全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
近年来，抗菌及抗肿瘤的核糖核酸酶作为多
功能分子引起了广泛的关注，这方面的研究相当活
跃，成为新药开发的热点［1-4］。来源于家鸡（Gallus
gallus）的两个 RNase A 超家族成员 RNase A-1 和 A-2
具有 81% 氨基酸序列一致性，等电点分别是 10.2 和
11.0，其中具有较高等电点的 RNase A-2 具有显著
的杀菌活性，而 RNase A-1 没有杀菌活性。进一步
收稿日期 ：2012-12-21
基金项目 ：北京联合大学 “启明星”大学生科技创新项目，北京联合大学校级科研项目（zk201008x）
作者简介 ：尹雪薇，女，研究方向 ：生物工程 ；E-mail ：120442478@qq.com
通讯作者 ：陶凤云，女，博士，副教授，研究方向 ：抗菌肽 ；E-mail ：taofengyun @126.com
中国林蛙核糖核酸酶 Rdrlec 的原核表达及
抗菌活性检测
尹雪薇  彭艳丽  冉帅  陶凤云
（北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023）
摘 要 : Rdrlec 是从中国林蛙基因组中克隆得到的核糖核酸酶新基因（GenBank 登录号 EU384704），其生物学活性仍未知。
为了探索其编码的蛋白产物的生物学活性，将此基因按照大肠杆菌偏好的密码子进行优化后，人工合成基因，通过 EcoR I 和 Hind
III 限制酶位点定向克隆到 pET-28a（+）中构建重组表达载体，转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中，在 34℃以 0.5 mmol/L IPTG 诱导
表达出包涵体形式的融合蛋白，通过包涵体复性、肠激酶切割、Ni-NTA 亲和层析纯化等步骤获得了具有酶活性的野生型 Rdrlec 重
组蛋白，并检测到其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌活性。
关键词 : 中国林蛙 核糖核酸酶 Rdrlec 原核表达 抗菌活性
Prokaryotic Expression and Antimicrobial Activity of a Novel
Ribonuclease Rdrlec from Rana dybowskii
Yin Xuewei Peng Yanli Ran Shuai Tao Fengyun
（Biochemical Engineering College of Beijing Union University，Beijing 100023）
Abstract:  Rdrlec is a novel RNase gene form Rana dybowskii （GenBank accession No.EU384704） and its biological function has not
been identified. In order to explore the biological activity of its encoded protein, the Rdrlec gene was adjusted according to Escherichia coli codon
bias without changing its amino acids. The synthetic gene was inserted to the pET-28a （+） expression vector through the EcoR I and Hind III
site, and the resulting recombination expression plasmid was named pET28-Rdrlec and transferred into Escherichia coli BL21 （DE3） strains.
After induced with 0.5 mmol/L IPTG at 34℃ for 6 h, the fusion protein was found expressed mainly in inclusion body form. After a series of
steps including refolding, enterokinase cutting and Ni-NTA affinity chromatographic purification, the wild type Rdrlec recombinant protein was
obtained, and it showed a single band on SDS-PAGE. It showed enzymatic activity to degrade RNA into nucleotides, which suggests that this
molecule has formed the correct spatial structure. The recombinant Rdrlec shows significant antibacterial activity against Escherichia coli and
Staphylococcus aureus.
Key words:  Rana dybowskii Ribonuclease Rdrlec Prokaryotic expression Antimicrobial activity
的研究发现，RNase A-2 中的两个结构域，Domain II
（TTRRHFRIT） 和 Domain III（RYSGNQFNRRVRV-
GCRG）对该分子的杀菌活性具有重要贡献，可以
不依赖于分子骨架而以单独肽段形式发挥杀菌活
性［5］。来源于鱼类的多个 RNase A 超家族成员都发
现具有杀菌活性［6，7］，大肠杆菌外膜蛋白酶 OmpT
可以特异性地裂解斑马鱼 ZF-RNase-3 分子中的 Arg-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期94
Arg 肽键，释放出 2 个肽段，其中的大片段（氨基
酸 31-124）是有效的杀菌剂［8］。中国林蛙核糖核酸
酶 Rdronc 分子中处于正选择压力下的带有正电荷的
氨基酸残基对于杀菌活性具有重要作用［2］。由于核
糖核酸酶 A（ribonuclease A，RNase A）超家族成员
数量众多，氨基酸序列变异很大，有假说认为该超
家族成员可能起源于宿主防御功能［6］，验证这一假
说需要来源于不同物种的多种 RNase A 超家族成员
具有杀菌活性的试验数据。
中国林蛙核糖核酸酶 Rdrlec 基因是本实验室从
中国林蛙基因组中 PCR 扩增得到的 495 bp 的核苷
酸片段，包含信号肽序列和完整的成熟蛋白编码区
序列。Blast 检索显示此序列与多条来源于蛙属的核
糖核酸酶同源，其中与来源于日本蛙的核糖核酸酶
Rjlec （protein ID ：P18839），具有最高的氨基酸序列
一致性（81%），我们将新基因命名为 Rdrlec，提交
到 GenBank （登录号 EU384704）。
为了进一步开发利用这一新的基因资源，探索
其编码的蛋白产物的生物学活性，我们将此基因按
照大肠杆菌偏好的密码子进行优化后，人工合成基
因，定向克隆到 pET-28a（+）构建重组表达载体，
在大肠杆菌 BL21（DE3）中诱导表达融合蛋白。通
过包涵体复性、肠激酶切割融合蛋白、Ni-NTA 亲和
层析纯化等步骤获得了野生型 Rdrlec 重组蛋白，并
检测其抗微生物活性，旨在为该分子的进一步开发
应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
表达载体 pET-28a （+）、大肠杆菌 DH5α、BL21
（DE3） 、药敏测试大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均由
北京联合大学生物化学工程学院生物工程实验室保
藏 ；Pfu DNA 聚合酶、DNA 片段纯化试剂盒均购自
北京赛百盛基因技术有限公司 ；T4 DNA 连接酶、限
制性内切酶 EcoR I 和 Hind III 等购自宝生物工程（大
连）有限公司 ；质粒提取试剂盒、琼脂糖胶回收试
剂盒、异丙基硫代 -β-D-半乳糖苷（IPTG）购自天
根生化科技（北京）有限公司 ；LB 培养基购自美国
BD 公司 ；Ni-NTA 介质购自 Qiagen ；重组肠激酶购
自 Novagen 公司。TritonX-100 购自 Sigma 公司 ；其
他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 Rdrlec 基 因 序 列 的 优 化、 合 成 与 PCR 扩 增
根据大肠杆菌密码子的偏好性及密码子的合理搭配
设计 Rdrlec 的基因序列，在基因的 N 端添加肠激
酶裂解位点，在 C 端添加连续 2 个终止密码子，在
上述序列的两端分别引入 EcoR I 和 Hind III 限制性
内切酶识别位点。设计的核苷酸序列由生工生物工
程（上海）有限公司合成，并克隆在 pUC57 质粒上，
命名为 pUC57-Rdrlec，保存在大肠杆菌 DH5α 中。
根据以上的序列设计两条特异性 PCR 扩增 Rdr-
lec 的引物 ：5-CCCGAATTCGACGATGATGACAAAC-
AG-3 和 5-GGCAAGCTTGTCATTAACAGCTACC-
G-3，下划线部分依次为 EcoR I 和 Hind III 限制性
内切酶位点，其两侧添加了保护性碱基以提高限制
酶切割效率。引物由北京赛百盛基因技术有限公司
合成。
以 pUC57-Rdrlec 为模板，PCR 扩增 Rdrlec 基因
片段，PCR 条件为 ：94℃ 预变性 5 min ；94℃ 30 s、
55℃ 30 s、72℃ 50 s，共进行 35 个循环 ；最后 72℃
延伸 10 min。将 PCR 产物进行 3. 0% 琼脂糖凝胶电泳，
用凝胶回收试剂盒回收目标基因片段。
1.2.2 重组原核表达载体的构建 将纯化回收的
PCR 产物和 pET-28a （+）载体均用 EcoR I 和 Hind III
双酶切，酶切产物电泳分离并切胶纯化后，使用 T4
DNA 连接酶在 16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆
菌 BL21（DE3）感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克
隆。提取质粒，分别用 EcoR I 单酶切重组表达载体，
及用 EcoR I 和 Hind III 双酶切重组表达载体，进行
酶切验证后，重组质粒命名为 pET28a-Rdrlec，送北
京三博远志生物技术有限公司进行测序验证。
1.2.3 重组融合蛋白的诱导表达 将测序正确的表
达质粒转化大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，获
得工程菌 BL21（DE3）/ pET28a-Rdrlec。挑单菌落
接种于 LB 培养液（50 μg/mL 卡那霉素），37℃振荡
培养过夜，按 10% 转接到含有卡那霉素的新鲜液
体培养基中，37℃振荡培养至 OD600 为 0.8 时，加
入 IPTG 使其终浓度为 0.5 mmol/L，降低培养温度至
34℃，诱导 6 h 后，8 000 r/min 离心 15 min 收集菌体，
2013年第5期 95尹雪薇等 ：中国林蛙核糖核酸酶 Rdrlec 的原核表达及抗菌活性检测
用 PBS 洗 3 次，取少量样品采用 SDS-PAGE （5% 分
离胶，15% 浓缩胶）检测重组蛋白表达情况。
1.2.4 重组融合蛋白的纯化 离心收集细胞，洗
涤去除培养基，将菌体重悬于裂解液（20 mmol/L
Tris·HCl （pH8.0），0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L
NaCl，0.5% Triton X-100）中，在冰浴条件下超声破
碎菌体（超声 5 s，间隔 5 s，50 次循环，功率 300 W），
接着 4℃、15 000 r/min 离心 30 min 收集包涵体。将
包涵体用洗涤液［1%（V/V）Triton X-100，1 mol/L
NaCl］充分洗涤后，溶于尿素变性缓冲液（8 mol/L
Urea，50 mmol/L Tris，pH7.5，25 mmol/L DTT） 中，
室温下溶解 2 h。离心除去沉淀，将蛋白浓度控制在
50 μg/mL，在复性缓冲液（含有 0.10 mol/L NaCl，3.0
mmol/L 还原型谷胱甘肽，0.6 mmol/L 氧化型谷胱甘
肽的 0.10 mol/L Tris-乙酸缓冲液，pH8.0）中 4℃复
性 40 h。
离心收集上清，用超滤管浓缩（截流相对分子
质量 3 kD）后，透析，进行 Ni-NTA 亲和层析，用
60 mmol/L 咪唑充分洗去杂蛋白后，用 500 mmol/L
咪唑洗脱目标融合蛋白。
1.2.5 肠激酶切割融合蛋白释放 Rdrlec 将纯化的
融合蛋白透析后，利用肠激酶进行酶切，以释放
Rdrlec。反应体系为 ：10×rEK Cleavage buffer 5 μL，
融合蛋白 50 μg，重组肠激酶 4 μL（1 U/μL），去离
子水补充至总体积 50 μL，25℃温浴酶切反应 24 h，
取样 SDS-PAGE 分析酶切效果。将酶切后的溶液上
样于 Ni-NTA 柱，载体序列由于带有 6×His 标签，
特异性吸附到层析介质上，而 Rdrlec 存在于穿过液
中。收集 Rdrlec 部分，透析并冻干浓缩后，再次进
行 Sephadex G75 层 析 纯 化 Rdrlec。 进 行 15% SDS-
PAGE 检测酶切和纯化效果。
1.2.6 Rdrlec 的酶活性 参考文献方法［2，9］，酶活
性的检测基于核糖核酸酶降解酵母总 RNA 的反应。
将纯化的酵母总 RNA 底物溶解在反应缓冲液（40
mmol/L 乙酸钠，pH6.0）中。反应总体积为 0.8 mL，
含有 0.8 mg RNA 底物。将重组 Rdrlec 加入到反应
体系中，37℃反应 4 h，然后添加 0.5 mL 冰冷的 20
mmol/L 硝酸镧和 3% 高氯酸终止反应。在室温下
13 000 r/min 离心除去未降解的 RNA，通过 OD260 值
检测溶解于上清液中的 RNA 降解产物的量，分别以
RNase A 和乙酸钠缓冲液作为酶活性检测的阳性对
照和阴性对照。
1.2.7 Rdrlec 的抗菌活性 将斜面保存的 Escherichia
coli 和 Staphylococcus auteus 分 别 进 行 LB 固 体 平 板
划线，挑取单菌落接种到 LB 液体培养基中，置于
37℃摇床中培养至指数生长期后，连续 10 倍稀释涂
平板进行菌落计数，调整菌液浓度为（1-5）×106
作为测试菌液。取不同浓度的重组蛋白用 10 mmol/L
pH7.4 的磷酸钠缓冲液连续 10 倍稀释后取 5 μL 加入
到 20 μL 菌悬液中，对照组加入等量的磷酸钠缓冲
液。37℃培养 4 h，使重组蛋白发挥杀菌作用。处理
后的菌悬液连续 10 倍稀释，涂 LB 琼脂平板，做 3
个重复，37℃过夜培养后计数菌落形成单位，计算
细菌存活数，并绘制曲线。
2 结果
2.1 Rdrlec基因的优化与PCR扩增
由于 Rdrlec 基因（GenBank EU384704）来源于
两栖动物蛙类含有大肠杆菌稀有密码子，会影响其
在大肠杆菌中的高效表达，首先使用稀有密码子计
算 器（Rare Codon Calculator，http ：//nihserver.mbi.
ucla.edu/RACC/）对 Rdrlec 成熟肽对应的基因序列进
行分析，发现序列中共有 10 个稀有密码子（5 个精
氨酸稀有密码子，3 个异亮氨酸稀有密码子和 2 个
脯氨酸稀有密码子），如图 1 中下划线所示。为了提
高重组蛋白的表达量，对该序列进行了优化，原则
是首先根据表达物种的密码子频率进行调整，以使
基因序列的密码子使用频率尽可能的与物种的最优
密码子频率一致，去掉了频率在 10% 以下的密码子；
然后尽可能降低序列中的碱基重复结构，使 RNA 二
级结构相对简单、稳定 ；同时使整个 DNA 序列的
G+C 含量尽可能接近 50%。优化后的序列与优化前
序列比对结果如图 1。
分别在优化后的 Rdrlec 基因的 N 端添加肠激
酶裂解位点 （DDDDK）及在 C 端添加连续 2 个终止
密码子 （TAATGA），可以使表达出的融合蛋白经过
肠激酶裂解后得到具有天然 N 末端和 C 末端的重组
蛋白 ；在上述序列的两端分别引入 EcoR I 和 Hind
III 限制性内切酶识别位点，可使该基因片段定向连
接到 pUC57 载体相应的多克隆位点处。以 pUC57-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期96
Rdrlec 为模板，利用高保真 Pfu DNA 聚合酶和目的
基因特异性引物 PCR 扩增出目的基因片段，其分子
量大约为 370 bp（图 2），与理论值相符。
2.3 重组融合蛋白的诱导表达与纯化
将测序正确的重组表达载体 pET28a-Rdrlec 转
化到表达宿主菌 BL21（DE3），在含有 50 μg/mL 卡
那霉素的 LB 液体培养基中培养至 OD600 达到 0.8 时，
加入终浓度为 0.5 mmol/L 的 IPTG，并降低诱导温度
至 34℃诱导重组融合蛋白表达，分别取诱导 0 h 和
6 h 的菌液，SDS-PAGE 分析表达产物（图 4），诱导
6 h 后的工程菌在约 17 kD 处有一条明显的新生的重
组蛋白表达条带，与重组融合蛋白的预期分子量值
（16.7 kD）相符，而未诱导的工程菌在相应位置处
330
250 260 270 280 290 300 310 320
170 180 190 200 210 220 230 240
90 100 110 120 130 140 150 160
10 20 30 40 50 60 70 80
Rdrlec
Rdrlecopt
Clustal Consensus
Rdrlec
Rdrlecopt
Clustal Consensus
Rdrlec
Rdrlecopt
Clustal Consensus
Rdrlec
Rdrlecopt
Clustal Consensus
Rdrlec
Rdrlecopt
Clustal Consensus
Rdrlec 表示天然密码子，Rdrlecopt 表示优化后的密码子，Rdrlec 中稀有密码子在图中用下划线标出 ；Rdrlecopt
中与 Rdrlec 相同的序列用“.”示出 ；Clustal Consensus 表示一致序列，用“*”示出
图 1 密码子优化前后的序列比对
500
2
bp
400
300
300
100
200
M 1
M ：50 bp DNA Ladder ；1 ：阴性对照 ；2 ：目标基因 Rdrlec 片段
图 2 PCR 扩增目标基因
2.2 重组表达载体的构建
1% 琼脂糖凝胶电泳检测结果（图 3）显示，重
组表达载体 pET28a-Rdrlec 大小约为 5 700 bp，双酶
切后得到约 5 350 bp 的载体大片段和约 360 bp 的目
的基因片段，片段大小与理论值相符，初步表明表
达载体构建成功。测序结果显示载体中的基因序列
和设计序列完全一致，且阅读框架正确，重组表达
载体 pET28a-Rdrlec 构建成功。
10000
2
bp
6000
5000
2000
1000
M 1
M ：1 kb DNA marker ；1 ：EcoR I 酶 切 后 的 线 性 表 达 载 体 pET28a-
Rdrlec ；2 ：EcoR I 和 Hind III 双酶切后的 重组表达载体 pET28a-Rdrlec
图 3 EcoR I 和 Hind III 双酶切鉴定重组表达载体
pET28a-Rdrlec
2013年第5期 97尹雪薇等 ：中国林蛙核糖核酸酶 Rdrlec 的原核表达及抗菌活性检测
无相应的蛋白条带。分析菌体经超声波裂解后的上
清和沉淀（图 4 中泳道 6，7），可见重组蛋白大部
分分布在沉淀中，以包涵体形式表达。
SDS-PAGE 显示（图 4 中泳道 3），Ni-NTA 亲和
层析后重组融合蛋白得到了有效的纯化。
将 纯 化 后 的 融 合 蛋 白 用 肠 激 酶 裂 解， 释 放
Rdrlec 蛋白，电泳结果（图 4 中泳道 4）显示，酶切
效果理想，释放出分子量约 12.3 kD 的 Rdrlec 蛋白
和分子量约 4.4 kD 的载体融合肽。肠激酶裂解产物
再次进行 Ni-NTA 亲和层析，由于载体融合肽带有
6×His 标签而结合在层析介质上，而 Rdrlec 蛋白则
流出层析柱。将流出液中的 Rdrlec 蛋白透析后冻干，
溶解于 pH6.0 的 40 mmol/L 乙酸钠缓冲液中，电泳
显示（图 4 中泳道 5），Rdrlec 重组蛋白得到了有效
的纯化。
40
kD
M 1 2 3 4 5 6 7
25
15
10
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：未诱导的携带 pET28a-Rdrlec 表达载体的 BL21
（DE3）总蛋白 ；2 ：诱导后的携带 pET28a-Rdrlec 表达载体的 BL21（DE3）
总蛋白 ；3 ：纯化的融合蛋白 ；4 ：融合蛋白肠激酶切割效果 ；5 ：纯化的重
组蛋白 ；6 ：诱导后菌体裂解液上清 ；7 ：诱导后菌体裂解液沉淀
图 4 重组蛋白表达及纯化产物电泳检测
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
⴨ሩ
䞦⍫
࣋O
D
26
0
0.5
0.0
RNase A Rdrlec NaAc
RNase A 浓度为 0.005 mg/mL，Rdrlec 重组蛋白浓度为 1.0 mg/mL，
NaAc 缓冲液作为阴性对照
图 5 Rdrlec 重组蛋白的酶活性与 RNase A 比较
3 讨论
为了探索 Rdrlec 这一新基因编码的蛋白产物的
功能，我们利用基因工程技术在大肠杆菌中表达重
组蛋白。由于有活性的重组蛋白在表达过程中可能
对宿主细胞有毒害，因此采用包涵体形式表达。包
涵体主要由目的蛋白构成的，但是由于错误折叠形
成无活性、不溶的蛋白聚集体，包涵体与细胞质成
分明显分开，细胞破碎之后仍以颗粒形式存在。包
涵体内绝大多数成分是蛋白质，杂质主要是一些外
膜蛋白、质粒 DNA、核糖体元件、脂质、肽聚糖和
脂多糖等。包涵体的形成对于重组蛋白的生产提供
了几个有利的因素 ：包涵体具有高密度，易于通过
低速离心分离纯化 ；包涵体有较强的抗酸碱、抗蛋
白酶的能力，有利于保护重组蛋白免受外界强烈作
2.4 Rdrlec的酶活性
重组 Rdrlec 具有酶活性，其酶活性弱于 RNase A，
但是显著高于乙酸钠阴性对照组（图 5）。由于核糖
核酸酶的活性依赖于分子正确的空间结构，因此可
以推测 Rdrlec 重组蛋白已经正确折叠。
2.5 Rdrlec重组蛋白的抗菌活性
Rdrlec 重组蛋白对测试的两种菌均具有显著的
抗菌活性（图 6），其中对大肠杆菌抑制作用最强，
在 Rdrlec 重组蛋白浓度为 2 μmol/L 时，菌落数下降
约 5 个数量级。对金黄色葡萄球菌的抑制作用其次，
菌落数下降约 3 个数量级。
1000000
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
100000
10000
1000
ᆈ⍫
㧼㩭
ᮠC
FU

100
10
0 1 2 3 4
1
Rdrlec⎃ᓖμmol/L
图 6 Rdrlec 重组蛋白的抗菌性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期98
用的破坏而降解损失 ；可用于生产天然构象时对宿
主细胞有毒害的蛋白质。
由于基因表达水平与偏好密码子的使用程度之
间存在强的相关性，因此为了提高重组蛋白的表达
效率，我们采用大肠杆菌偏好密码子进行了基因全
序列优化和人工合成。同时，由于天然 N 端对抗菌
肽的生物活有决定性作用，为了保证所表达的重组
蛋白具有天然 N 端，我们在抗菌肽基因的 N 端添加
了肠激酶识别序列。
本研究表达出的中国林蛙核糖核酸酶 Rdrlec 重
组蛋白具有明显的抗菌作用，对革兰氏阳性菌和阴
性菌表现出不同的抗菌活性，这可能与细菌细胞的
表面结构组成有关。不同的细菌外膜组成上存在差
异，使表面的负电荷表现差异，对同一种蛋白的结
合能力造成差异［10］。 抗菌蛋白必需穿过胞外基质、
细胞壁肽聚糖层等到达细胞质膜。按照膜裂解型或
非膜裂解型方式作用质膜［11］，目前发现的绝大多数
抗菌蛋白是通过损伤质膜的膜裂解型方式作用于细
胞。抗菌蛋白的正电荷启动与质膜的结合，双亲 α
螺旋或 β 折叠的结构进一步实现对膜脂双层的插入
或破坏。
中国林蛙核糖核酸酶 Rdrlec 作为一种有效的抗
菌蛋白，为抗微生物感染提供了新的候选药物分子，
在医药、食品防腐和动物饲料添加剂等领域可能具
有应用的潜力。
4 结论
按照大肠杆菌偏好的密码子合成 Rdrlec 基因，
并在目的基因的 N 端添加肠激酶切割位点，同时在
C 端添加终止密码子，通过 EcoR I 和 Hind III 限制
性内切酶位点将目的基因定向克隆到 pET-28a（+）
表达载体中，在大肠杆菌 BL21（DE3）中表达出带
有 6×His 标签的融合蛋白，利用 Ni-NTA 亲和层析
纯化融合蛋白后，经过肠激酶切割，获得具有抗菌
活性的不带有额外氨基酸序列残留的 Rdrlec 重组蛋
白，重组蛋白具有水解 RNA 的酶活性，说明形成了
正确的空间结构，重组蛋白对对测试的革兰氏阳性
金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌均具有显著
的抗菌活性，提示中国林蛙核糖核酸酶 Rdrlec 可能
在抗微生物感染中发挥作用。
参 考 文 献
［1］ 陶凤云 , 赵伟 , 马润宇 . 核糖核酸酶 A 超家族成员杀菌作用研
究进展［J］. 中国抗生素杂志 , 2009, 34（6）：321-325, 379.
［2］ Tao F, Fan M, Zhao W, et al. A novel cationic ribonuclease with
antimicrobial activity from Rana dybowskii［J］. Biochem Genet,
2011, 49 （5-6）：369-384.
［3］ 陶凤云 , 赵伟 , 林强 , 等 . 中国林蛙卵核糖核酸酶的分离纯化
及其抗肿瘤作用［J］. 中国生物工程杂志 , 2010, 30（5）：103-
109.
［4］ Lee I. Ranpirnase （Onconase）, a cytotoxic amphibian ribonuclease,
manipulates tumor physiological parameters as a selective killer
and a potential enhancer for chemotherapy and radiation in cancer
therapy［J］. Expert Opin Biol Ther, 2008, 8 （6）：813-827.
［5］ Nitto T, Dyer KD, Czapiga M, et al. Evolution and function of leuko-
cyte RNase A ribonucleases of the avian species, Gallus gallus［J］.
J Biol Chem, 2006, 281 ：25622-25634.
［6］ Cho S, Zhang J. Zebrafish ribonucleases are bactericidal：implications
for the origin of the vertebrate RNase A superfamily［J］. Mol Biol
Evol, 2007, 24 （5）：1259-1268.
［7］ Pizzo E, Varcamonti M, Di Maro A, et al. Ribonucleases with angio-
genic and bactericidal activities from the Atlantic salmon［J］. FEBS
J, 2008, 275 （6）：1283-1295.
［8］ Zanfardino A, Pizzo E, Di Maro A, et al. The bactericidal action on Es-
ch-erichia coli of ZF-RNase-3 is triggered by the suicidal action of the
bacterium OmpT protease［J］. FEBS J, 2010, 277 ：1921-1928.
［9］ Rosenberg HF. Recombinant human eosinophil cationic protein.
Ribonuclease activity is not essential for cytotoxicity［J］. J Biol
Chem, 1995, 270 （14）：7876-7881.
［10］ Papo N, Shai Y. Can we predict biological activity of antimicrobial
peptides from their interactions with model phospholipid
membranes? ［J］. Peptides, 2003, 24 （11）：1693-1703.
［11］ Powers JP, Hancock RE. The relationship between peptide structure
and antibacterial activity［J］. Peptides, 2003, 24 （11）：1681-
1691.
（责任编辑 李楠）