全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
收稿日期 ：2012-12-17
基金项目 ：山西省自然科学基金项目（2009011044-2）
作者简介 ：刘向标，男，硕士研究生，研究方向 ：生物化学 ；E-mail ：lxb-19860112@163.com
通讯作者 ：段江燕，女，教授，硕士生导师，研究方向 ：生物化学 ；E-mail ：duanjiangyan123@163.com
种子的萌发是植物生长的最关键时期。种子萌
发时蛋白质的变化反映了植物基因组第一次被激活
基因的表达情况［1］。高等植物中，种子在整个生命
周期中占据着重要的地位，生物体在不同的发育阶
段会合成和分解类型和数量不同的蛋白质，这些动
态变化的蛋白质构成了生物体某一时刻特征性生命
活动的基础，是认识生命活动本质的一个恰当而直
接的途径［2］。国内外对小麦在多种胁迫条件下的形
态结构、生理生化机制方面进行的研究已经深入到
DNA、蛋白质分子水平［3，4］。在外界胁迫的影响下，
使种子体内的一些蛋白质的合成受到抑制，同时也
促使一些新的蛋白质的合成引发种子体内的代谢变
小麦种子萌发时期胚差异蛋白表达分析
刘向标  段江燕
（山西师范大学生命科学学院，临汾 041000）
摘 要 ： 为了解小麦种子在萌发时期胚蛋白质表达情况，通过双向电泳技术，对“晋麦 -47”小麦种子未萌发和萌发 3 h、
16 h 和 25 h 的胚进行蛋白质分离。结果发现，“晋麦 -47”小麦种子未萌发和萌发 3 h、16 h 和 15 h 的胚在 PDQuest 图像分析软件
可识别的蛋白点分别有 127、131、135 和 141 个，其中表达量变化 2.5 倍以上的蛋白点有 17 个。选取表达量在 2.5 倍以上的 9 个
差异蛋白点进行质谱分析，初步鉴定出 4 个蛋白质，分别是核苷二磷酸激酶Ⅰ、17.5 kD 热休克蛋白、ATP 合酶和 LEA 蛋白 27。
关键词 ： 小麦 胚 双向电泳 质谱技术
Analysis of Differentially Expressed Proteins of Embryo During Seed
Germination in Wheat
Liu Xiangbiao Duan Jiangyan
（College of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen 041004）
Abstract:  In order to investigate the embryo protein expression of the wheat seeds germination, tow-dimensionsl gel electrophoresis
（2-DE） technology was used to separated proteins from ungerminated seed and embryo buds of germinated seed at specific stages of 3h, 16h, 25h
in wheat “Jinmai-47”. The results showed that on the 2-DE gels PDQuest image software detected about 127, 131, 135, 141 protein spots, of
which 17 spots show more than 2.5-fold changes in abundance among ungerminated seed and embryo buds of germinated seed at specific stages
of 3 h, 16 h, 25 h in wheat “Jinmai-47”. These 9 of 17 protein spots treated by mass spectrometry analysis, of which 4 differential proteins were
elementarily identified as nucleoside two phosphoglycerate kinase Ⅰ , 17.5 kD heat shock protein, ATP synthase and LEA protein 27.
Key words:  Wheat Embryo Two-dimensional electrophoresis Mass spectrometry technology
化［5］。但萌发的调控等一系列复杂的生理生化过程
如何相互协调还不甚清晰，成熟的种子蛋白质作为
生命活动的执行者，既能反映基因组被激活后基因
的表达情况，同时又能反映种子相对静止状态到活
跃的生理生化代谢的转变过程。为此，通过对小麦
种子萌发不同时间的差异蛋白的研究，对探讨小麦
种子萌发机制具有重要意义。
蛋白质组学技术为研究蛋白质的动态变化提
供了重要的技术支撑，可对生物细胞或组织蛋白质
表达进行定性或定量的综合分析，尤其可用于揭示
不同条件下蛋白质表达的变化。该技术具有高通
量、高灵敏度、高分辨率、重复性好等优点［6］。核
2013年第3期 61刘向标等 ：小麦种子萌发时期胚差异蛋白表达分析
心 技 术 包 括 双 向 电 泳 技 术（two-dimensional elect-
rophoresis，2-DE） 和 质 谱 技 术（mass spectrometry，
MS）［7］。目前该技术方法仅在拟南芥、大麦、橡胶
种子等少数植物有相关报道［8］。但尚未见对小麦种
子不同萌发时期差异蛋白质组和质谱分析的报道。
本试验以“晋麦 -47”为材料，比较小麦种子
萌发前期胚蛋白质表达的差异，并进行质谱鉴定，
揭示种子从相对静止状态到活跃状态过程中涉及的
差异蛋白表达情况，以期为小麦种子萌发的调控机
制研究提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
小麦种子（晋麦 -47）由山西省农科院小麦研
究所提供。 主要试剂：Triton X-100、超纯水、蒸馏水、
丙酮、过硫酸铵（AP）、尿素、硫脲、十二烷基硫酸
钠（SDS）、三羟基甲基氨基甲烷（Tris）、N、N、N、
N 四甲基乙二胺（TEMED）、0.1% HgCl2、牛血清蛋
白（BSA）、冰乙酸、甘油、两性电解质（Bio-Lyte）
1% 溴酚蓝、1 mol/L 盐酸、CHAPS、碘乙酰胺（IAM）、
低熔点琼脂糖、甘氨酸、丙烯酰胺（Acr）、85%磷酸、
二硫苏糖醇（DTT）、95%乙醇、考马斯亮蓝 G-250
和甲叉双丙烯酰胺（Bis）
1.2 方法
1.2.1 不同萌发时期小麦种子胚样品的制备 选取
干燥度一致、饱满、种皮色泽正常的种子 650 粒。
（经 0.1% HgCl2 溶液浸没消毒 2 min 后再用纯水漂洗
5 次），置于 25 mL 纯水，铺有双层定性滤纸的玻璃
培养皿中，每皿 50 粒，盖上盖。25℃恒温避光处理
发芽。随机选取吸胀后 0、0.5、1、2、3、5、7、10
和 13 h，之后每隔 3 h 取一次直至 25 h 胚根突破种
皮 2-3 mm 为止，测定种子的鲜重和干重，均重复 3
次，初步确定小麦胚的选取时期。
1.2.2 蛋白样品的提取 用尿素 / 硫脲法提取小麦
胚蛋白，把在不同时期取出的小麦胚样品在液氮中
磨成粉末加入离心管中，加入尿素 / 硫脲蛋白提取
液振荡 30 s，离心 15 min 后，取上清液再重复离心，
收集上清液，加入 3 倍体积冷丙酮，并放入 -20℃的
冰箱里过夜，次日后收集沉淀（视具体情况可再加
一次，离心同上），4℃放置，使丙酮充分发挥，待
沉淀干燥后，溶于 400 μL 样品裂解液，4℃冰箱中
过夜，第二天离心取上清液，得到蛋白质样品液，4℃
放置待用。
1.2.3 小麦种子胚可溶性蛋白的双向电泳 取出已
经配好的水化上样液，加入 0.001 g DTT，5 μL 的
40% Bio-Lyte（pH3-10），充分溶解，取均质的水化
上样液与蛋白样品溶液以 4∶1 混匀，即为上样液。
采用 pH3-10，7 cm 线性 IPG 预制胶条。主动水化在
50 V 电压下 12 h 后，经过 250 V 0.5 h、500 V 0.5 h、
4 000 V 3 h、最后稳定在 4 000 V 下进行 20 000 Vh，
500 V 快速保持时间视情况而定。聚焦完毕后，胶条
先在平衡液Ⅰ［尿素 36 g、SDS 2 g、Tris-HCl（pH8.8）
25 mL、甘油 20 mL、DTT 0.2 g］中，在摇床上平衡
15 min，再在平衡液Ⅱ（0.25 g IAM 代替 0.2 g DTT，
其余组分同平衡Ⅰ）中平衡 15 min。然后进行第二
向 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为 12%。
1.2.4 考马斯亮蓝染色 剥离凝胶立即放入固定液
（12% TCA）中固定 2 h，充分固定后用双蒸水洗 3 次，
每次 5 min，取出放入考马斯亮蓝染液（20%甲醇、
1.8% 磷酸、8%硫酸铵、0.08% 的考马斯亮蓝 G250
染色至少 2 h，脱色液（7%、5%甲醇）脱色 1 h 后
换用双蒸水进行脱色，直到蛋白点清晰为止。
1.2.5 2-DE 图像分析 凝胶用扫描仪（UMAX）进
行扫描，得到蛋白图像用 PDQest 软件进行分析包括
背景消减、斑点检测、匹配、获取斑点位置坐标和
蛋白质点的标准化分析等。
1.2.6 蛋白质点胶内酶解及肽指纹图谱分析 选
取重复性较好的差异表达量在 2.5 倍的蛋白点进行
胶内酶解，将酶解肽段重新溶解于 0.7 μL 0.5g/L 的
CHCA 溶液（0.1%TFA+50%ACN）中，在靶板上点样。
样品用 4700 串联飞行时间质谱仪进行质谱分析。所
得质谱结果用 GPS-MASCOT 软件进行数据库检索。
2 结果
2.1 小麦种子胚萌发前期取样时间的确定
根据萌发过程中小麦种子含水量的不同，将分
为 3 个时期，分别是第一时期吸胀吸水期，第二时期
缓慢吸水期，第三时期生长吸水期。生长吸水时期
的胚根突破种皮 2-3 mm，分别测定 13 个时间段种
子干重和湿重，得到“晋麦 -47”种子的含水量（图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期62
1）同时间的关系，以初步确定小麦种子萌发前期的
取样时间。从图中可看到小麦种子萌发前期的 3 个
阶段，分别是从 0 h（干种子）-3 h，种子含水量快
速从 0 g 增加到 0.06 g ；3 h-16 h，种子含水量缓慢
增加，从 0.06 g 增加到 0.19 g ；17 h-25 h（胚根突破
种皮 2-3 mm）种子含水量快速从 0.19 g 增加到 0.24
g。87％的种子露白发生在第三个阶段，表明小麦种
子出芽时间比较集中。为此，将种子萌发前期过程
中蛋白质的取样时间初步定在 0、3、16 和 25 h。
M ：蛋白 Marker ；1 ：尿素硫脲法 ；2 ：TCA 丙酮法 ；3 ：酚提甲醇 / 醋酸法
图 2 不同提取方法的 SDS-PAGE 分析结果
0.25
0.15
0.05
0
0 0.5 1 2 3 5 7 10 13 16 19 22 25
0.10
0.20
ᰦ䰤h
⿽ᆀ
ਜ਼≤
䟿g

图 1 小麦种子萌发过程水分含量的变化
2.2 小麦种子总蛋白提取的方法比较
本试验分别采用酚提 - 甲醇 / 醋酸铵沉淀法、
TCA/ 丙酮沉淀法和尿素硫脲法提取小麦种子中胚蛋
白，为确定合适的提取方法每个方法重复 3 次。分
别 进 行 SDS-PAGE（ 图 2）， 结 果 显 示， 不 论 在 蛋
白条带的数目还是染色的深浅方面，3 种蛋白提取
方法得到的蛋白样品均有所不同。酚提 - 甲醇 / 醋
酸铵沉淀法对种子中胚蛋白的提取效果明显弱于
TCA/ 丙酮沉淀法和尿素硫脲法。从图 2 还可看出，
在高分子量区，TCA/ 丙酮法的提取效果不如尿素硫
97.4
kD
M 1 2 3
66.2
43.0
31.0
20.1
14.4
脲法，因能明显看到这种方法在此范围会丢失部分
蛋白，相比较而言，尿素硫脲提取的蛋白更加完整。
2.3 小麦种子萌发过程中蛋白含量的变化
为了进一步探究小麦种子萌发过程中蛋白含
量的变化，本试验分别采用 0、0.5、1、2、3、5、
7、10、13、16、19、22 及 25 h 的小麦种子作为材
料，用尿素硫脲法进行总蛋白的提取，进行 SDS-
PAGE 分析（图 3）。结果显示，不论是 3 h、16 h 和
25 h，小麦种子胚蛋白的含量与未萌发的相比，含
量均有所上升，萌发 3 h 时与 0 h 的差异不显著 ；
萌 发 16 h 时， 与 0 h 相 比 其 差 异 显 著 ；萌 发 25 h
后，与 0 h 相比差异极显著。因此，将种子萌发前
期过程中胚蛋白质的取样时间定在 0、3、16 和 25 h
4 个时期是合理的。
0 0.5 1 2 3 5 7 10 13 16 19 22 25
时间（h）
图 3 不同时段小麦种子胚蛋白的 SDS-PAGE 分析结果
2.4 不同萌发时期小麦种子蛋白的双向电泳图谱
分析
通过严格一致 3 次重复的双向电泳操作获得 0
h、3 h、16 h 和 25 h 等 4 个时期重复性较高的 2-DE
电泳图谱（图 4），在 pH3-10，分子质量 14.4-94.0
kD 范围，利用 PDQuest 软件分析 0 h 与 3 h 的蛋白
点相关系数（Correlation coefficient）为 86.3％，与
16 h 的为 84.9％，与 25 h 的为 83.7％，说明蛋白质
渐近变化。
2.5 差异表达蛋白的MALDI-TOF-MS分析及数据
库检索
2-DE 凝胶上面的蛋白点相对量随着小麦种子萌
发初期发育进程的出现与否和表达量的增减，通过
PDQuest 软件分析出对重复性、表达量变化超过 2.5
2013年第3期 63刘向标等 ：小麦种子萌发时期胚差异蛋白表达分析
倍以上的 9 个差异蛋白质点进行 MALDI-TOF-MS 分
析，以基质峰、酶自动降解片段峰进行校正，去掉
角蛋白峰和胰酶自切峰，精确标定强度为基质峰强
度 2 倍以上的峰，9 个蛋白点均获得肽质量指纹图
94.0
kD
IEF pH310 IEF pH310 IEF pH310 IEF pH310
67.0
43.0
7
9
5
8
3
6
1
24
C DBA
30.0
20.0
14.4
94.0
kD
67.0
43.0
30.0
20.0
14.4
A ：未萌发 ；B ：3 h ；C ：16 h ；D ：25 h
图 4 “晋麦 -47”萌发前期不同时期种子胚蛋白质 2-DE 电泳图谱
1751558
861224
1361156
101.1041
110.0947
216.1509
237.1862
2882589
3292516
457.3322
575.3929 706.5090 856.6346 986.7756 1149.8871
9.2E+4
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
74.0 323.2 572.4 821.6
Massm/z
1070.8 1320.0
In
te
ns
ity
%
图 5 ATP 合酶质谱图
谱（PMF），图 5 是蛋白点 6 的肽段串联质谱图。共
鉴定得到 4 个差异蛋白（表 1）分别为核苷二磷酸
激酶Ⅰ、17.5 kD 热休克蛋白、ATP 合酶和 LEA 蛋
白 27。
表 1 差异表达蛋白的查询结果
蛋白编号 蛋白名称 理论分子量（kD）/ 等电点 试验分子量（kD）/ 等电点 覆盖率（％）
1 NDPK Ⅰ 16.3/6.9 16.0/6.9 41
3 HSP 17.5 kD 18.5/5.8 18.3/6.2 37
6 ATP Synthase 11.9/15.4 12.3/5.8 21
8 LEA 27 kD 27.3/6.6 26.5/6.2 31
3 讨论
3.1 小麦种子萌发过程中蛋白取样时期的确定
选择合适的时期进行蛋白取样，对后续的蛋白
质组学分析至关重要。种子萌发分为吸胀吸水期、
缓慢吸水期、生长吸水期。种子细胞在不同发育阶
段的蛋白质在种类和数量上是不同的，反映在种子
萌发过程中不同阶段的发育特点上。通过对不同时
期小麦种子含水量指标的测定，初步选定 0、3、16
和 25 h 作为取样时期。据此，进一步结合 13 个不
同时期的蛋白样品进行 SDS-PAGE 检测，把吸胀 0 h
作为休眠干种子代表时期，吸胀 3 h 作为吸胀吸水
期的代表，吸胀 16 h 作为缓慢吸水期的代表，吸胀
25 h 作为生长吸水期的代表。因此，分别在 0 h、3 h、
16 h 和 25 h 等 4 个时期进行蛋白取样。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期64
3.2 小麦种子萌发过程中胚差异蛋白分析
植物在生长时期表现出来的蛋白质动态变化，
共同构成了细胞各个时期生命的基础。小麦种子在
萌发时期的蛋白质变化，反映出小麦基因组从休止
到开启、翻译、表达的过程。因此，了解蛋白质的
变化为认识生命活动本质提供了一个直接途径［9］。
与种子生长、能量代谢相关的蛋白 ：蛋白点 1
被鉴定为核苷二磷酸激酶Ⅰ（NDPK Ⅰ），在小麦种
子萌发 16 h 时表达量增加，一直到 25 h 保持着较高
的表达水平，表明此时核酸合成活跃，维持细胞核
内 NDP 和 NTP 代 谢 的 平 衡（NTP +NDPK NDP+
NDPK-P ；N=G、T、C、U）进行磷酸化与脱磷酸化
反应［9］，有利于种子的生长 ；蛋白点 6 被鉴定为
ATP Synthase（ATP 合酶），在种子萌发 25 h 表达量
最高，此时胚根突破种皮需要消耗大量能量。研究
表明，ATP 合酶在线粒体和细菌中广泛存在［11，12］，
依靠质子动力势合成 ATP 也能水解 ATP 形成机体重
要的质子梯度，其主要功能是合成 ATP。
与种子抗性和抗氧化性相关蛋白 ：蛋白点 3 被
鉴 定 为 17.5 kD 热 激 蛋 白（HSP）， 在 25 h 大 量 表
达，可能是与打破休眠后保护萌发过程中细胞膜结
构系统和抗氧化系统免受伤害，保证小麦种子的顺
利萌发。研究表明，HSPs 的生成与生物耐热性相关，
HSP105 在热激时能迅速移到核内，并在核仁和核质
中积累，在热激解除时，又迁到细胞质中具有保护
细胞机体免受损害的作用［10］；蛋白点 8 被鉴定为 27
kD 种子成熟蛋白在 25 h 时出现，可能与 GmPM4 一
样供种子萌发时维生素的需求，绝大部分种子成熟
蛋白属于 LEA 蛋白家族成员（如 GmPM1、GmPM8
和 GmPM9 等）都有 LEA 蛋白保守机构域，种子成
熟蛋白 GmPM4 含有 TENA-THI-4 保守结构域，属于
硫胺（维生素）家族［13］。Roy 等［14］曾报道，Gm-
PM4 可作为维生素的一种贮藏形式供种子萌发所用。
4 结论
本研究发现“晋麦 -47”小麦种子未萌发和萌发
3 h、16 h 和 25 h 的胚的 2-DE 凝胶通过 PDQuest 图
像分析软件可识别的蛋白点约有 127、131、135 和
141 个，其中表达量变化 2.5 倍以上的蛋白点有 17 个，
选取表达量在 2.5 倍以上的 9 个差异蛋白点进行质
谱鉴定，初步鉴定出 4 个蛋白质分别是核苷二磷酸
激酶Ⅰ、17.5 kDa 热休克蛋白、ATP 合酶和 LEA 蛋
白 27，分子量分别为 16.0、18.3、12.3 和 26.5 kD ；
等电点分别为 6.9、6.2、5.8 和 6.2。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）