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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
Yeung 等［1］于 1999 年首次用 DNA 分子杂交高
通量筛选的方法，发现了一个新的 EGF 重复域超家
族成员，并将其命名为表皮生长因子样结构域蛋白
6（EGF-like-domain，multiple 6，EGFL6）。Buchner
收稿日期 ：2013-05-27
基金项目 ：国家“863”项目（2009AA02Z112），中央高校基本科研业务费专项资金项目（21612112）
作者简介 ：亢中奎，男，硕士研究生，研究方向 ：分子免疫学 ；E-mail ：kangzhongkui@126.com
通讯作者 ：邓宁，男，博士，教授，研究方向 ：基因工程抗体，抗体药物研发及肿瘤多肽疫苗 ；E-mail ：tdengn@jnu.edu.cn
重组人 EGFL6 在 HEK293 细胞中的瞬时表达
亢中奎  张晋霞  姜浩武  王宏  宋其芳  黄建芳  邓宁
（广东省分子免疫与抗体工程重点实验室 暨南大学抗体工程研究中心，广州 510632）
摘 要 ： 旨在通过构建 EGFL6 的真核表达载体，在 HEK293T 细胞中进行表达，并利用 HEK293T 细胞表达的 EGFL6 条件
培养基，探讨 EGFL6 对人黑色素瘤 A375 细胞和人卵巢癌 SKOV3 细胞增殖的影响。利用 PCR 方法亚克隆得到的 EGFL6 基因片
段及 EGFP 基因片段，用重叠 PCR 方法构建成 EGFP-EGFL6 融合基因片段，并分别将测序正确的 EGFP-EGFL6 融合基因片段及
EGFP 基因片段构建到真核表达载体 pAAV 中。表达载体质粒去内毒素纯化后，瞬时转染 HEK293T 细胞进行表达，荧光定位分析
和 Western blot 检测 EGFL6 的表达。CCK-8 试验分析含 EGFP-EGFL6 融合蛋白的 HEK293T 条件培养基对 A375 细胞和 SKOV3 细
胞的增殖能力的影响。结果显示，酶切鉴定 pAAV-EGFP-EGFL6 和 pAAV-EGFP 两个重组表达载体均构建成功 ；EGFP 荧光定位及
Western blot 结果均显示 EGFP-EGFL6 在 HEK293T 细胞中成功表达 ；增殖抑制试验结果显示 EGFL6 促进了 A375 和 SKOV3 细胞的
增殖，对肿瘤细胞的促增殖率分别达到（37.79±14.05）% 和（30.53±6.31）%。成功地将 EGFP 应用于 EGFL6 真核表达载体的构
建与表达，结果表明人 EGFL6 促进了 A375 和 SKOV3 细胞的增殖。
关键词 ： EGFL6 瞬时表达 HEK293T 肿瘤细胞
Transient Expression of Human EGFL6 in HEK293 Cells
Kang Zhongkui Zhang Jinxia Jiang Haowu Wang Hong Song Qifang Huang Jianfang Deng Ning
（Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632）
Abstract:  To construct eukaryotic expression vector of EGFL6 and transient transform HEK293T cell to investigate EGFL6 effects on
tumor cells with EGFL6 conditioned medium. EGFL6 gene fragments and enhanced green fluorescence protein（EGFP）gene fragments were
sub-cloned by PCR and combined to construct EGFP-EGFL6 fusion protein gene fragment by overlapping PCR. The sequencing identified
EGFP gene fragments and EGFP-EGFL6 gene fragments were inserted to eukaryotic expression vector pAAV to construct the expression
vectors. Purified by endotoxin-free kit, the expression vector plasmids were transiently transformed into HEK293T cells. The expression of
EGFL6 fusion protein was identified by fluorescence localization and Westernblot analysis. The effects of EGFL6 on tumor cell proliferation
of A375 and SKOV3 were assayed by CCK-8 reagent using EGFL6 expression conditioned medium. The restriction enzyme assay showed
that the expression vectors of pAAV-EGFP and pAAV-EGFP-EGFL6 were constructed successfully. EGFP fluorescence localization and
western blot assay results showed that EGFP-EGFL6 fusion protein was expressed successfully in HEK293T cells. The cell proliferation assay
showed that EGFL6 enhanced tumor cell proliferation of A375 and SKOV3 and the cell proliferation rates reached about（37.79±14.05）%
and（30.53±6.31）%. EGFL6 was expressed in HEK293T cells and the EGFL6 expression conditioned medium could promote tumor cell
proliferation.
Key words:  EGFL6 Transient expression HEK293T Tumor cell
等［2］也发现了这个蛋白，命名为 MAEG（MAM- and
EGF-containing gene），定位于 Xp22 染色体上。后续
的研究表明，它们分别属于同一基因的 2 个转录剪
接体，分别编码 553 和 554 个氨基酸，故 MAEG 也
2013年第9期 171亢中奎等 ：重组人 EGFL6 在 HEK293 细胞中的瞬时表达
就是 EGFL6［1，2］。EGFL6 蛋白含有 1 个胞外基质蛋
白结构域，1 个 N 末端信号肽，5 个 EGF 重复结构域，
1 个整合素结合结构域（RGD），1 个 C 末端 MAM
结构域。EGFL6 同时含有 2 个 N 连接的糖基化位点，
1 个潜在的酪氨酸磷酸化位点［1，2］。
已有的文献表明，EGFL6 表达于早期发育的脂
肪组织［3］，是 X 染色体隐性遗传病生长激素缺乏症
的候选基因［4］，并且在乳腺癌、肺癌、脑脊膜瘤、
黑色素瘤和卵巢癌肿瘤组织中高表达［5，6］。EGFL6
可由脂肪细胞分泌并促进邻近血管内皮细胞的增
殖［7］，可由成骨样细胞分泌通过 ERK 信号通路促进
内皮细胞迁移和血管生成［8］，还是一种作为卵巢癌
生物学标志的肿瘤血管蛋白［5］，所以它可能会成为
治疗毛发疾病、肥胖、骨疾病及癌症等疾病的新靶点，
具有广阔的研究前景。自 1999 年发现以来，关于
EGFL6 的研究报道不多，对其结构与功能的认识还
不充分，有待人们进一步去研究发现。为了进一步
开展 EGFL6 的相关研究，本研究分别构建了 EGFL6
的表达载体 pAAV-EGFP-EGFL6 及 pAAV-EGFP，并
实现其在 293T 细胞中的瞬时表达，初步探讨其对
人 黑 色 素 瘤 A375 细 胞（human melanoma A375 cell
line）和人卵巢癌 SKOV3（human ovarian cancer cell
line）的影响，旨在为进一步研究 EGFL6 与肿瘤的
关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株、 细 胞 和 载 体 E. coli 菌 株 DH5α，
HEK293T 细 胞、A375、SKOV3 细 胞 株，pEGFP-N1
载体和表达载体 pAAV 均为本室保存，克隆载体
pMD18-T simple Vector 购自 TaKaRa 公司。
1.1.2 主要试剂 Blend Taq-plus DNA 聚合酶购自
TOYOBO 公 司，DNA Marker、T4 DNA Ligase、 限
制性内切酶购自 TaKaRa 公司，质粒提取试剂盒、
DNA 凝胶回收试剂盒购自 Axygen 公司，去内毒素
质粒抽提试剂盒购自 Omega 公司，Fugene HD 转染
试剂购自 Roche 公司，DMEM、胎牛血清 FBS、opti-
MEM Ⅰ低血清培养基、无血清培养基（FreeStyle 293
Expression Medium，GIBCO） 购 自 Invitrogen 公 司，
CCK-8 试剂盒购自日本株式会社，抗 EGFL6 兔多克
隆抗体（anti-EGFL6 antibody）、氯喹和丙戊酸购自
Sigma 公司，羊抗兔多克隆抗体购自广州鼎国生物技
术公司，动物细胞裂解液购自碧云天生物科技有限
公司。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计及基因的克隆 PCR 引物序列见
表 1。在 Primer1 中含 Not Ⅰ酶切位点和真核表达
所需的 kozak 序列，Primer2 和 3 中含组氨酸标签序
列，Primer4 和 5 中含肠激酶切位点序列，Primer6
和 7 中含 Hind Ⅲ酶切位点，以上引物全部由上海生
工合成。以 Plexm 载体为模板，采用 Primer1 和 2 扩
增分泌信号肽序列（signal peptide sequence，S）；以
pEGFP-N1 载体为模板，采用 Primer3 和 4 扩增增强
型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，
EGFP）基因 ；以前期实验室构建的 EGFL6 载体为
模板，采用 Primer 5 和 6 扩增 EGFL6 基因。
表 1 PCR 引物序列
引物名称 引物序列（5-3） 酶切位点
Primer 1 GCGGCCGCCACCATGGGGA-
TCCTTCCC
Not I
Primer 2 ATGATGATGATGATGGTGA-
GCTACGCAACCCATCAG
His-tag
Primer 3 CACCATCATCATCATCATG-
TGAGCAAGGGCGAGGAG
His-tag
Primer 4 CTTGTCGTCGTCGTCCTTGT-
ACAGCTCGTCCATGCC
肠激酶酶切位点
Primer 5 CAAGGACGACGACGACAAG-
CCTCTGCCCTGGAGCCTTGC
肠激酶酶切位点
Primer 6 AAGCTTATCAGTCATCCAC-
AGATAAAAGGC
Hind III
Primer 7 AAGCTTATTACTTGTACAG-
CTCGTCC
Hind III
Primer 1-6 用 于 pAAV-EGFP-EGFL6 载 体 ；Primer1，2，3，7 用 于 pAAV-
EG-FP 载体
1.2.2 pMD18-T 载体克隆与测序 PCR 产物经回收
后，再用重叠 PCR 的方法分别连接成 S-EGFP-EGFL6
和 S-EGFP 片 段， 然 后 分 别 将 S-EGFP-EGFL6 和
S-EGFP 片段与 pMD18-T 载体在 T4 DNA 连接酶作
用下于 16℃连接。将连接产物转化感受态菌 DH5α，
菌液涂布于含 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 平皿上筛
选，挑取单克隆，按照质粒抽提试剂盒说明书小量
提取质粒，经 Not Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切鉴定，将获得
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期172
的阳性克隆质粒（命名为 pMD-18T-S-EGFP-EGFL6
和 pMD-18T-S-EGFP，分别简写为 pME 和 pMG）送
上海英骏公司测序。用 NCBI 在线工具 Blast 对所克
隆 S-EGFP-EGFL6 和 S-EGFP 基 因 序 列 与 GenBank
中的序列进行同源性比较分析。
1.2.3 真核表达载体的构建及鉴定 将载体质粒
pAAV 和测序正确的质粒 pME 及 pMG 分别用内切
酶 Not Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回
收 载 体 质 粒 pAAV、S-EGFP-EGFL6 及 S-EGFP 片
段，T4 DNA 连接酶连接过夜，连接产物转化大肠杆
菌 DH5α，经 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 平皿培养
筛选克隆、提取质粒后，用 Not Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切
鉴定及 PCR 鉴定。鉴定正确的菌株于 37℃扩增摇
菌 100 mL，用 OMEGA 去内毒素质粒提取试剂盒提
取重组表达载体质粒 pAAV-EGFP-EGFL6 及 pAAV-
EGFP，测定其核酸浓度，备用。
1.2.4 重组真核表达载体导入 HEK293T 细胞 接
种 4×105 个 / 孔 的 HEK293T 细 胞 到 6 孔 板 中， 在
含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基（即完全
培养基）中培养，于 37℃、5% CO2 培养约 24 h 至
80% 汇合度 ；转染前将培养基换为含有 100 μmol/L
氯喹的 2 mL DMEM 基本培养基，取去内毒素纯化
的表达载体质粒 2 μg，加入到 100 μL opti-MEM Ⅰ低
血清培养基中，混匀后加入 8 μL 的转染试剂 Fugene
HD，涡旋混匀后低速离心，室温静置 20 min，然后
逐滴加入到 6 孔板中，轻轻混匀后 37℃培养 6 h ；
DMEM 基本培养基洗涤细胞两次后，加入含有 4
mmol/L 丙戊酸的完全培养基，37℃、5% CO2 培养，
48 h 后在荧光显微镜下观察转染情况，并用 photos-
hop CS4 图形叠加并结合细胞计数估测转染效率。
1.2.5 Western blot 检 测 EGFP-EGFL6 融 合 蛋 白 的
表达 转染 HEK293T 60 h 后，收集细胞上清，用
预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次。按照细胞经裂解液说明
书的方法裂解处理细胞后，同时将细胞上清和细胞
裂解上清与上样缓冲液混匀，进行 SDS-PAGE，转
PVDF 膜，5% 脱脂奶粉、37℃封闭 1 h ；一抗（兔
抗 EGFL6 多克隆抗体，1∶1 000）4℃过夜，PBST
洗涤 ；二抗（羊抗兔多克隆抗体，1∶4 000）37℃
孵育 1 h，PBST 洗涤，用化学发光法显色。
1.2.6 无血清条件培养基的准备 分别用 pAAV-
EGFP 质粒、pAAV-EGFP-EGFL6 质粒转染 HEK293T
细胞（转染步骤同 1.2.4），转染后用 GBICO 无血清
培养基培养，24 h 后收集上清，荧光和 Western blot
鉴定 EGFL6 的表达，上清经离心去除细胞碎片后，
0.22 μm 滤膜过滤，-80℃保存［8，9］。
1.2.7 肿瘤细胞的增殖抑制试验 以 pAAV-EGFP
质粒转染 HEK293T 细胞产生的条件培养基为对照
组（Control） 条 件 培 养 基， 以 pAAV-EGFP-EGFL6
质粒转染 HEK293T 细胞产生的条件培养基为试验
组（EGFL6）条件培养基。用 DMEM 完全培养基、
RPMI1640 完全培养基分别复苏的人黑色素瘤 A375
细胞和人卵巢癌 SKOV3 细胞，细胞经传代至 3 代时，
分别以 4 000 个 / 孔、3 000 个 / 孔的数量铺于 96 孔
板中，每孔 100 生长 24 h，用相应的基本培养基清
洗 2 次，换上相应的基本培养基，饥饿 6 h，然后换
上倍比稀释的条件培养基（条件培养基浓度分别为
100%、50%、25% 和 12.5%）培养 48 h，然后吸去
培养基，加入 100 μL 的 CCK-8 与无血清培养基混合
物（比例为 1∶10），将培养板在 37℃、5% CO2 的
恒温培养箱中孵育 1 h，用酶标仪测 450 nm 处 OD 值，
以比较试验组（EGFL6）与对照组（Control）细胞
生长活性［10］。
增 殖 抑 制 率（%）=［OD450（EGFL6）-OD450
（Control）］/OD450（Control）×100%，OD450（Control）
为对照组的平均 OD450 值。
1.2.8 统计学处理 增殖抑制试验重复 3 次，试验
数据以平均数 ± 标准差（x
-
±s）表示［11］，多组间
比较用单因素 ANOVA 分析，P<0.05 表示差异有统
计学意义，统计分析采用 PASW Statistics 18 软件。
2 结果
2.1 基因的克隆及测序
PCR 亚克隆得到了信号肽序列 S、EGFP 片段
（图 1）和 EGFL6 片段（图 2），通过重叠 PCR 获得
了 S-EGFP 片段（图 2）和 S-EGFP-EGFL6 融合蛋白
的 DNA 片段（图 3），分别成功地将 S-EGFP-EGFL6
和 S-EGFP 连接到 pMD18-T 克隆载体上构建成了克
隆载体 pTE 及 pTG。所得扩增片段测序正确。
2.2 真核表达载体的构建
pAAV、pTE 及 pTG 载体分别经过双酶切，胶
2013年第9期 173亢中奎等 ：重组人 EGFL6 在 HEK293 细胞中的瞬时表达
回收，连接，转化 DH5α 感受态细菌构建的重组质
粒再经 Not Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切、PCR 鉴定及 1% 琼
脂糖凝胶电泳，获得大小分别为 2 509 bp 和 843 bp
片段，与预期的 S-EGFP-EGFL6 和 S-EGFP 片段大
小相符（图 4），表明两个真核表达载体均构建成
功，鉴定正确的质粒命名为 pAAV-EGFP-EGFL6 及
pAAV-EGFP。
2.3 EGFP-EGFL6蛋白在HEK293T细胞中的表达
用去内毒素质粒抽提试剂盒提取转染级质粒，
将质粒转染入 HEK293T 细胞，48 h 后在荧光显微
镜下观察 EGFP 的表达情况。结果（图 5）显示，
pAAV-EGFP 质 粒 和 pAAV-EGFP-EGFL6 质 粒 均 成
功转染入 HEK293T 细胞（图 5-B 和图 5-E），由图
形叠加并结合细胞计数可知转染效率 50% 左右（图
5-C 和图 5-F）。
将 pAAV-EGFP 空 载 体 及 pAAV-EGFP-EGFL6
1 ：信号肽 S 的 PCR 扩增 ；2，3 ：EGFP 的 PCR 扩增 ；
M ：TaKaRa DL2000 marker
图 1 信号肽 S、EGFP 的 PCR 扩增
A：白光的 293T 细胞（pAAV-EGFP）；B：荧光下的 293T 细胞（pAAV-EGFP）；
C ：A 和 B 的叠加图 ；D ：白光下的 293T 细胞（pAAV-EGFP-EGFL6）；E ：
荧光下的 293T 细胞（pAAV-EGFP-EGFL6）；F ：D 和 E 的叠加图
图 5 转染的 293T 细胞的绿色荧光蛋白鉴定（100×）
M ：TaKaRa DL2000 marker ；1 ：S-EGFP 的重叠 PCR 扩增 ；
2 ：EGFL6 的 PCR 扩增
图 2 S-EGFP 的重叠 PCR 扩增和 EGFL6 的 PCR 扩增
M ：TaKaRa 1 kb ladder ；1 ：S-EGFP-EGFL6 重叠 PCR 产物
图 3 S-EGFP-EGFL6 重叠 PCR
M1 ：1 kb DNA ladder ；1 ：pAAV-EGFP 质粒双酶切 ；M2 ：TaKaRa 1kb ladder ；
2 ：pAAV-EGFP-EGFL6 质粒 ；3 ：pAAV-EGFP-EGFL6 质粒双酶切 ；4 ：pA-
AV-EGFP-EGFL6 质粒 PCR 产物 ；5 ：signal-EGFP-EGFL6 片段 PCR 产物 ；6 ：
signal-EGFP-EGFL6 片段
图 4 EGFL6 重组质粒的酶切鉴定和 PCR 鉴定
2000
bp
1 2 3 M
1000
750
500
250
100
1 2M
2000
bp
1000
750
500
250
100
2000
3000
bp
1000
M 1
2000
3000
bp
1500
500
M1 1
2000
3000
bp
1000
M2 2 3 4 5 6
A B
C D
E F
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期174
重组质粒转染 HEK293T 细胞，60 h 后，收集细胞
上清和细胞，细胞经裂解液裂解处理后，用上清和
细 胞 裂 解 上 清 进 行 SDS-PAGE。 用 抗 EGFL6 抗 体
进行 Western blot 检测，同时以未转染的 HEK293T
细 胞 和 转 染 了 pAAV-EGFP 空 载 体 的 HEK293T 细
胞为阴性对照。由图 6 可见，转染了质粒 pAAV-
EGFP-EGFL6 的 HEK293T 细胞表达了相对分子质量
约为 92 kD 的 EGFP-EGFL6 蛋白，且细胞培养上清
中和细胞内都有 EGFP-EGFL6 的表达（图 6 泳道 5
和 6），而未转染的 HEK293T 细胞和转染了 pAAV-
EGFP 空载体的 HEK293T 细胞的两个阴性对照组与
抗 EGFL6 抗体反应后均未见到相应的条带（图 6 泳
道 1-4）。
P<0.05（图 7-B），同时，在条件培养基为 50% 和
25% 浓度下，试验组（EGFL6）与对照组（Control）
有极显著性差异，P<0.01（图 7-B）。
1 ：HEK293T 细胞上清 ；2 ：HEK293T 细胞裂解上清 ；3 ：HEK293T
细胞上清（pAAV-EGFP）；4：HEK293T 细胞裂解上清（pAAV-EGFP）；
5 ：HEK293T 细胞上清（pAAV-EGFP-EGFL6）；6 ：HEK293T 细胞裂
解上清（pAAV-EGFP-EGFL6）
图 6 EGFP-EGFL6 蛋白的 Western blot 鉴定
A ：用不同浓度的条件培养基处理 A375 细胞 ；B ：用不同浓度的
条件培养基处理 SKOV3 细胞，* ：P<0.05，** ：P<0.01
图 7 EGFL6 条件培养基促进肿瘤细胞的增殖
92
kD
1 2 3 4 5 6
2.4 EGFL6条件培养基促进肿瘤细胞的增殖
增殖抑制试验结果显示，与对照组（Control，
即加入 pAAV-EGFP 质粒转染 HEK293T 细胞产生的
条件培养基的组）相比，试验组（EGFL6，即加入
pAAV-EGFP-EGFL6 质粒转染 HEK293T 细胞产生的
条件培养基的组）显著地促进了 A375 和 SKOV3 细
胞的增殖。当条件培养基浓度分别为 100%、50%、
25% 和 12.5% 时， 试 验 组（EGFL6） 对 A375 细 胞
的相对促增殖率分别为（9.96±5.30）%、（30.62±
13.17）%、（37.79±14.05）% 和（16.02±11.05）%。
并且在条件培养基浓度为 50% 和 25% 时，相对于
对照组（Control），试验组（EGFL6）显著地促进了
A375 细胞的增殖，P<0.05（图 7-A）。
当条件培养基浓度分别为 100%、50%、25% 和
12.5% 时，试验组（EGFL6）对 SKOV3 细胞的相对
促增殖率分别为（20.92±6.73）%、（16.06±5.51）%、
（30.53±6.31）% 和（18.40±5.79）%。并且在 4 个
条件培养基浓度下，相对于对照组（Control），试验
组（EGFL6）都显著地促进了 SKOV3 细胞的增殖，
1.4 Control
EGFL6
*
*1.2
1.0
0.8O
D
45
0
0.6
0.4
0.2
100
ᶑԦษޫส⎃ᓖ%
50 25 12.5
0
A
*
**
** *
1.4
1.6
1.8B Control
EGFL6
1.2
1.0
0.8
O
D
45
0
0.6
0.4
0.2
100
ᶑԦษޫส⎃ᓖ%
50 25 12.5
0
3 讨论
在真核表达 EGFL6 的前期研究中，Oberauer 等［7］
用昆虫杆状病毒表达系统来表达 C 端含 6×His-tag
的 EGFL6。Chim 等［8］ 为 证 明 EGFL6 为 同 源 二 聚
体蛋白，构建了真核表达载体 phCMV-EGFL6-HA
和 pcDNA3.1B-EGFL6-c-myc。 为 了 更 直 观 地 进 行
EGFL6 表达的定位与追踪，我们在 EGFL6 的 N 端
加入了 EGFP 荧光标签，构建 EGFP 融合蛋白进行
荧光定位表达。
在瞬时转染试验中，首先提取了高质量的去内
毒素质粒，酶切分析和 PCR 鉴定验证了两个重组质
粒 pAAV-EGFP 和 pAAV-EGFP-EGFL6 的正确性，然
后转染 HEK293T 细胞，用荧光和 Western blot 试验
分析了 EGFL6 的表达。在荧光试验分析中，我们将
含 EGFP 基因的两个重组质粒转染入 HEK293T 表达
后，通过在荧光显微镜下观察 EGFP、EGFP-EGFL6
2013年第9期 175亢中奎等 ：重组人 EGFL6 在 HEK293 细胞中的瞬时表达
蛋白的表达情况，并通过同一视野下白光和荧光的
图像叠加及细胞计数估测了转染效率，转染效率在
都在 50% 左右。在 Western blot 试验中，为了分析
EGFL6 在 HEK293T 细胞的表达情况，设置了两组
对照，一组是未转染的 HEK293T 细胞，另一组转染
了对照质粒（pAAV-EGFP）的 HEK293T 细胞，只
有转染了 pAAV-EGFP-EGFL6 质粒的 HEK293T 细胞
表达了约 92 kD 的 EGFP-EGFL6 融合蛋白，表明成
功地构建了 pAAV-EGFP-EGFL6 真核表达载体，并
在 HEK293T 细胞中实现了 EGFP-EGFL6 融合蛋白的
表达。
为 了 研 究 EGFL6 对 A375 和 SKOV3 的 增 殖 影
响，在制作条件培养基时，相同条件下用转染了质
粒 pAAV-EGFP 的 HEK293T 表达上清为对照用于后
续的试验。Chim 等［8］也是通过制作 COS-7 细胞的
EGFL6 条件培养基来研究 EGFL6 功能的，并得出了
EGFL6 能够显著地增强 SVEC 血管内皮细胞的转移
的结论。Ge 等［12］利用制备的含 U0126 的条件培养
基来研究了其对人 A375 黑色素瘤的侵袭作用。
因无血清条件培养基中还含有占总蛋白绝大多
数的 HEK293T 分泌性蛋白，没有一个试验方法可
以测出 EGFL6 的含量。只能采用稀释条件培养基的
方法来实现本试验内部的 EGFL6 相对定量。我们
分别将 EGFP 条件培养基和 EGFP-EGFL6 条件培养
基用无血清培养基按一定比例稀释，设置了 4 个梯
度，条件培养基浓度分别为 100%、50%、25% 和
12.5%。
在含 EGFL6 的条件培养基对 A375 的增殖抑制
试验中，50% 和 25% 条件培养基下，相对于 EGFP
对照组，EGFL6 试验组都显著促进了 A375 细胞的
增殖（P<0.05）。虽然，EGFL6 的完全条件培养基
也促进了 A375 的增殖，但差异性不显著。原因可
能是完全条件培养基已经培养了细胞 24 h，其营养
消耗过多，HEK293T 代谢物浓度太高，可能抑制了
EGFL6 发挥作用，从而也可能造成结果没有显著性
差异。当条件培养基比例为 12.5% 时，由于 EGFL6
浓度低而造成试验组与对照之间没有显著性差异。
在含 EGFL6 的条件培养基对 SKOV3 的增殖抑
制试验中，与 EGFP 对照组相比，每个条件培养基
稀释比例的 EGFL6 试验组都显著促进了 SKOV3 的
增殖（P<0.05），并且在 50% 和 25% 条件培养基时，
有极显著差异（P<0.01），我们推测其它两个组没有
极显著差异的原因与 A375 细胞类似。
在前人的研究中，人脂肪组织产生的 EGFL6
可促进脂肪来源的血管内皮细胞的增殖［7］，鼠的
EGFL6 可促进猪血管内皮细胞（SVEC）的迁移［8］。
而在本研究表达了人的 EGFL6，作用于肿瘤细胞株
A375 和 SKOV3 细 胞 时 发 现， 人 的 EGFL6 对 A375
和 SKOV3 细胞有显著的促进增殖作用。但人 EGFL6
对这两株肿瘤细胞株的增殖作用的机制如何，还有
待于进一步的验证和研究。后续的试验可通过划痕
修复试验和 Transwell［8］试验继续研究 EGFL6 条件
培养基对这两株肿瘤细胞的迁移作用，也可研究
EGFL6 条件培养基对肿瘤细胞内各信号通路蛋白的
影响来进一步揭示其对肿瘤细胞增殖作用的机制。
4 结论
成功构建了真核表达载体 pAAV-EGFP-EGFL6，
并将其转染入 HEK293T 细胞中，成功实现了 EGFP-
EGFL6 融合蛋白的瞬时表达。首次开展了人 EGFL6
对肿瘤细胞株 A375 和 SKOV3 的增殖试验，发现人
EGFL6 促进了 A375 和 SKOV3 的增殖。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）
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