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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-03-22
基金项目 : 辽宁省教育厅创新团队项目（LT2010015）
作者简介 : 陈之桥 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 水产动物遗传与繁育 ; E-mail: czq305@126.com
通讯作者 : 仇雪梅 , 女 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 海洋生物技术 ; E-mail: xmqiu@dlou.edu.com
牡蛎隶属软体动物门、双壳纲、珍珠贝目、牡
蛎科（Ostreidae）、巨蛎属（Crassostrea），是我国及
世界产量最大的经济贝类［1］，我国牡蛎的产量在贝
类养殖业中居首位。作为一种重要的经济贝类，它
的养殖和良种选育工作倍受学者的关注［2-4］。然而
由于牡蛎的广栖息性，贝壳的可塑性强，其种质鉴
定和分类工作一直是牡蛎育种工作者的一个难题。
近年来，随着自然环境的恶化、捕捞强度的增大，
加之牡蛎养殖的管理不善等原因，致使我国的牡蛎
种质资源受到严重破坏。因此，充分认识我国牡蛎
种群的遗传结构和遗传多样性，对于了解我国牡蛎
资源的状态、对其种质资源的保护和可持续利用具
有重要意义。
目前，有关牡蛎种群遗传多样性的研究报道较
三个牡蛎群体遗传多样性的 AFLP分析
陈之桥 仇雪梅 于旭蓉 常亚青 刘洋 王秀利
（大连海洋大学水产与生命学院，大连 116023）
摘 要： 采用 AFLP技术对太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）、近江牡蛎（Crassostrea rivularis）和褶牡蛎（Crassostrea plicatula）
3个牡蛎群体共 60个个体进行了遗传多样性分析。结果表明，14对引物共扩增得到 662个位点，其中多态性位点 619个，多态
性位点比例为 93.50%。太平洋牡蛎、近江牡蛎和褶牡蛎多态位点比例依次为 73.26%、70.54%和 75.08%，Nei氏基因多样性指
数分别为 0.256 9±0.197 7、0.226 1±0.195 2和 0.268 3±0.194 1，Shannon信息指数分别为 0.382 3±0.276 2、0.341 4±0.274 1和
0.398 8±0.270 9。上述结果表明，3个牡蛎群体的遗传多样性水平褶牡蛎最丰富，太平洋牡蛎次之，近江牡蛎最小。基因分化系数
Gst和基因流系数 Nm表明这 3个牡蛎群体之间存在一定的基因交流。UPGMA聚类分析表明，太平洋牡蛎和近江牡蛎先聚为一支，
而后与褶牡蛎聚在一起。
关键词： 太平洋牡蛎 近江牡蛎 褶牡蛎 遗传多样性 AFLP
Genetic Diversity Analysis of Three Oyster
Species Using AFLP Markers
Chen Zhiqiao Qiu Xuemei Yu Xurong Chang Yaqing Liu Yang Wang Xiuli
（College Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023）
Abstract: The genetic diversities of the sixty individuals from three oysters of Crassostrea gigas, Crassostrea rivularis and Crassostrea
plicatula, were analyzed by AFLP markers. In total, 619 polymorphic loci of 662 were amplified by 14 primer pairs and percentage of
polymorphic loci was 93.50%. For the three oysters of Crassostrea gigas, Crassostrea rivularis and Crassostrea plicatula, the percentage
of polymorphic loci were 73.26%, 70.54% and 75.08%, Nei’s gene diversity indexes were 0.382 3±0.276 2、0.341 4±0.274 1 and
0.398 8±0.270 9, and Shannon information indexes were 0.382 3±0.276 2、0.341 4±0.274 1 and 0.398 8±0.270 9, respectively. The results
suggested that Crassostrea plicatula has a higher level of the genetic diversities than the other two species, and Crassostrea rivularis shows the
lowest level of the genetic diversities. The gene differentiation coefficient （Gst） and gene flow index indicate that there was gene flow among these
three oysters. The UPGMA tree show that these three oysters were divided into two species ：Crassostrea gigas and Crassostrea rivularis was one
species, Crassostrea plicatula was another.
Key words: Crassostrea gigas Crassostrea rivularis Crassostrea plicatula Genetic diversity AFLP
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期192
少［5， 6］，本研究采用 AFLP 标记技术分析太平洋牡蛎
（Crassostrea gigas）、近江牡蛎（Crassostrea rivularis）
和褶牡蛎（Crassostrea plicatula）3 个群体的遗传多
样性和遗传结构，旨在了解我国牡蛎目前的种群现
状，为其种质资源的保护提供一些理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
太平洋牡蛎采自天津王顶堤养殖场，该养殖场
从日本引进了太平洋牡蛎 ；近江牡蛎采自海南省海
口山高鲜活水产品批发市场，依据牡蛎的外部形态
鉴定为近江牡蛎 ；褶牡蛎大连开发区自然海域，按
张玺［7］记录的标准进行区分，凡是形状上区分有困
难的个体，均不选用。每种随机取样 20 个，活体解
剖取闭壳肌，置 75% 乙醇中，-20℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 参照 Sambrook 和 Rus-
sell［8］用酚 - 氯仿提取法，提取基因组 DNA。将
提取的基因组 DNA 经 1% 的琼脂糖检测，紫外分
光光度计下测定 DNA 浓度，将 DNA 标定至 100
ng/μL，-20℃储存备用。
1.2.2 AFLP 分析
1.2.2.1 基因组 DNA 的酶切和连接 采用限制性内
切酶 EcoRⅠ和 MseⅠ双酶切基因组 DNA。酶切连接
体系为：DNA模板（100 ng/μL） 3 μL，T4 Buffer 1.25 μL，
EcoRⅠ（10 U/μL） 0.225 μL，MseⅠ（10 U/μL） 0.25 μL，
T4 DNA 连接酶（350 U/μL） 0.35 μL，BSA（1 mg/mL）
0.1 μL，ATP （100 mmol/L） 0.5 μL，EcoRⅠ 接 头 和
MseⅠ接头各 1 μL，补水至 12.5 μL，37℃消化 5 h 后，
65℃作用 20 min。
1.2.2.2 预选扩和选择性扩增 酶切连接产物用引
物 E+A、M+C 进行 PCR 预扩增，反应体系为 20 μL：
酶切连接产物 3 μL ，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP（2.5
mmol/L） 1.6 μL，MgCl2（25 mmol/L） 1.6 μL，E+A 和
M+C 引物各 1.0 μL，BSA（1 mg/mL） 0.1 μL，Taq酶
（5 U/μL） 0.12 μL，加水补足至 20 μL。PCR 反应程序：
95℃ 5 min ；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，20
个循环 ；72℃ 7 min。
表 1 接头、预扩增和选择性扩增引物序列
引物 序列（5-3） 引物 序列（5-3）
EcoR Ⅰ adapter CTCGTAGACTGCGTACC MseⅠ adapter GACGATGAGTCCTGAG
AATTGGTACGCAGTCTAC TACTCAGGACTCAT
E+A GACTGCGTACCAATTCA M+C GATGAGTCCTGAGTAAC
E1 GACTGCGTACCAATTCAAG M1 GATGAGTCCTGAGTAACAA
E2 GACTGCGTACCAATTCAAC M2 GATGAGTCCTGAGTAACAT
E3 GACTGCGTACCAATTCAGC M3 GATGAGTCCTGAGTAACAG
E4 GACTGCGTACCAATTCAGG M4 GATGAGTCCTGAGTAACAC
E6 GACTGCGTACCAATTCACT M5 GATGAGTCCTGAGTAACTA
E8 GACTGCGTACCAATTCACC M6 GATGAGTCCTGAGTAACTT
M7 GATGAGTCCTGAGTAACTG
M8 GATGAGTCCTGAGTAACTC
经过筛选，从 64 对 AFLP 选择性扩增引物中选
择了数目适中，条带清晰的 14 对引物组合（表 1），
对 3 个牡蛎群体进行选择性扩增。反应体系为 20
μL：预选扩产物 2 μL（稀释 50 倍），10×PCR Buffer
2 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 1.6 μL，MgCl2（25 mmol/L） 1.2
μL，E 引物 0.5 μL，M 引物 3 μL，Taq酶（5 U/μL）
0.12 μL，加水补足至 20 μL。PCR 反应程序 ：95℃
5 min ；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，12 个循
环，每个循环的退火温度从 65℃开始逐次降 0.7℃ ；
94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，23 个循环 ；然后
72℃ 7 min。
1.2.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 扩增产物经 6% 变性
聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺体积
比为 29 1，电泳 4 h （40 W），银染，扫描仪成像后
2012年第9期 193陈之桥等 ：三个牡蛎群体遗传多样性的 AFLP 分析
待分析。
1.2.3 数据分析 利用AFLP分析软件Cross Checker
version 2.91 进行条带统计，将每个条带作为一个位
点，有扩增条带且清晰记为 1，否则记为 0，构建 0/1
矩阵。利用 Popgene3.2 计算分析多态位点比例、Nei
氏基因多样性指数、Shannon 信息指数、遗传相似度
和遗传距离。
多态位点比例（%）：P= 多态位点数 / 位点总
数 ×100
Nei 氏基因多样性指数 ：H=1- ∑ Pi2，Pi 为位点
i 的基因频率。
Shannon 信息指数 ：I= - ∑ PiLnPi/N，Pi 为位点 i
的基因频率，N 为位点总数。
遗传相似度 ：S=2Nxy/（Nx+Ny），Nxy 为 x个体和
y个体所共有的位点数目，Nx、Ny 分别为 x个体和 y
个体所具有的位点数目。
遗传距离 ：D=1-S
并采用分子方差分析（AMOVA）方法进行种群
内及种群间的基因多样性、基因流系数和基因分化
系数计算。
群体间的基因多样性 ：Dst=Ht-Hs，Ht 为种群总
的遗传多样性，Hs 为群体内的基因多样性。
基因分化系数 ：Gst= Dst/Ht。
采用 Popgene3.2 软件的附带功能，用 UPGMA
法构建群体遗传关系聚类图。
2 结果
2.1 AFLP扩增结果
本研究选取 14 对引物组合对 3 个牡蛎群体共
60 个个体进行了 AFLP 分析，结果见表 2。各引物
组合的扩增结果间存在差异，产生的清晰扩增条带
数从 30-64 条不等，其片段大小介于 50-1 000 bp 之
间，多态检出率范围为 80.43%-100%。统计分析表
明，3 个牡蛎群体共得到 662 个清晰位点，619 个
多态位点，太平洋牡蛎、近江牡蛎和褶牡蛎的多态
位点分别为 485、467 和 497，其多态位点比例依次
为 73.26%、70.54% 和 75.08%。图 1 表示引物组合
E6/M3 在 3 个牡蛎群体中的扩增结果。
表 2 不同引物组合的扩增结果
引物组合 总扩增位点数 总多态位点数（多态位点比例（%））
多态位点数（多态位点比例（%））
太平洋牡蛎 近江牡蛎 褶牡蛎
E1/M1 45 41（91.11） 35（77.78） 35（77.78） 32（71.11）
E1/M3 64 64（100） 49（76.56） 50（78.12） 56（87.50）
E2/M3 48 44（91.67） 37（77.08） 33（68.75） 38（79.17）
E2/M8 52 51（98.08） 38（73.08） 34（65.38） 45（86.54）
E3/M2 63 62（98.41） 50（79.37） 43（68.25） 56（88.89）
E3/M4 39 37（94.87） 33（84.62） 30（76.92） 28（71.79）
E3/M5 30 25（83.33） 15（50） 16（53.33） 8（26.67）
E4/M7 46 37（80.43） 28（60.87） 28（60.87） 34（73.91）
E6/M1 46 41（89.13） 28（60.87） 24（52.17） 14（30.43）
E6/M3 50 44（88） 35（70） 36（72） 39（78）
E6/M6 42 42（100） 38（90.48） 37（88.1） 40（95.24）
E8/M1 44 40（90.91） 23（52.27） 24（54.55） 21（47.73）
E8/M2 44 43（97.73） 39（88.64） 37（84.09） 41（93.18）
E8/M8 49 48（97.96） 37（75.51） 40（81.63） 45（91.84）
合计 662 619（93.50） 485（73.26） 467（70.54） 497（75.08）
2.2 三个牡蛎群体的遗传多样性
3 个牡蛎群体的 AFLP 多样性分析结果见表 3。
在 3 个牡蛎群体中，褶牡蛎的 Nei 氏基因多样性指数
和 Shannon 信息指数最大，分别为 0.268 3±0.194 1
和 0.398 8±0.270 9，该结果与其多态性结果一致，
褶牡蛎与其他两种牡蛎相比，具有较高的遗传多样
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期194
性。各项多样性指标都显示，3 个牡蛎群体的多样
性大小顺序为 ：褶牡蛎＞太平洋牡蛎＞近江牡蛎。
2.3 三个牡蛎群体的遗传分化
Nei氏分子遗传学进化方法对3个牡蛎群体遗传
变异分析结果见表 4。太平洋牡蛎和近江牡蛎 Nei’s
总基因多样性 Ht 为 0.276 7±0.034 8，种群内基因多
样性 Hs 为 0.241 5±0.029 0，群体间的基因多样性 Dst
为 0.035 2 ；以此计算太平洋牡蛎和褶牡蛎，近江牡
蛎和褶牡蛎两群体间的基因多样性分别为 0.108 1 和
0.110 3，这表明 3 个种群之间的多样性主要来源
于太平洋牡蛎与褶牡蛎，近江牡蛎与褶牡蛎之
间，而太平洋牡蛎与近江牡蛎之间的多样性水
平低。
近江牡蛎与褶牡蛎，太平洋牡蛎与褶牡蛎，太
平洋牡蛎与近江牡蛎的基因分化系数分别为0.298 0、
0.291 5 和 0.127 3 ；基因流分别为 1.177、1.215 1 和
3.427 9。以上数据表明 ：太平洋牡蛎与近江牡蛎之
间的基因交流最大，两个群体间的分化度最低。
图 1 引物组合 E6/M3对三个牡蛎群体 60个
个体的扩增图谱
种群 多态性点数 多态性位点比例（%） Nei 氏基因多样性指数 Shannon 信息指数
太平洋牡蛎 485 73.26 0.256 9±0.197 7 0.382 3±0.276 2
近江牡蛎 467 70.54 0.226 1±0.195 2 0.341 4±0.274 1
褶牡蛎 497 75.08 0.268 3±0.194 1 0.398 8±0.270 9
总计 619 93.50 0.360 7±0.144 0 0.530 4±0.188 9
表 3 三个群体的扩增结果及遗传学参数
表 4 三个牡蛎群体的遗传分化
种群 总基因多样性（Ht） 种群间多样性（Hs） 基因分化系数 Gst 基因流系数 Nm
太 - 近 0.276 7±0.034 8 0.241 5±0.029 0 0.127 3 3.427 9
太 - 褶 0.370 7±0.022 5 0.262 6±0.023 3 0.291 5 1.215 1
近 - 褶 0.352 1±0.022 9 0.247 2±0.022 2 0.298 0 1.177
总群体 0.360 7±0.020 7 0.250 4±0.020 4 0.305 8 1.135
2.4 三个牡蛎群体的遗传距离及聚类分析
3 个牡蛎群体的遗传相似度及遗传距离，见
表 5。3 个牡蛎群体的遗传相似度大小范围为
0.707 0-0.907 3，最大值 0.907 3 出现在太平洋牡蛎
和近江牡蛎之间，而最小值 0.707 0 出现在太平洋牡
蛎和褶牡蛎之间；而遗传距离的大小范围为 0.097 3-
0.346 8，最大值 0.346 8 和最小值 0.097 3 分别出现
在太平洋牡蛎和褶牡蛎及太平洋牡蛎与近江牡蛎
之间。
采用 UPGMA 方法构建的群体遗传关系聚类图，
如图 2 所示。由图 2 可以看出，太平洋牡蛎和近江
牡蛎首先聚为一支，后该支再与褶牡蛎聚在一起。
群体 太平洋牡蛎 近江牡蛎 褶牡蛎
太平洋牡蛎 **** 0.907 3 0.7070
近江牡蛎 0.097 3 **** 0.7215
褶牡蛎 0.346 8 0.326 5 ****
上三角为遗传相似度 ；下三角为遗传距离
表 5 群体间遗传相似度及遗传距离
太 . 太平洋牡蛎 ；近 . 近江牡蛎 ；褶 . 褶牡蛎
2012年第9期 195陈之桥等 ：三个牡蛎群体遗传多样性的 AFLP 分析
3 讨论
3.1 三个牡蛎群体的遗传多样性水平
遗传多样性是生物多样性的基础，是评价自然
生物资源的重要依据，同时也是合理开发和利用自
然生物资源和种质资源的基础，了解物种的遗传多
样性对于物种的遗传育种和改良尤为重要。AFLP 技
术作为一种广泛用于种质鉴定和群体遗传多样性的
技术，在水产经济动物中也发挥着重要作用［9-13］。
本试验采用 AFLP 技术，从多态性位点比例、
Nei 氏基因多样性指数和 Shannon 信息指数等多角度
对太平洋牡蛎、近江牡蛎和褶牡蛎 3 种牡蛎的遗传
多样性进行了分析，结果表明，3 个牡蛎群体的总
多态性位点比例为 93.50%，而 3 种牡蛎的多态性位
点比例的分别为 73.26%、70.54% 和 75.08%。其中
褶牡蛎的多态性位点比例最高，近江牡蛎的最低，
该结果同 Nei 氏基因多样性指数和 Shannon 信息指
数的变化趋势一样。所有数据表明 ：3 个牡蛎群体
的遗传多样性水平仍处于较高水平，其种质资源现
状保持良好。其中褶牡蛎的遗传多样性最丰富，而
近江牡蛎最小。杨叶欣等［14］通过 RAPD 技术对两
个不同地理位置（湛江种群和阳江种群）的野生近
江牡蛎群体进行多样性分析，多态位点比例分别为
89.62% 和 89.57%。此数据表明杨叶欣对野生近江牡
蛎的多样性水平估计比本试验所用的养殖近江牡蛎
群体的遗传多样性水平均高。该结果表明，在人为
因素（人工繁育）等因素的影响下，我国牡蛎的遗
传多样性水平正处于下降趋势。因此在今后发展牡
蛎养殖和育种的同时，也要做好对牡蛎原种和良种
的保护工作。
3.2 三个牡蛎群体的亲缘关系和遗传分化
Thorp［15］通过分析研究认为 ：遗传相似系数
I<0.85 （遗传距离 Ds>0.15）的两种群不可能是同一
物种，同科属群体间 I为 0.1-0.5（Ds=0.5-0.9），同
种群体间 I为 0.8-0.97（Ds=0.03-0.2）。本试验中得
出了 3 个牡蛎群体之间的遗传相似度和遗传距离，
参照 Thorp 的标准，发现本试验所用的太平洋牡蛎
与近江牡蛎两个群体的遗传相似度为 0.907 30，而
与褶牡蛎遗传相似度为 0.346 8，根据这一结果表明
试验选用的太平洋牡蛎与近江牡蛎两个群体具有较
高的遗传相似性。
而根据 Wright［16］对 Gst 的定义，Gst 值介于 0-0.05
时，表明群体间遗传分化弱 ；介于 0.05-0.15 时，表
明群体间遗传分化中等 ；介于 0.15-0.25 时，表明
群体间遗传分化较大 ；当 Gst 值大于 0.25 时表明群
体分化极大。由表 4 可知，太平洋牡蛎与近江牡蛎
出现中等分化，而太平洋牡蛎与褶牡蛎，近江牡蛎
与褶牡蛎出现极大的分化。根据 Hamrick ［17］的观
点 ：当种群基因流系数 Nm>1 时，存在一定的基因
流动 ；如果 Nm>4，它们就是一个随机的单位 ；如果
Nm 远远小于 1，种群会被强烈的分化。本试验中均
为 1
9，表明这两个群体之间的基因交流强，遗传分化小。
而根据遗传分化系数和基因流我们判定本试验选用
的太平洋牡蛎和近江牡蛎的亲缘关系很近。
依据本研究选用的 3 个特定群体获得群体间的
遗传相似系数、遗传分化系数和基因流系数，在聚
类分析中得到太平洋牡蛎群体和近江牡蛎群体归为
一支，然后再褶牡蛎汇聚。结果说明太平洋牡蛎和
近江牡蛎的亲缘关系更近些。该结果与刘必谦［5］和
王青［6］等的结果都不同。刘必谦通过 RAPD 标记
分析近江牡蛎、太平洋牡蛎、大连湾牡蛎和褶牡蛎
的遗传结构，用平均法聚类时将太平洋牡蛎与褶牡
蛎先聚一支，而后再与近江牡蛎汇聚 ；而王青通过
AFLP 标记分析这四个种群，也用平均法聚类法，获
得近江牡蛎和褶牡蛎先汇为一支，然后与太平洋牡
蛎汇聚。由此可知，牡蛎的形态特征致使牡蛎的种
质鉴定很困难，需要今后采用多种分子标记进行深
入的研究。
4 结论
本研究利用 AFLP 技术对我国沿海海域的太平
洋牡蛎、近江牡蛎和褶牡蛎 3 个牡蛎群体的遗传多
图 2 三个牡蛎群体的 UPGMA聚类图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期196
样性进行分析，结果表明，我国牡蛎的遗传多样性
仍处于较高的水平，这 3 个牡蛎群体中太平洋牡蛎
与褶牡蛎，近江牡蛎与褶牡蛎的分化程度高，而太
平洋牡蛎与近江牡蛎的相似度高。3 个群体之间存
在一定的基因流动，其中太平洋牡蛎与近江牡蛎之
间的基因流动最大，该基因流动也会造成它们的遗
传多样性降低，所以保护牡蛎种质资源，开展牡蛎
原种和良种鉴定工作，对于我国未来的牡蛎养殖事
业尤为重要。
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（责任编辑 狄艳红）