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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
收稿日期:2010-10-11
基金项目:国家自然科学基金项目(31072224) ，辽宁省教育厅创新团队项目(LT2010012) ，大连市科技计划项目(2009J31SC034)
作者简介:谢三群，女，硕士研究生，研究方向:牡蛎溶菌酶分子生物学;E-mail:xiesanqun2008@ 163． com
通讯作者:丛丽娜，教授，E-mail:congln@ dlpu． edu． cn
太平洋牡蛎 i型溶菌酶基因的克隆与重组高效表达
谢三群 丛丽娜 张欢 王丹
(大连工业大学生物工程学院，大连 116034)
摘 要: 在双壳类软体动物牡蛎体内，溶菌酶(Lysozyme)在实现宿主免疫防御，破坏和消除侵入体内的病原中发挥着重
要的作用。根据 GenBank已有的太平洋牡蛎溶菌酶的全长 cDNA序列(GenBank:AB179775) ，通过 RT-PCR技术，从太平洋牡
蛎(Crassostrea gigas)中克隆得到溶菌酶(简称为 CgLys)基因的开放阅读框(open reading frame，ORF)序列。生物信息软件分
析表明，其 ORF为 414 bp，编码 137 个氨基酸(aa) ，前 20 个 aa为信号肽，成熟肽由 117 个 aa组成，其分子量为 13. 2 kD。通过
构建分子系统发育树对其同源性进行分析比较，初步推断该 CgLys属于 i型溶菌酶。将该 CgLys基因的成熟肽亚克隆进原核
表达载体 pET-32a(+)中，构建重组质粒 pET32a(+)-CgLys，再转化至大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS。该基因工程菌经 IPTG 诱导
发酵后，成功高效地表达了重组 CgLys蛋白，其分子质量约为 18 kD。该重组 CgLys蛋白主要存在于细菌裂解液的上清液中，
即以可溶性蛋白形式存在。上述结果将显著简化后续的蛋白纯化过程，为今后扩大规模生产牡蛎溶菌酶提供参考。
关键词: 无脊椎动物 太平洋牡蛎 i型溶菌酶 重组表达 纯化
Molecular Cloning and Recombinant Expression of i-type
Lysozyme from Oyster Crassostrea gigas
Xie Sanqun Cong Lina Zhang Huan Wang Dan
(School of Biology Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034)
Abstract: In bivalve mollusks including oysters，lysozymes play an important role in the host defense mechanisms against invading
microbes． Based on the full-length cDNA of C． gigas lysozyme in GenBank(GenBank:AB179775) ，the lysozyme gene with open reading
frame(ORF)from C． gigas was cloned by the RT-PCR method and named Cg-lysozyme(CgLys in short)． Bioinformatic software analysis
showed that the ORF with the length of 414 bp encoded 137 amino acids(aa) ，including a signal peptide of 20 aa and at N-terminus and
a mature peptide of 117 aa，and the molecular weight of the mature protein was of 13. 2 kD． Phylogenetic analysis showed that the lyso-
zyme from C． gigas clustered with the i-type lysozyme of other bivalve species． The DNA fragment of mature CgLys was subcloned into
pET-32a(+)expression vector to construct the recombinant plasmid of pET32a(+)-CgLys． Next，the recombinant plasmid was transformed
into Escherichia coli BL21(DE3)pLysS and then induced by isopropylthio-β-D-galactoside(IPTG)． As a result，a new anticipated fusion
protein of CgLys(ca． 18 kD)was strongly expressed on the gel of SDS-PAGE． Further analysis showed that the expressed fusion protein
existed as a soluble form． These results could simplify purification steps and facilitate the production of oyster lysozyme in a large scale．
Key words: Invertebrate C． gigas i-type lysozyme Recombinant expression Purification
溶菌酶［Lysozyme(EC 3. 2. 1. 17) ］是一种能水
解粘多糖的碱性酶，它能切断细菌细胞壁肽聚糖中
N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰氨基葡糖之间的 β-1，4 糖
苷键，导致细菌细胞壁破裂、内容物溢出，从而使细
菌死亡，因此它是一种广谱抗菌效应分子，广泛存在
于各种动植物微生物的细胞、组织和分泌液中［1］。
对于缺少特异性免疫的无脊椎动物来说，溶菌酶在
它们的先天免疫系统中的作用更为重要。此外，在
海洋无脊椎动物中，溶菌酶还有消化和滤食海洋细
菌的作用［2］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
目前，一般将溶菌酶分为 6类:鸡型溶菌酶，又称
c型溶菌酶(c-type) ;鹅型溶菌酶，又称 g 型溶菌酶
(g-type) ;植物溶菌酶;细菌溶菌酶;T4噬菌体溶菌酶;
无脊椎动物溶菌酶，又称 i 型溶菌酶(i-type)［3］。其
中 i型溶菌酶是溶菌酶家族的一个新成员，最初是由
Jolles［4］在海星(Asterias rubens)中发现的，近年来已
被广泛研究。在 GenBank数据库中有许多牡蛎的溶
菌酶核苷酸序列，且大多数属于 i 型溶菌酶，如食用
牡蛎(Ostrea edulis) (AB179776)［1］、美洲牡蛎(Cras-
sostrea virginica) (AB206328)［5］和太平洋牡蛎(C．
gigas) (AB179775)［1］等，但有关牡蛎溶菌酶基因工程
的研究还未见报道。本研究从太平洋牡蛎中提取总
RNA，对其编码溶菌酶基因的成熟蛋白基因片段进行
扩增，构建重组质粒 pET32a(+)-CgLys，再转化至大肠
杆菌细胞中进行诱导表达，旨在高效快速表达牡蛎溶
菌酶，为进一步开展新型海洋溶菌酶的功能研究与开
发应用奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株和质粒 大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS
购自天根生物技术公司;大肠杆菌 DH5α、克隆载体
pMD18-T购自 TaKaRa Biotechnology(大连)公司;表
达载体 pET-32a(+)购自 Novagen公司。
1. 1. 2 试剂与工具酶 T4 DNA 连接酶、Taq DNA
聚合酶、DNA ladder Marker、蛋白低分子量 Marker、
TaKaRa one step RNA PCR Kit(AMV)试剂盒均购自
TaKaRa Biotechnology(大连)公司;限制性核酸内切
酶购自 Fermentas公司;质粒提取和琼脂糖凝胶电泳
DNA回收试剂盒均购自天根生物技术公司;异丙基
硫代 β-D-半乳糖苷(IPTG)和 Trizol 试剂购自 In-
vitrogen公司;HisTrap HP购自 GE Healthcare公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 CgLys ORF 基因的克隆 将新鲜牡蛎无菌
搅碎并取样，根据 Trizol试剂说明抽提总 RNA。参照
已发表的太平洋牡蛎溶菌酶 cDNA 序列(登录号:
AB179775) ，设计一对用于扩增 CgLys 开放阅读框基
因的引物 ML-3 和 ML-4。ML-3:5-CTGTCTAAAG-
CACCAAGTAATC-3，ML-4:5-GCCTATACAGTTTA-
CACTTC-3，以提取的牡蛎总 RNA为模板，用 TaKa-
Ra one step RNA PCR Kit(AMV)进行 RT-PCR。
PCR扩增程序为:50℃ 30 min，94℃ 2 min;94℃ 30
s，40℃ 30 s，72℃ 2 min，5 个循环;94℃ 30 s，50℃
30 s，72℃ 2 min，28 个循环;72℃延伸 10 min。反应
结束后，经 1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，并将
目的条带回收纯化，备用。
1. 2. 2 用生物信息学方法对 CgLys 基因序列进行
分析 将 CgLys 的全长 cDNA 用 ORF Finder(ht-
tp:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /gorf /gorf． html)确定正
确的开放阅读框，并翻译成氨基酸序列;用 SignalP
3_0(http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /SignalP)来分
析 CgLys 的信号肽及切割位点;用 ProtParam(ht-
tp:/ / cn． expasy． org / tools /# translate)来预测序列的
分子式、分子量和等电点;将获得的 CgLys 的 cDNA
序列和其它动物不同类型溶菌酶序列进行 Clustal X
比对，然后用 MEGA程序作出溶菌酶的分子系统发
育树［6］。
1. 2. 3 CgLys成熟肽基因的扩增 根据克隆得到
的 CgLys ORF 基因序列和表达载体 pET-32a(+)克
隆位点两端的酶切识别序列，设计 1 对用于原核细
胞表达的特异性引物ML-5和 ML-6。ML-5:5-CAG-
GATCCGTTAAATGACCATATCTTCG-3，ML-6: 5-
TCGGGTCGACAATTAACTGTTCACAT-3。引物 5端
分别引入 BamH I和 Sal I酶切位点(下划线部分)。
以提取的牡蛎总 RNA 为模板，用 TaKaRa one step
RNA PCR Kit(AMV)进行 RT-PCR。PCR 扩增程序
为 50℃ 30 min，94℃ 2 min;94℃ 30 s，45℃ 30 s，
72℃ 2 min，5 个循环;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2
min，28 个循环;72℃延伸 10 min。反应结束后，经
1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，并将目的条带回
收纯化，备用。
1. 2. 4 重组质粒的构建 扩增的基因片段产物经
回收纯化后，与 pMD18-T载体相连接构建 pMD18T-
CgLys质粒，再转化至受体菌 E． coli DH5α，测序筛
选得到阳性克隆。用 BamH I和 Sal I酶切提取出的
重组质粒，回收目的基因片段，并定向克隆到经同样
限制性内切酶处理的 pET-32a(+)载体中，构建重组
质粒 pET32a(+)-CgLys。将该重组质粒和空白载体
pET-32a(+)同时转化至 BL21(DE3)pLysS 感受态
细胞中，并在含有 100 μg /mL 氨苄青霉素(Amp)的
LB琼脂平板培养基上 37℃过夜培养。分别挑取单
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2011 年第 4 期 谢三群等:太平洋牡蛎 i型溶菌酶基因的克隆与重组高效表达
菌落接种于含 Amp 的 LB 液体培养基中，37℃振荡
培养 14 － 16 h。提取重组质粒，PCR 及酶切检测鉴
定。选择酶切和 PCR 鉴定为阳性的重组质粒进行
序列测定，验证重组质粒读码框的正确性。
1. 2. 5 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及纯化
挑取测序验证正确的重组质粒和阴性对照空载体
转化的阳性菌株，分别接种于含 100 μg /mL Amp 的
LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。次日以 1∶ 50
稀释扩大培养，37℃振荡培养至 OD600达 0. 6 － 0. 8，
加入 IPTG(终浓度为 1. 0 mmol /L)30℃诱导培养
3 h。最后采用 15% SDS-PAGE 检测重组蛋白是否
表达。
收集诱导后表达菌体，用磷酸盐缓冲液(PBS)
洗涤两次，最后菌体重悬于 10 mL 1 × PBS(pH7. 4)
缓冲液中。置冰浴中超声裂解，功率 400 W，超声 1
s后间歇 3 s，共处理 10 min。4℃，10 000 r /min 离
心 10 min，分别取上清液和沉淀进行 SDS-PAGE 检
测。收集上清液，4℃保存备用。
准备 1 mL HisTrap HP cloumn，用 10 倍柱体积
的结合缓冲液平衡。然后将处理的上清液以约
1. 0 mL /min 的流速上样，再用 10 倍柱体积的结合
液洗柱，最后用 8 倍柱体积的洗脱液(150 mmol /L
咪唑、20 mmol /L 磷酸钠溶液、500 mmol /L NaCl，
pH7. 4)洗脱目的蛋白，收集并取样进行 SDS-PAGE
检测。
2 结果与分析
2. 1 CgLys ORF基因的扩增及序列分析
以提取的牡蛎总 RNA为模板，采用特异性引物
ML-3 和 ML-4 进行 RT-PCR 扩增，最后得到长度约
500 bp的 DNA片段(图 1) ，与预期大小基本一致。
经测序分析验证，扩增的基因片段长度为 475 bp，包
含了完整的 CgLys基因 ORF。生物信息软件分析表
明，它的 ORF 为 414 bp，编码 137 个氨基酸，前 20
个氨基酸为信号肽，成熟肽由 117 个氨基酸组成，其
分子量为 13. 2 kD，理论等电点为 8. 65。
通过与 GenBank中的同源序列比较，与 Matsu-
moto T等在基因库登录(登录号:AB179775)的太平
洋牡蛎的溶菌酶的一致性达到 97%，说明该 CgLys
ORF基因的扩增成功。
1． CgLys ORF 序列扩增产物;2． 阴性对照;
M． 100 bp DNA ladder Marker
图 1 RT-PCR扩增 CgLys ORF序列
2. 2 溶菌酶的分子进化分析
根据基因库中报道的双壳贝类和其它生物的溶
菌酶序列，利用 MEGA 4. 0 软件构建溶菌酶的进化
树(图 2)。从图 2 可以看出，不同动物中的溶菌酶
可以分为 3 大群体，分别为 i 型溶菌酶、c 型溶菌酶
和 g型溶菌酶。虽然 i型溶菌酶在进化上是一个独
立的分支，但它和 c型溶菌酶属于同一个大家族，来
源于同一个祖先。图中 CgLys* 代表的是本研究扩
增得到的 CgLys ORF 基因，它在进化树中与 i 型溶
菌酶同源性较高，因此初步推断 CgLys 属于 i 型溶
菌酶。
2. 3 CgLys 成熟肽基因的扩增与重组表达质粒的
构建
通过分析 CgLys成熟肽和 pET-32a(+)载体多克
隆位点上的酶切位点，选择 BamH I 和 Sal I 为酶切
位点设计表达特异性引物 ML-5 和 ML-6，经 RT-
PCR得到了长度为 382 bp的扩增产物，与预期大小
基本一致。将已得到的 pMD18T-CgLys 质粒用限制
性内切酶 BamH I和 Sal I 双酶切，连接到经同样限
制性内切酶双酶切的 pET-32a(+)载体，转化至 E．
coli DH5α。经 PCR 检测，在 400 bp 附近呈现预期
片段大小的 PCR 条带，再提取该质粒进行单、双酶
切鉴定，结果(图 3)出现与空白载体和目的片段大
小一致的条带，表明重组表达质粒构建成功，最后该
质粒进行测序验证其正确性。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
图 2 根据不同物种的溶菌酶序列
构建系统进化树
M1. 1 kb DNA ladder Marker;1． 重组质粒 pET32a
(+)-CgLys;2．重组质粒经 BamH I酶切;3．重组质粒
经 Sal I 酶切;4． 重组质粒经 BamH I 和 Sal I 双酶
切;M2. 100 bp DNA ladder Marker
图 3 重组质粒 pET32a(+)-CgLys酶切鉴定
2. 4 重组 CgLys蛋白在大肠杆菌中的高效诱导表达
将构建的重组 CgLys 基因工程菌，即 pET32a
(+)-CgLys /E． coli BL21(DE3)pLysS，和阴性对照菌
株 pET32a(+)/E． coli BL21(DE3)pLysS，在摇瓶中
首先进行了小规模诱导表达。经 SDS-PAGE 检测显
示，与空白载体对照和诱导前对照样品比较，该工程
菌株诱导后的样品在约 18 kD左右产生了 1 条明显
的特异性电泳带(图 4) ，其分子量和理论计算值相
吻合。经软件 Bandscan 5. 0 分析，该目的蛋白约占
菌体总蛋白的 33%，这证明该重组 CgLys 在大肠杆
菌中得到高效表达。接着进行 20 mL发酵液的诱导
表达，并将表达后的发酵液离心收集菌体，用超声破
碎菌体，破碎后的上清液和沉淀分别经 SDS-PAGE
检测，发现该目的蛋白主要存在于上清液中(约占
重组蛋白总量的 80%左右) ，而沉淀中其含量很少，
这说明重组 CgLys蛋白表达后主要以可溶性形式存
在。本研究表达的重组 CgLys的 N端包含一个 6 ×
His的标签，所以该目的蛋白可以用 Ni2 + -NTA 亲和
层析柱进行纯化。将含有目的蛋白的上清液通过
Ni2 + -NTA亲和层析柱，得到纯化后的目的蛋白。经
检测，纯化后的目的蛋白在 18 kD 处出现单一的电
泳带(图 5) ，进一步证明重组 CgLys蛋白表达成功。
M．蛋白质分子量标准;1．阴性对照;2 － 5．未经 IPTG诱导的菌
株;2 － 5．经过 IPTG诱导的菌株
图 4 含有重组质粒的不同菌株及阴性
对照菌株的诱导表达
3 讨论
溶菌酶作为机体内重要的非特异免疫因子之
一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和
非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的作用［7］。
对于缺少特异性免疫的海洋无脊椎动物而言，抗菌
效应尤为重要。已报道的水生动物重组溶菌酶抗菌
谱与鸡蛋清溶菌酶等的有所不同，它不但能溶解革
兰氏阳性菌，还能溶解革兰氏阴性菌［8］，包括贝类
养殖业中常见致病菌弧菌和假单胞菌［9，10］。因此，
031
2011 年第 4 期 谢三群等:太平洋牡蛎 i型溶菌酶基因的克隆与重组高效表达
重组水产动物溶菌酶有可能应用于水生动物的病害
防治，减少或替代水产养殖过程中化学药物的使用。
本研究对重组 CgLys 的成功高效率表达，为改善和
防治我国牡蛎养殖中致病菌的侵害具有重要意义。
M．蛋白质分子量标准;1．未经 IPTG诱导的菌株;2． 经过 IPTG
诱导的菌株;3． 菌株被破碎后的上清;4． 菌株被破碎后的沉
淀;5．经纯化的目的蛋白
图 5 重组 CgLys的表达与纯化的 SDS-PAGE检测
本研究通过分子系统发育分析，初步推断该
CgLys ORF基因属于 i 型溶菌酶。根据对多种海洋
贝类溶菌酶的氨基酸序列和结构特征分析证明［2］，i
型溶菌酶是溶菌酶在海洋无脊椎动物尤其是双壳类
动物中的一大分支。通过我们对海参 i型溶菌酶的
研究发现［11］，与对虾 c 型溶菌酶［3］和鱼类 g 型溶菌
酶［12］相比较，海参 i 型溶菌酶具有酶活性高和抗菌
谱广的特点，尤其对海洋环境中和水产养殖中常见
的致病菌(弧菌、假单胞菌等)具有明显的抑菌能
力。牡蛎是海洋双壳类无脊椎动物的典型代表，由
于其生长环境和自身免疫系统的特点，其溶菌酶可
能具有某些独特的功能，从而在海洋生物免疫、水产
养殖、新鲜海产品和水产品的保鲜方面具有研究和
开发价值。
本研究实现了 CgLys 基因在大肠杆菌中的高
效可溶性表达。大肠杆菌作为外源性基因表达的
宿主菌，生长快、易发酵、可快速生产，是获得大量
重组蛋白较为理想的表达系统［13］。但是，在大肠
杆菌中表达的真核蛋白由于缺少修饰和糖基化、
磷酸化等翻译后加工能力，常形成不溶性的包涵
体，欲使其具有活性需进行复杂的复性处理。虽
在前期用于细菌培养的材料价格低廉，适于工业
化生产，但其后期的复性处理不仅操作复杂，而且
成本昂贵，这是目前原核表达生产外源蛋白实现
工业化生产的一个瓶颈。近年来，人们尝试用基
因工程技术获得大量的溶菌酶来满足试验和生产
需要。有关表达重组溶菌酶的报道较多，但无论
是采用原核表达系统，还是采用真核表达系统，其
表达量及可溶性都不理想。蛋白质可溶性表达的
优点在于纯化方便、避免蛋白酶降解、保持蛋白 N
端氨基酸序列和蛋白结构的正确性［14］，因此，蛋白
质可溶性表达更符合于工业化生产的需要。本研
究所采用的 pET-32a(+)载体为一种原核融合表达
载体，它在外源蛋白两端各融合表达一个 6 × His
的标签，用于外源蛋白的纯化。由于 CgLys的信号
肽序列不能被大肠杆菌所识别，因此在设计表达
引物时，去除了信号肽序列和非编码区序列，并在
下游引物中加入了大肠杆菌强终止子 TAA 以避免
通读和产生超长蛋白，提高表达产量。结果经分
析表明，重组 CgLys 基因在 IPTG 诱导 3 h，表达量
占总蛋白的 30%以上，而且表达的目的蛋白主要
以可溶性形式存大，大大简化了后续蛋白纯化过
程和难度。因此，进一步优化该工程菌的诱导条
件，将有望实现牡蛎溶菌酶的工业化生产，大大提
高我国溶菌酶的生产量，改善目前我国溶菌酶供
应不足的现状。
参 考 文 献
［1］Matsumoto T，Nakamura AM，Takahashi KG． Cloning of cDNAs and
hybridization analysis of lysozymes from two oyster species，Cras-
sostrea gigas and Ostrea edulis． Comp Biochem Physiol B Biochem
Mol Biol，2006，145(3-4) :325-30．
［2］邹慧斌，宋林生，胥炜，等．海湾扇贝 g型溶菌酶基因 cDNA的克
隆与分析．高技术通讯，2005，15(7) :101-106．
［3］卜兴江，杜欣军，周文杰，等．中国明对虾溶菌酶基因克隆、重组
表达与性质分析．生物工程学报，2008，24(5) :723-732．
［4］ Jollès J，Jollès P． The losozyme from Asterias rubens． Eur J Biochem，
1975，54(1) :19-23．
［5］ Itoh N，Xue Q，Li Y，et al． cDNA cloning and tissue expression of
plasma lysozyme in the eastern oyster，Crassostrea virginica． Fish
Shellfish Immunol，2007，23(5) :957-968．
［6］杨西建，丛丽娜，路美玲，等．海参 i型溶菌酶基因及其编码产物的
结构特点．中国生物化学与分子生物学报，2007，23(7) :542-547．
131
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
［7］王兴强，曹梅，阎斌伦．水产动物溶菌酶研究概况．渔业现代化，
2006(2) :43-44．
［8］郑清梅，吴锐全，叶星．水生动物溶菌酶的研究进展．上海水产大
学学报，2006，15(4) :483-486．
［9］吴后波，潘金培．弧菌属细菌及其所致海水养殖动物疾病．中国
水产科学，2001，8(1) :89-93．
［10］王秀霞，丛丽娜，王丹，等．海刺参 i 型溶菌酶基因的重组表达
及抑菌谱分析．生物工程学报，2009，25(2) :189-194．
［11］Cong L，Yang X，Wang X，et al． Characterization of an i-type lyso-
zyme gene from the sea cucumber Stichopus japonicus，and enzymat-
ic and nonenzymatic antimicrobial activities of its recombinant pro-
tein． J Biosci Bioeng，2009，107(6) :583-8．
［12］Nilsen IW，Myrnes B． The gene of chlamysin，a marine invertebrate-
type lysozyme，is organized similar to vertebrate but different from
invertebrate chicken-type lysozyme genes． Gene，2001，269(1-2) :
27-32．
［13］聂新民，肖炳一，李小玲，等． 新克隆的硝基还原酶基因 NOR1
的表达及其产物的纯化．癌症，2003，22(2) :136-139．
［14］高闪电，常惠芸，独军政，等．一种高效、稳定的可溶性原核表达
载体的构建及应用．华北农学报，2009，24(6) :46-49．
(责任编辑 李楠
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 115 页)
有 pGM-CSF 目的基因和荧光蛋白报告基因的质粒
pIRES2-EGFP-pGM-CSF。它的应用可以使转染细
胞同时表达 pGM-CSF和绿色荧光蛋白，所以它不仅
能导入外源性 pGM-CSF，而且可利用荧光蛋白的表
达对转染结果进行直观、及时的观察和检测。
本研究中克隆的猪 pGM-CSF包含起始密码子、
终止密码子和信号肽。信号肽的存在保证了表达产
物正常分泌到胞外。在此基础上构建的猪 pGM-
CSF基因真核表达载体经酶切鉴定、序列分析完全
正确，并在山羊胎儿成纤维细胞上验证了该载体的
有效性，为进一步研究 pGM-CSF 蛋白的表达、纯化
及作为高档疫苗佐剂的制备奠定了基础。
参 考 文 献
［1］Metcalf D． The molecular biology and functions of the granulocyte-
macrophage colony-stimulating factors． Blood，1986，67 (2 ) :
257-267．
［2］Barouch DH，Santra S，Tenner-Racz K，et al． Potent CD4 + T cell re-
sponses elicited by a bicistronic HIV-1 DNA vaccine expressing
gp120 and GM-CSF． The Journal of Immunology，2002，168:
562-568．
［3］Cho JH，Lee SW，Sung YC． Enhanced cellular immunity to hepatitis
C virus nonstructural proteins by codelivery of granulocyte macro-
phage-colony stimulating factor gene in intramuscular DNA immuni-
zation． Vaccine，1999，17(9-10) :1136-1144．
［4］Ou-Yang P，Hwang LH，Tao MH，et al． Codelivery of GM-CSF gene
enhances the immune responses of hepatitis C viral core protein-ex-
pressing DNA vaccine:role of dendritic cells． Journal of Medical Vi-
rology，2002，66(3) :320-328．
［5］ Inumaru S，Takamatsu H． cDNA cloning of porcine granulocyte-mac-
rophage colony-stimulating factor． Immunology and Cell Biology，
1995，73:474-476．
［6］宋勤叶，杨汉春，郭鑫，等．猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 cD-
NA 的克隆与序列分析． 农业生物技术学报，2004，12(5) :
526-529．
［7］杨恒，文心田，曹三杰，等． 猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
(pGM-CSF)基因的克隆与原核表达． 农业生物技术学报，2009，
17(2) :206-211．
［8］Jackson RJ，Howell MT，Kaminski A． The novel mechanism of initia-
tion of picornavirus RNA translation． Trends Biochem Sci，1990，15
(12) :477-483．
(责任编辑 李楠)
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