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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
木聚糖是细胞中最具代表性的半纤维素，约占
细胞干重的 35%，可以作为再生资源被利用［1］。木
聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各种酶相互
之间协同完成，起主要作用的是内切 β-1，4-木聚糖
酶（1，4-β-D-木聚糖酶水解酶，EC3.2.1.8），简称木
聚糖酶，是当前木聚糖酶类的研究热点。木聚糖酶
作用于木聚糖和长链木聚糖，从 β-1，4-木聚糖主链
的内部切割木糖苷键，从而使木聚糖降解为木寡糖，
收稿日期 ：2012-09-03
基金项目 ：天津科委真菌 -淀粉酶高温活性改造和新型酶遗传工程技术开发项目（10ZCKFSY06200）
作者简介 ：王红霞，女，硕士研究生，研究方向 ：食品及生物技术 ；E-mail ：whongx@163.com
通讯作者 ： 罗成，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：食品科学，生物技术及免疫学 ；E-mail ：Luo58@yahoo.com
王华明，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：蛋白质表达，新型工业酶及表达系统 ；E-mail ：wang_hm@tib.cas.cn
葡萄穗霉木聚糖酶 XYA6205 在黑曲霉中的表达及
酶学特性分析
王红霞1，2 王华明2 张大龙2 罗成1
（1. 天津科技大学食品工程与生物技术学院 食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457 ；
2. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308）
摘 要 ： 木聚糖酶是涉及半纤维素水解的主要酶，具有重要的应用价值。将葡萄穗霉上可能为木聚糖酶的基因 xya6205（含
信号肽）克隆到载体 pGm 上，进而通过原生质体 -PEG 转化到黑曲霉 G1 上。得到的目的转化子经过摇瓶培养发酵，SDS-PAGE 分
析表明，产生了大小为 20 kD 左右的蛋白条带。DNS 法测定 1 L 发酵液 5 d 酶活，比活达 392 U/mg，其最适温度为 50℃，最适 pH
为 5.8，在不同 pH 缓冲液中处理 18 h 后，最高仍有 83% 残余酶活。
关键词 ： 木聚糖酶 黑曲霉 克隆 酶活 葡萄穗霉
Heterologous Expression and Characterization of Xylanase XYA6205
from Stachybotrys chartarum
Wang Hongxia1，2 Wang Huaming2 Zhang Dalong2 Luo Cheng1
（1. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science and Technology, Ministry of Education, School of Food
Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457 ；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,
Chinese Academy of Science, Tianjin 300308）
Abstract: Xylanase, the main enzyme to hydrolysis hemicellulose, has important application in industry. In this study, a gene xya6205
（with signal peptide）from Stachybotrys chartarum was inserted to an expression vector, eventually an recombinant plasmid pGm-xya6205
was constructed, and then transformed into A. niger G1 mediated by PEG4000. The transformants were confirmed by PCR analysis, and the
recombinant xylanase of heterologously expressed protein in SDS-PAGE was about 20 kD. The optimal temperature and pH of the enzyme
activity was 50℃ and 5.8, respectively. The recombinant enzyme specific activity reached 392 U/mg by DNS method at optimal condition. The
recombinant enzyme remained 83% activity after 18 h in the alkaline buffer.
Key words: Xylanase Aspergillus niger Cloning Activity Stachybotrys chartarum
其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，
也有些可以产生少量木糖和阿拉伯糖。
木聚糖酶是涉及半纤维素水解的主要酶，因而
具有重要的应用价值。研究表明，木聚糖酶在许多
工业中都有广泛的用途，如食品、动物饲料、制浆
造纸、环境等［2，3］。但是，木聚糖酶要实现有效应
用，要求其具有良好的酶学性质，在不同领域应用
要求其具有不同酶学性质［4］。自 20 世纪 70 年代末，
2013年第2期 131王红霞等 ：葡萄穗霉木聚糖酶 XYA6205 在黑曲霉中的表达及酶学特性分析
80 年代初开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有
上百种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在
大肠杆菌中表达［5-10］。
我国对木聚糖酶的研究最近十几年才开始，基
本上还限于天然菌株的筛选、酶的纯化及酶学性质
的分析上［11，12］。目前大多是从木霉、黑曲霉中克隆
木聚糖酶基因，还没有葡萄穗霉木聚糖酶基因克隆
表达的报道［13-16］。葡萄穗霉具有嗜纤维性，且对于
碱性条件也有较好的耐受性［17］。本研究将从葡萄穗
霉中克隆得到的木聚糖酶基因 xya6205，利用黑曲
霉（G1）表达系统实现胞外分泌表达，并对所产重
组木聚糖酶的酶学性质进行初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 木聚糖酶基因 xya6205 为本实
验室保藏的葡萄穗霉中克隆 ；大肠杆菌菌株 E. coli
Trans5α 购自北京全式金生物技术有限公司 ；黑曲霉
G1 为本实验室保藏。
1.1.2 试剂 限制性内切酶 SnaB Ⅰ、Xba Ⅰ、T4 连
接 酶、Gel Extraction Kit、PCR Kit、PlasmidKit 等 均
购自 Fermentas 公司 ；木聚糖酶底物桦木木聚糖（bi-
rch wood xylan） 购 自 Sigma 公 司 ；KOD-plus 购 自
TO-YOBO 公司 ；其它生化试剂为国产分析纯。
1.1.3 培 养 基 LB、CMC、amds 乙 酰 胺 选 择 培 养
基［18］、promosoy special medium 产 酶 培 养 基、CSL
生长培养基均按照常规实验室标准配置。
1.2 方法
1.2.1 木聚糖酶基因 xya6205 在葡萄穗霉全基因组
上的挖掘 通过比较基因组学，葡萄穗霉全基因组
上部分基因功能注释可能为木聚糖酶，其中 13 个序
列可能为 β-内切木聚糖酶。为了克隆最有可能的内
切木聚糖酶基因，采用预先建立内切木聚糖酶基因
序列库，并将相应序列分别进行本地 BLASTp，同时
将这些序列在 NCBI 进行在线 BLASTp。将本地及在
线 BLAST 结果结合分析，确定最有可能的内切木聚
糖酶序列进行克隆。
1.2.2 重 组 质 粒 pGm-xya6205 的 构 建 和 克 隆 根
据挑选的 xya6205 基因的序列以及表达载体 pGm
的多克隆位点的特征，设计引物（表 1）由上海
Invitrogen 公司合成。
PCR 扩增得到的木聚糖酶基因 xya6205，经琼
脂糖凝胶回收纯化，用 SnaB I 和 Xba I 双酶切，连
接 到 载 体 pGm 多 克 隆 位 点， 得 到 重 组 质 粒 pGm-
xya6205。将其向感受态大肠杆菌 Trans 5α 中进行转
化，30℃倒置过夜培养 16 h，挑取适中大小的转化
子进行菌落 PCR 验证。验证正确的用加氨苄的 LB
培养液培养 24 h 后，提取质粒。
1.2.3 黑曲霉重组表达载体的构建及转化子的筛
选和鉴定 黑曲霉原生质体的制备参照 Wernars 等
的方法操作［19］。将构建的重组质粒 pGm-xya6205
与 100 μL 原生质体混合，并加入 12.5 μL PEG 缓冲
液（PEG4000 50%，CaCl2 0.05 mol/L，Tris 1 mol/L，
pH7.5），冰上静置 20 min 后再加入 1 mL 上述 PEG
缓冲液，2 mL 山梨醇溶液（山梨醇 1.2 mol/L，CaCl2
0.05 mol/L，Tris 1 mol/L，pH7.5），并与融化的 AMDS
上层培养基混匀，立即平均铺于 3 个 AMDS 下层培
养基平板上，30℃培养 5-7 d。
挑取转化子到二次验证板上，同时挑取阳性对
照和阴性对照，30℃继续培养，若能继续生长则为
阳性转化子，进行菌丝 PCR 验证。菌丝 PCR 验证
操作过程参见 Finnzymes 的 Phire®plant direct PCR kit
操作说明书。验证正确的转化子转接到斜面上保存，
同时保存孢子悬浮液，用甘油管储存于 -80℃冰箱。
1.2.4 重组黑曲霉工程菌株的表达 从斜面上用无
菌竹签挑取孢子，接种到 25 mL 的产酶培养基三角瓶
中，摇床培养，30℃，200 r/min；3 d 后取发酵液，离心，
10 000 r/min，8.5 min，取上清 30 μL，加入 10 μL 4
倍上样 buffer（已煮沸），水浴煮沸 5 min；10 000 r/min
离心 1 min，待用。
配置 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶，待凝固后点
样，加入缓冲液，接通电源，首先 80 v 电压跑胶，
待蛋白样跑出凝缩胶后改电压为 120 v，直至其跑到
最底线 ；考马斯亮蓝染色 30 min ；脱色液脱色 3 次，
每次 30 min，最后用清水浸泡过夜。
表 1 克隆 xya6205 使用的引物
引物名称 引物序列（5-3）
Primer-F CCATTACGTAAGAATGTTCTTCTCCCAAGTCATCA
Primer-R CTAGTCTAGATCAACCACCATGCCGCATCCTT
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期132
1.2.5 重组黑曲霉表达产物酶学性质分析 采用
DNS 法测定木聚糖酶的活性［20］。酶活定义为 ：在
一 定 条 件 下（pH5.5，37 ℃）， 每 分 钟 产 生 1 μmol
木糖所需的酶量为一个酶活力单位（1 U）。采用
Brandford 法测定发酵液中的蛋白含量。酶活力和酶
学性质的测定每组试验设 3 个重复，取平均值计算。
最适 pH 的测定：配置不同 pH2.7-9.0 的缓冲液，
在 37℃条件下分别测定不同 pH 值下重组酶的活性。
以最高酶活为 100% 计。
最适温度的测定 ：在最适 pH 条件下，测定不
同温度（30-80℃）下重组酶的活性。以最高酶活为
100% 计。
酶的耐热性试验 ：重组酶在最适反应温度水浴
条件下处理 5、10、15、20、25 和 30 min 后，在最
适反应条件下测定残余酶活，以未处理为 100% 计。
酶的 pH 稳定性试验 ：在室温（25℃）条件下，
将重组酶液在不同 pH 缓冲液中（pH2.8-8.2）处理
18 h 后，取 2 mL 在酶活测定反应体系中测定其残余
酶活，以未处理为 100% 计。
2 结果
2.1 黑曲霉重组表达载体的构建
经 PCR 扩 增 得 到 了 大 小 正 确（1 699 bp） 的
xya6205 基因（图 1）。
重组质粒 pGm-xya6205 构建成功。
10000
bp
M 1
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
3500
2500
1500
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：xya6205 PCR 产物
图 1 PCR 扩增产物的电泳分析
挑取 5 个大肠杆菌菌落进行菌落 PCR 验证，其
中一个菌落得到了大小正确的 xya6205 基因（图 2）。
将该重组质粒 pGm-xya6205 寄送到博尚生物技术有
限公司进行双向测序。测序结果用 DNAMAN 软件与
正确序列进行比对，发现没有发生突变，完全正确，
3000
bp
2000
1000
1500
2500
750
250
100
1 2 3 4 5 M
M ：DL2000 DNA Marker ；1-5 ：转化 E. coli 的 PCR 产物 ；- ：阴性对照
图 2 菌落 PCR 鉴定
2.2 黑曲霉的转化
重组质粒 pGm-xya6205 以同源重组的方式进入
到黑曲霉 GAP3 染色体上，因 pGm 上具有来自构巢
曲霉的 amds 基因，可以利用乙酰胺作为唯一氮源，
因而试验中采用 amds 培养基培养转化黑曲霉，可初
步方便快捷的筛选出含 pGm-xya6205 的重组菌株。
筛选后共得到 25 个阳性转化子。
2.3 重组黑曲霉菌株的PCR快速鉴定
将筛选到的 25 株转化子，分别进行菌丝 PCR
快速验证，经琼脂糖凝胶电泳分析，有 18 株得到了
1 699 bp 的 xya6205 基因条带（图 3）。
10000
bp
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
1500
750
250
2500
3500
M 9 8 7 6 5 4 3 2 1
M ：DL2000 DNA Marker ；1-9 ：转化子的 PCR 产物鉴定 ；- ：阴性对照
图 3 黑曲霉转化子菌丝 PCR 快速鉴定
2.4 重组蛋白的表达
挑取 8 株菌丝 PCR 快速验证呈阳性的转化子
及阴性 G1 进行摇瓶培养，SDS-PAGE（图 4）显示，
有 6 株在 25 kD 处出现条带，而阴性无目的条带。
2.5 重组酶酶学性质的分析
DNS 法测得 1 L 发酵液在第 5 天时酶活达到最
2013年第2期 133王红霞等 ：葡萄穗霉木聚糖酶 XYA6205 在黑曲霉中的表达及酶学特性分析
高（392 U/mg）。重组酶的最适 pH 值为 5.8，如图 5
所示，在 pH5.0-9.0 范围内酶活均比较高，尤其是
在碱性范围内，仍有 60% 以上的酶活。
1 2 3 4 5 6 7 8 M
116.0
kD
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
XYA6205
M ：蛋白质 Marker ；1-8 ：G1-pGm-xya6205 ；- ：阴性对照
图 4 重组木聚糖酶表达的 SDS-PAGE
重组酶最适温度为 50℃（图 6），在 60℃仍有
80% 酶活，70℃时下降较快，残余酶活仅为 29.9%。
0
20
40
60
80
100
120
2.7
7
3.1
7
3.5
2
3.9
1
4.2
7
4.9
7
5.3
5
5.8
0
6.5
2
7.0
6
7.6
1
8.0
4
8.5
8
9.0
4
pH
相
对
酶
活
%
图 5 重组木聚糖酶的最适反应 pH
酶的耐热性试验（图 7）表明，重组酶在 50℃
下保持 5 min 时，残余酶活还剩 80% 左右，超过 30
min 酶活仅有 23%。另外将重组酶分别在 30、40、
50、60、70 和 80℃下金属浴处理 30 min 后，测定
剩余酶活，以未处理的为 100% 计，在 40℃以下酶
活性几乎无损失（图 8）。
0
20
40
60
80
100
120
30 40 50 60 70 80ᓖ ć
ሩ
䞦⍫
%
图 6 重组木聚糖酶的最适反应温度
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30ᰦ䰤 min
࢙։
䞦⍫
%
图 7 重组木聚糖酶在 50℃的热稳定性
0
20
40
60
80
100
120
140
30 40 50 60 70 80
ᓖ ć
࢙։
䞦⍫
%
图 8 重组木聚糖酶温度稳定性
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
2.8
pH
࢙։
䞦⍫
%
3.6 4.4 5.2 6 6.8 7.6 8.2
图 9 重组木聚糖酶的 pH 稳定性
重组酶的 pH 稳定性如图 9 所示，在 pH5.2-8.2
环境中处理 18 h 后酶活较稳定，存在 70% 以上的残
余酶活，pH6.8 时最高，为 83%。
3 讨论
黑曲霉表达系统是近年来逐渐广泛使用的新型
外源蛋白真核基因表达系统之一。该表达系统具有
以下特有优点 ：表达量大 ；胞外分泌率高 ；蛋白质
分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞 ；表达的外
源蛋白具有天然活性 ；良好的安全性［21］。
丝状真菌葡萄穗霉具有嗜纤维性和嗜碱性，可
以在低氮条件下生长，适宜条件下能够产生多种真
菌毒素和其它活性产物。目前还没有葡萄穗霉木聚
糖酶基因克隆表达的报道。本试验中，将从葡萄穗
霉中克隆得到的木聚糖酶基因 xya6205（不含自身启
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期134
动子）插入到 pGm 载体的多克隆位点，利用来自于
黑曲霉 glaA 的强启动子，使目的基因在黑曲霉 G1
中得到了高效分泌表达。重组木聚糖酶产量达 392
U/mg，表达产物具有生物活性，为进一步的工业化
发酵生产提供了良好的出发菌株。
该木聚糖酶的最适温度为 50℃，最适 pH 为 5.8。
在 pH5.0-9.0 范围内酶活均比较高，尤其是在碱性
范围内，仍有 60% 以上的酶活，其碱性稳定性也较
高，在 pH8.2 环境中处理 18 h 后，仍有 70% 残余酶活。
在造纸工业中，碱性木聚糖酶作为纸浆预漂白助剂，
可以提高纸浆生产能力和纸浆亮度，降低废水中有
机氯含量。重组酶优良的碱性稳定性为其工业应用
的开发奠定了基础。
4 结论
本研究克隆、异源表达了具有活性的葡萄穗霉
木聚糖酶基因，其粗酶液木聚糖酶比活达 392 U/mg，
最适温度为 50℃，最适 pH 为 5.8，在不同 pH 缓冲
液中处理 18 h 后，最高仍有 83% 残余酶活，是一种
新型碱性木聚糖酶。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）