的优化等方面着手，选择大豆 atp A 基因和
芹菜 mtd 基因作为靶基因，设计两对具有相近的 Tm
值和熔解温度的引物，扩增片段长度分别为 113 bp
和 150 bp ；同时对双重体系中 dNTP、Taq 酶浓度进
行了优化，最终确定 dNTP 的用量为 5 μL、Taq 酶的
用量为 2.5 U 时在双重体系中两个反应都能达到较
好的效果。后续研究表明建立的方法行之有效。
当然每种方法都有各自的优越性，在致敏原检
测领域，一些新技术新方法的应用，也是对 PCR 等
常规检测方法的丰富和发展。如以核酸为研究对象，
Mustorp 等［21］应用多重连接探针扩增技术（MLPA），
一次性从食品样本中检测出花生、芝麻等多种致敏
原成分，该技术结合了 DNA 探针杂交和 PCR 技术，
反应的通量更大，特异性更强。刘昊等［22］应用环
介导等温扩增技术（LAMP）建立了一种食品中开
心果致敏原的快速检测方法，操作简便，不需要通
过昂贵的仪器用肉眼就能观察到反应结果。当然因
这些方法对样本的纯度要求高，操作不慎易受污染
等因素目前还没有得到广泛应用。同时以核酸为研
究对象的检测方法如 PCR 等无法检测到过敏蛋白，
某些食品生产加工程序可能导致蛋白和 DNA 分离，
因此检测结果不能与食物的真正致敏性相关，使得
这类检测方法也有一定的局限性。Cucu 等［23］利用
质谱的方法快速检测并筛选胰蛋白酶酶解的大豆片
段的稳定性，研究说明来自大豆球蛋白的 G1
401Val-
Arg410 和 β- 伴大豆球蛋白 α 链 518Gln-Arg528 最稳定，
这些多肽可用来作为研发大豆过敏原检测方法的靶
肽。表明以致敏蛋白为研究对象的质谱方法在未来
Cycle Number
1，2 ：大豆、芹菜（FAM、HEX）；3，44 ：大米、小麦、大麦、花生、芝麻、
玉米、马铃薯、蕃茄、核桃、开心果、腰果、葵花籽、杏仁、苹果、梨、草莓、
猪肉、牛肉、羊肉、鱼肉和阴性对照（FAM、HEX 荧光）
图 3 方法特异性研究扩增曲线
Cycle Number
1 ：10% 大豆和芹菜（FAM、HEX）；2 ：1% 大豆和芹菜（FAM、HEX）；3 ：
0.1% 大豆和芹菜（FAM、HEX）；4 ：0.01% 大豆和芹菜（FAM、HEX）；5 ：
0.001% 大豆和芹菜（FAM、HEX）；6 ：阴性对照（FAM、HEX）
图 4 方法灵敏度研究扩增曲线
2.4 实际样品检测情况
为了对方法的实际结果进行评价，采取摸拟实
物样本，以盲样的方式进行试验。结果表明，样本
1 四个平行均检出大豆和芹菜成分，样本 2 四个平
2016,32(1) 73汪永信等：实时荧光 PCR法同时检测食物中大豆和芹菜致敏原成分
致敏原检测领域将有很大的发展空间，它能弥补单
纯依赖核酸检测方法的局限性和不足。
4 结论
本研究基于双重实时荧光 PCR 技术，根据大豆
atp A 基因和芹菜 mtd 基因设计特异性引物，利用不
同荧光素标记的 TaqMan 探针，建立了一种实时荧
光 PCR 检测方法，可同时检测食物中大豆和芹菜致
敏原成分。并对方法的特异性和灵敏度等参数进行
评价，测试结果表明方法特异好，灵敏度高，对大
豆和芹菜成分的检出限均达 0.01%。同时应用本方
法对摸拟实物样本进行试验，检测结果与实际情况
完全吻合。因此本方法可以作为同时检测食品中大
豆和芹菜致敏原成分的高效检测方法。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）