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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):214-221
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）对
多种鳞翅目、鞘翅目害虫具有杀虫活性，由于杀虫
谱窄无污染等特点，是目前世界上应用最广泛的微
生物杀虫剂。另外，在转基因作物中 Bt 基因也得到
了广泛的应用。2014 年，全球转基因作物种植面积
达到 1.815 亿 hm2，其中，转 Bt 基因作物种植面积
为 7 000 万 hm2［1］。随着转基因农作物的迅猛发展，
转基因作物的安全性评价备受关注，其中最受关注
收稿日期 ：2015-03-16
基金项目 ：转基因生物新品种培育重大专项（2014ZX08012-003）
作者简介 ：李欣竹，女，硕士，研究方向 ：转基因生物安全评价 ；E-mail ：sandrabamboo@126.com
通讯作者 ：张杰，男，博士，研究员，研究方向 ：生防微生物功能基因 ；E-mail ：jzhang@ippcaas.cn
高继国，男，博士，教授，研究方向 ：分子生物学与生物化学 ；E-mail ：gaojiguo1964@hotmail.com
Cry1Ie 蛋白的模拟胃肠液消化稳定性及热稳定性分析
李欣竹1，2  耿丽丽2  高继国1  张杰2 
（1. 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030 ；2. 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）
摘 要 ： Cry1Ie 蛋白对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）具有高毒力，cry1Ie 基因已经应用于转基因抗虫玉米的种质创制。为
评价 Cry1Ie 蛋白的食用安全性，开展了 Cry1Ie 蛋白的消化及热稳定性研究。利用实验室已经构建的表达载体，在大肠杆菌中表达
了分子量为 81 kD 的可溶性 Cry1Ie 蛋白，经过 Ni-NTA 亲和层析和 Superdex-75 分子筛层析获得纯度达 91％蛋白。模拟消化液实验
结果表明，Cry1Ie 蛋白在模拟胃肠液中 15 s 内即被消化，SDS-PAGE 未检测到蛋白残留。热稳定性实验中，Cry1Ie 蛋白在玉米粉提
取液中不稳定，100℃ 30 min 内蛋白基本降解。对样品进行了生物活性测定发现，经模拟胃肠液消化处理和热处理后的 Cry1Ie 蛋
白对亚洲玉米螟无杀虫活性。Cry1Ie 蛋白在胃肠液系统中和热处理条件下均不稳定，并丧失了对亚洲玉米螟的杀虫活性。
关键词 ： 转基因玉米 ；Cry1Ie 蛋白 ；消化稳定性 ；热稳定性 ；杀虫活性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.028
Analysis of Digestive Stability in Simulative Digestive Tract Fluid and
Heat Stability of Cry1Ie Protein
Li Xinzhu1，2 Geng Lili2 Gao Jiguo1 Zhang Jie2
（1. Northeast Agricultural University College of Life Science，Harbin 150030 ；2. The National Key Laboratory of Plant Diseases and Insect
Pests，Beijing 100193）
Abstract: Due to the high virulence to Asian corn borer（Ostrinia furnacalis）of Cry1Ie, this protein had applied into the germplasm
creating of transgenic insect-resistant maize. To evaluate the food safety of Cry1Ie protein, this study carried out the digestion and heat stability
assays. Using the expressing vector which the laboratory has constructed, the Cry1Ie protein（81 kD）was expressed in Escherichia coli, and
the high purity protein was obtained using Ni-NTA chromatography and Superdex-75 size-exclusion chromatography. The results of artificial
digestion assay showed that Cry1Ie was degraded rapidly within 15 s in simulated gastric fluid and intestinal fluid, without any peptide left in
SDS-PAGE. In the heat stability assay, Cry1Ie was not stable in the extracting solution of maize meal, and most was degraded within 30 min
under 100℃. In the bioassay of the Asian corn borer（Ostrinia furnacalis）, it suggested that Cry1Ie lost the bio-activity after the treatment of
digestion and heat. In conclusion, Cry1Ie was not stable in the gastrointestinal fliud and the heat treatment, which had lost the bio-activity to the
Asian corn borer（Ostrinia furnacalis）.
Key words: transgenic ；Cry protein ；digestive stability ；heat stability ；insect-resistance
2015,31(11) 215李欣竹等 ：Cry1Ie 蛋白的模拟胃肠液消化稳定性及热稳定性分析
的还是食用安全性问题。Cry 蛋白只有在靶标害虫
的碱性消化道内与其中肠上皮细胞的特异蛋白受体
结合才能起到杀虫作用［2］，而其他非靶标生物体内
都被证明没有这种特异性蛋白质受体［3］。即使非靶
标生物进食了上千或上万倍的对靶标昆虫产生急性
毒性反应的剂量时，也不会产生任何不良反应［4］。
在典型食物蛋白加工的过程中，经常会加热到 95-
100℃，尽管这样的高温并不会改变蛋白作为膳食氨
基酸来源的营养价值，但是可导致不可逆转的变性
并使蛋白质功能丧失［5］。美国孟山都公司对 Cry1Ac
蛋白进行了消化稳定性实验，他们指出，Cry1Ac 蛋
白核心片段（57.8 kD）在模拟胃肠也中极其不稳定，
并且该蛋白不会以完整或小肽的形式进入单胃哺乳
动物小肠［6］。另外，Xu 等［7］在对 Cry1Ab/Ac 融合
蛋白进行模拟胃肠液消化和小鼠饲喂后，也证明了
其作为人类食物和动物饲料的安全性。
cry1Ie基因是由本实验室发现并克隆的具有自主
知识产权的模式基因［8］，其编码蛋白只有 81 kD［9］，
不同于大多数 Cryl 类蛋白的 130 kD。该基因的另一
个特点是在 Bt 菌株中多数是沉默的，而在大肠杆菌
中却能过表达［10］。Cry1Ie 蛋白对小菜蛾（Plutella
xylostella）、 亚 洲 玉 米 螟（Ostrinia furnacalis） 及 大
豆食心虫（Leguminivora glycinivorella）均有很强杀
虫活性［11］，并且该蛋白与商业化种植 Bt 作物中的
Cry1Ab 和 Cry1Ac 蛋白无交互抗性，具有巨大的应
用价值［12］。中国农业科学院植物保护研究所与中国
农业科学院作物科学研究所合作，将 cry1Ie 基因应
用于抗虫玉米的培育［13，14］，目前已经进入生产性试
验阶段。除了对亚洲玉米螟有显著的防治效果，对
Cry1Ac 抗性棉铃虫品系也具有杀虫活性［15］。
针对具有巨大应用价值和商业化前景的 Cry1Ie
蛋白，本研究在大肠杆菌表达系统中将其进行表达、
提取和纯化。对 Cry1Ie 蛋白进行热稳定性和消化稳
定性评价，并且分析处理后该蛋白对亚洲玉米螟的
杀虫活性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒 克隆载体、细菌表达载体 pET-
21 b，感受态细胞 DH5α、Rossetta 菌株由本实验室
提供。
1.1.2 试剂 各种抗生素均购自美国 Amresco 公司 ；
常规化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
酪蛋白（α-casein）、大豆胰蛋白酶抑制剂（Soybean
trypsin inhibitor，STI）、 胃 蛋 白 酶（Pepsin）、 胰 蛋
白酶（Trypsin），均购自 Solarbio 公司 ；亚洲玉米螟
（Ostrinia furnacalis）、人工饲料由中国农业学院植物
保护研究所玉米害虫组提供。
1.1.3 模拟胃消化液（Simulated gastric fluid，SGF）
本标准中采用的胃蛋白酶（Pepsin）活力≥ 3 000
U/mg。
根据公式（1）计算 100 mL 模拟胃液中的胃蛋
白酶的添加量 ：
A=
19×B
5×106
………………………………… （1）
式中，A ：胃蛋白酶添加量，单位为毫克（mg）；B ：
胃蛋白酶活力，单位为单位活力每毫克（U/mg）。
称取 0.2 g 氯化钠（NaCl）和 A mg 胃蛋白酶，
加入 70 mL 重蒸馏水，加入 730 μL 盐酸，再用盐酸
调 pH 至 1.2，加水定容至 100 mL。现用现配。
1.1.4 模拟肠消化液（Simulated gastric fluid，SIF）
称取 0.7 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于 25 mL 重蒸
馏水中，振荡使之完全溶解，加入 19 mL 0.2 mol/L
氢氧化钠溶液和 40 mL 重蒸馏水，加入 1.0 g 胰蛋白
酶，用 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液调 pH 至 7.5，加重蒸
馏水定容至 100 mL。现用现配。
样品蛋白溶液（2 g/L）：称取 2 mg 样品蛋白，
定容于 1 mL 重蒸馏水中，混匀。
1.1.5 玉米粉提取液 将非转基因玉米粉在液氮中
磨成细粉，称取 0.1 g，加入 1 mL 重蒸水，混匀后
13 500×g、4℃离心 5 min，取上清。
1.2 方法
1.2.1 蛋白表达与表达条件的优化 挑取阳性克隆
接种于含有氨苄青霉素和氯霉素的 5 mL LB 液体培
养基中，37℃、220 r/min 培养 6 h，以 1% 的比例接
种于 300 mL 的 LB 液体培养基中，37℃、220 r/min
进 行 培 养。 当 OD600 值 达 到 0.5 左 右 时， 加 入 0.1
mmol/L IPTG，在 18℃、150 r/min 条件下诱导 12 h。
8 000 r/min 离心 10 min 收集菌体。将菌体再次悬浮
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11216
于 30 mL 的缓冲液 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中，
利用超声波破碎菌体（宁波新芝 SCIENTZ II-D），功
率 45%， 工 作 3 s， 暂 停 5 s， 共 超 声 破 碎 5 min。
10 000 r/min 离心 20 min，分别收集上清和沉淀，然
后通过 SDS-PAGE 电泳检测目标蛋白。在此基础上，
挑取部分阳性菌株，通过改变 IPTG 的浓度（0.1、
0.5、1 和 1.0 mmol/L）以及诱导表达的温度（18 和
30℃），寻找最佳的目标蛋白表达条件。
1.2.2 目的蛋白的纯化 准备 5 mL 的镍柱，首先用
无菌水清洗 Ni-NTA 柱（5 倍柱体积），然后用上样
缓冲液 I（50 mmol/L Na2CO3，pH 10.5，含 50 mmol/L
咪唑、0.5 mol/L NaCl）进行平衡（5 倍柱体积）。加
入 10 mL 的蛋白，反复上样 4 次。用上样缓冲液 I
洗脱未结合的蛋白（5 倍柱体积）。用同样体积的
含有 250 mmol/L 咪唑的缓冲液（50 mmol/L Na2CO3，
pH10.5， 含 有 0.5 mol/L NaCl） 洗 脱 目 的 蛋 白。 用
500 mmol/L 咪 唑 的 缓 冲 液（50 mmol/L Na2CO3，pH
10.5，含有 0.5 mol/L NaCl）清洗残余的蛋白，SDS-
PAGE 检测纯化效果。
1.2.3 模拟胃液稳定性测定 向无菌 1.5 mL 离心管
中加入 18 μL 模拟胃消化液，37℃恒温水浴 5 min。
分别加入 2 μL 样品蛋白（5 mg/mL）、模拟胃液空白
对照、不稳定对照蛋白（5 mg/mL 酪蛋白）、稳定对
照蛋白（5 mg/mL 大豆胰蛋白酶抑制剂），迅速漩涡
振荡并快速置于 37℃水浴，在每个反应时间点，迅
速加入 10 μL 1.5 mol/L 碳酸钠溶液，冰浴，加入 7.5
μL 5×SDS-PAGE 蛋白样品上样缓冲液，沸水浴加热
5 min，取出后 13 500×g 离心 5 min，冷却至室温进
行 SDS-PAGE 检测。蛋白反应时间依次为 0 和 15 s，
1、2、5、10、30 和 60 min。不稳定对照酪蛋白反
应时间为 2 min，稳定对照 STI 反应时间为 1 h。胃
蛋白酶对照组为不含胃蛋白酶的模拟胃液，其他步
骤同上。
1.2.4 模拟肠液稳定性测定 在已灭菌的 1.5 mL
离 心 管 中 加 入 18 μL 模 拟 肠 消 化 液（SIF） 溶 液，
37℃恒温水浴 5 min。分别加入 2 μL 样品蛋白（2
mg/mL）、模拟肠液空白对照、不稳定对照蛋白（2
mg/mL 酪蛋白）、稳定对照蛋白（2 mg/mL 大豆胰
蛋白酶抑制剂），漩涡振荡后快速置于 37℃水浴
中，在每个反应时间点立即加入 5 μL 5×SDS-PAGE
蛋白样品上样缓冲液，沸水浴加热 5 min，取出后
13 500×g 离心 5 min，冷却至室温进行 SDS-PAGE
检测。反应时间点依次为 0 和 15 s、1、2、5、10、
30 和 60 min。不稳定对照酪蛋白反应时间为 2 min，
稳定对照 STI 反应时间为 1 h。胰蛋白酶对照组为不
含胰蛋白酶的模拟肠液，其他步骤同上。
1.2.5 热稳定性测定 将目的蛋白干粉分别用超纯
水和玉米粉提取液中溶解后在沸水浴中加热，在反
应时间点取出 20 μL，立即加入 5 μL 5×SDS-PAGE
蛋白样品上样缓冲液，沸水浴加热 5 min，取出后
13 500×g 离心 5 min，冷却至室温进行 SDS-PAGE
检测。反应时间依次为 15 s、1、2、5、10、30 和
60 min。
1.2.6 亚洲玉米螟生物活性测定 亚洲玉米螟选用
初孵幼虫，称取 30 g 人工饲料置于灭菌培养皿中，
加入 3 000 μL 待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，
室温放置，使饲料多余水分蒸发。将全部饲料分装
于 3 个一次性培养皿中（直径 =5 cm）。用毛笔轻轻
接入幼虫，每培养皿接 30 头虫，每个处理重复 3 次，
接虫后以 2 层卫生纸严格密封，防止幼虫逃逸。放
置 25℃光照培养箱中培养。每日监测培养箱中温度
与湿度，湿度 <30% 时，及时添加蒸馏水以保持湿度。
每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉
变，是否有水蒸气凝结。7 d 分别调查死、活虫数，
计算死亡率、校正死亡率。实验样品分别为模拟胃
液 37℃消化 15 s、模拟肠液 37℃消化 1 h、超纯水
中 100℃放置 1 h、玉米叶片提取液中 100℃放置 30
min。对照组分别为 Cry1Ie 原蛋白阳性对照 2 μg/g 和
5 μg/g、模拟胃液对照、模拟肠液对照、超纯水对照、
玉米粉提取液对照。
1.2.7 SDS-PAGE 分 析 取 蛋 白 样 品 进 行 制 样，
100℃煮沸 10 min，13 000×g 离心 10 min，取上清
点样，4% 浓缩胶，10% 分离胶，80 V 电泳 20 min，
150 V 电泳直到胶底边缘。电泳结束后取出凝胶，
进行脱色、染色及扫描图谱，参见萨姆布鲁克等［16］
的方法。
2 结果
2.1 Cry1Ie蛋白提取及表达条件的确定
通过在不同温度条件和不同浓度的 IPTG 诱导，
2015,31(11) 217李欣竹等 ：Cry1Ie 蛋白的模拟胃肠液消化稳定性及热稳定性分析
结果发现，在 30℃时诱导 Cry1Ie 蛋白表达量明显低
于 18℃，在 18℃时 0.1 mmol/L IPTG 诱导培养条件
下，Cry1Ie 重组蛋白的表达量最高（图 1-A，泳道 1）。
最终选择 18℃、0.1 mmol/L IPTG、150 r/min 诱导 12
h 作为该蛋白提取的最优条件。
有被完全降解（图 3-B，泳道 2），说明了该消化体
系的稳定性及有效性。
2.4 Cry1Ie蛋白在模拟肠液中的稳定性
Cry1Ie 蛋白在模拟肠液中不稳定，在 15 s 内
可被消化，只有少量的抗蛋白酶核心片段蛋白没有
被消化（图 4）。不稳定对照酪蛋白在模拟肠液中 2
min 后被降解（图 4，泳道 9），稳定对照 STI 在 1 h
内没有被降解（图 4，泳道 12），说明了该消化体系
的稳定性及有效性（图 4，泳道 9-13）。
2.5 Cry1Ie蛋白热稳定性
Cry1Ie 蛋白在沸水浴中加热 1 h 后未降解（图
5-A，泳道 2-6），证明纯蛋白具有热稳定性。为检测
转基因玉米中 Cry1Ie 蛋白的热稳定性，将过量 Cry1-
Ie 蛋白加入玉米粉提取液中，沸水浴中 30 min，SDS-
PAGE 检测蛋白被完全降解（图 5-B，泳道 7-12）。
2.6 稳定性实验处理后的Cry1Ie蛋白对亚洲玉米
螟的生物活性
本实验中 Cry1Ie 蛋白浓度为 5 μg/mL 时，校正
M 1 2 3 CK 1 2 3 CK
97
66
43
31
18ć 30ćA
kD
M 1 2 3 CK 1 2 3 CK
97
66
43
31
18ć 30ćB
kD
M ：蛋白 marker ；CK ：pET-21b 空载体 ；1-3 ：IPTG 浓度分别为 0.1、0.5、
1.0 mmol/L
图 1 不同温度和 IPTG 浓度下可溶性（A）和包涵体（B）
Cry1Ie 蛋白的 SDS-PAGE 检测
2.2 Cry1Ie蛋白纯化
首先对可溶性 Cry1Ie 蛋白进行 Ni-NTA 亲和纯
化，在 250 mmol/L 咪唑浓度下洗脱出浓度较高的纯
蛋白（图 2-A）。再将 250 mmol/L 咪唑洗脱下来的蛋
白用 Millipore 进行浓缩后进行分子筛层析，在出现
洗脱峰时收集流穿，获得了纯蛋白（图 2-B），通过
Image J 软件分析蛋白纯度达到 91％。
2.3 Cry1Ie蛋白在模拟胃液中的稳定性
Cry1Ie 蛋白在模拟胃液中不稳定，在 15 s 内可
被消化完全，SDS-PAGE 检测不到小片段残留（图
3-A）。不稳定对照酪蛋白在模拟胃液中 2 min 后被
降解（图 3-B，泳道 1），而稳定对照 STI 在 1 h 内没
212
116
97
66
45
97
66
43
31
20
kD
kD
M1
M2
A
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16
1 ：Cry1Ie ；2 ：流穿 ；3 ：50 mmol/L 咪唑洗脱 ；4 ：100 mmol/L 咪唑洗脱 ；
5-8 ：250 mmol/L 咪 唑 洗 脱 ；9 ：500 mmol/L 咪 唑 洗 脱 ；10 ：Cry1Ie 浓 缩 ；
11-16 ：洗脱峰收集
图 2 Cry1Ie 蛋白的 Ni-NTA 亲和层析纯化（A）及
Superdex-75 分子筛层析纯化（B）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11218
死亡率为 74%，这与 Song 等［11］的 Cry1Ie 对亚洲玉
米螟的生物活性测定结果是一致的。模拟胃肠液处
理后的 Cry1Ie 蛋白已经失去杀虫活性，100℃超纯水
处理 1 h 后的蛋白没有降解，但是已经失去杀虫活性。
而在玉米粉提取液中处理 30 min 后的蛋白完全降解，
并且失去杀虫活性（表 1）。
3 讨论
本研究获得了纯度为 91％的纯 Cry1Ie 蛋白，证
明了体外模拟胃肠液消化后及玉米粉提取液中热处
理后 Cry1Ie 蛋白不稳定，并失去对亚洲玉米螟的杀
虫活性。
自从 1987 年以来，转 Bt 基因抗虫农作物在全
世界广泛种植［1］。对转基因农作物、转基因食品进
行安全性评价尤为重要。目前用于饲料和食品的转
基因 Bt 作物主要是玉米。在中国和其他国家获得
审批的转基因 Bt 植物表达的 Cry 蛋白包括 Cry1Ab、
Cry1F、Cry1A.105、Cry1Ac、Cry2Ab2、Cry3Bb、
Cry34Ab1 和 Cry35Ab1 等［13］。欧洲食品安全局（EFSA）
对玉米植株中所表达的 Cry 蛋白的食品安全进行了
评估，如 Cry1Ab 和 Cry3Bb1［17］、Cry1F［18］、Cry34-
Ab1 和 Cry35Ab1［19］和包含一种以上 Cry 蛋白的玉
米杂交品种［20，21］。每一个注册的转基因 Bt 作物都
要根据国际食品法典的建议进行安全性评价，其中
包括蛋白质特性、在模拟消化液中进行稳定性评估、
在小鼠中进行急性高剂量口服毒性试验、与已知毒
素和致敏原进行氨基酸序列比对及对非靶标生物的
作用。对具有商业化前景的 Bt 作物及其外源蛋白进
M 1 2 3 4 5 6 7 8A
97
66
43
31
kD
M B 1 2 3 4 5
97
66
43
31
20
kD
M ：蛋白 marker ；（A）1 ：Cry1Ie 蛋白 ；2-8 ：分别为 Cry1Ie 蛋白在 SGF 中
处理 15 s、1、2、5、10、30 和 60 min ；（B）1 ：不稳定对照 ；2 ：稳定对照 ；
3 ：模拟胃液空白对照 ；4 ：酪蛋白 ；5 ：STI
图 3 Cry1Ie 蛋白（A）及对照蛋白（B）在模拟胃液中的
消化稳定性分析
97
kD
66
43
31
20
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
M：蛋白 marker；1：Cry1Ie 蛋白；2-8：分别为 Cry1Ie 蛋白模拟肠液处理 15 s、
1、2、5、10、30 和 60 min ；9 ：不稳定对照 ；10 ：酪蛋白 ；11 ：模拟肠液空白
对照 ；12 ：稳定对照 ；13 ：STI
图 4 Cry1Ie 蛋白在模拟肠消化液稳定性
97
66
43
31
M 1 2 3 4 5 6A
kD
97
66
43
31
M 1 7 8 9 10 11 12 13B
kD
M ：蛋白 marker ； 1 ：Cry1Ie ；2-6: 2 min、5 min、10 min、30 min、1 h ；
7 ：米粉溶液对照 ；8-13 ：Cry1Ie 蛋白沸水浴中加热 15 s、1 min、5 min、
10 min、30 min、1 h
图 5 Cry1Ie 纯蛋白（A）在超纯水及在玉米粉提取液中
（B）的热稳定性分析
2015,31(11) 219李欣竹等 ：Cry1Ie 蛋白的模拟胃肠液消化稳定性及热稳定性分析
行评估，为其环境安全性及食用安全性评价奠定基
础，体外模拟胃肠液消化稳定性与热稳定性评价恰
恰是这方面最基础也是最关键的一个步骤。
本研究选择具有应用前景的 Cry1Ie 蛋白，并获
得了大量可溶性蛋白，纯度达到 91％这与此前的
Song 等［10］所做的表达相比，增加了蛋白的可溶性。
根据 Guo 等［22］所做的 IE648 蛋白的表达纯化相比，
仅仅用 Ni-NTA 亲和层析和分子筛层析就获得了纯
度高的 Cry1Ie 蛋白，大大提高了纯化效率。
在 2009 年，Xu 等［7］对 Cry1Ab/Ac 融合蛋白进
行了消化稳定性和热稳定性评价，发现 Cry1Ab/Ac
蛋白在模拟消化液中不稳定，与本研究的结果一致。
但是在热稳定性评价实验中，Xu 只将目的蛋白溶解
于 20 mmol/L Tris-HCl 中进行了热稳定性评价，而本
研究同时将 Cry1Ie 蛋白溶解于玉米粉提取液中进行
热稳定性评价，证明了其在玉米粉提取液中的热不
稳定性。这一实验模拟了该蛋白作为膳食来源经过
一系列加工后进入人体的可能途径。在对 Cry1Ie 蛋
白进行消化稳定性和热稳定性实验后，该蛋白都会
以小肽或氨基酸的形式存在，而这些物质在人体内
仅能够作为膳食来源的营养物质。除了花粉蛋白，
其他所有免疫原性蛋白对消化酶都有极高的稳定性，
因此蛋白质的稳定性可以被认为是预测蛋白质免疫
原性的重要参考数据［23］。蛋白质经过胃蛋白酶消化
后形成小于 3.5 kD 的小肽和氨基酸，则被认为几乎
不可能具有免疫原性［24］。根据以上研究进展，可以
初步判断，Cry1Ie 蛋白不具有免疫原性。但是这只
是一个初步的判断，并不能完全证明其无免疫原性。
表 1 稳定性实验处理后的 Cry1Ie 蛋白对亚洲玉米螟室内毒力测定结果
处理组与对照组 接虫数 / 只 死虫数 / 只 活虫数 / 只
平均死亡率 /%
± 标准差 /%
校正死亡率 /%
± 标准差 /％
Cry1Ie 蛋白
（5 μg/mL）
Cry1Ie 蛋白 30 21 9
74.7±4.5a 74±4.6a30 23 6
30 21 7
SGF 处理 15 s 30 1 26
4.7±2.1b 4±2.2b30 2 26
30 1 29
SIF 处理 1 h 30 1 29
6.7±3.5b 3±5.7b30 3 27
30 2 27
100℃处理 30 min 30 0 28
3.4±3.3b 0.4±5.0b30 2 28
30 1 27
玉米粉提取液中
100℃处理 30 min
30 0 30
4.7±5.0b 3±5.4b30 1 26
30 3 27
对照组 超纯水 30 0 28
3.3±3.5b -30 1 29
30 2 27
玉米粉提取液 30 1 28
2.3±2.1b -30 0 30
30 1 27
模拟胃消化液 30 1 28
1.0±1.7b -30 0 29
30 0 28
模拟肠消化液 30 0 30
4.3±7.5b -30 4 26
30 0 29
注 ：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11220
因为目前还没有发现抗蛋白酶消化与免疫原活性有
直接的关系［24］。
4 结论
通过 Ni-NTA 亲和层析系统和分子筛层析系统
获得了 Cry1Ie 的纯蛋白，纯度达到 91％对亚洲玉米
螟具有较高的杀虫活性。通过模拟消化实验，证明
Cry1Ie 蛋白在体外模拟胃肠液中不稳定，15 s 即被
降解，对亚洲玉米螟失去杀虫活性。热稳定性实验
证明，Cry1Ie 蛋白在沸水浴中加热 1 h 后没有降解，
并且保持对亚洲玉米螟的杀虫活性。但是该蛋白在
玉米粉提取液中不稳定，在沸水浴中 30 min 即被降
解，对亚洲玉米螟失去杀虫活性。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）