全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-05-12
基金项目 : 山东省中青年科学家奖励基金项目（2006BS06008）, 山东省自然科学基金项目（ZR2010CQ008）, 山东省“泰山学者”基金项目
作者简介 : 姜娜娜 , 女 , 硕士 , 助教 , 研究方向 : 生物工程 ; E-mail:jnn1982@163.com
通讯作者 : 王兴军 , 研究员 , 博士生导师 , E-mail: xingjunw@hotmail.com
番茄果实特异性启动子的克隆与遗传转化研究
姜娜娜1,2,3 赵传志1,2 赵光敬4 李长生1,2 夏晗1,2 王兴军1,2
（1山东省农业科学院高新技术研究中心 山东省作物与畜禽品种改良生物技术重点实验室，济南 250100 ；
2农业部黄淮海作物遗传改良与生物技术重点开放实验室，济南 250100 ；3山东现代职业学院，济南 250100 ；
4山东省青州市实验中学，青州 262500）
摘 要： 为了实现外源基因在番茄果实中的高效和特异表达，克隆了番茄果实特异基因多聚半乳糖醛酸酶基因（Poly-
galacturonase，PG）的启动子。以中蔬四号番茄为材料，建立并优化了以子叶为外植体的番茄高效再生和遗传转化体系 ；以 GUS
为报告基因，构建 PG GUS 植物表达载体，转化番茄。结果表明，在 1.0 mg/L ZT 的 MS 分化培养中，番茄子叶的发芽率最高，芽
的诱导率高达 91%，且发生畸态芽和褐化的外植体最少 ；通过抗生素浓度对农杆菌的抑制效果试验发现，当头孢霉素的浓度为
200 mg/L 时，抑制农杆菌的效果最好 ；成功克隆了番茄 PG 启动子，将 PG 启动子驱动的 GUS 基因转入番茄，对转基因后代果实
的 GUS 染色表明，PG 启动子驱动的外源基因在果实中特异表达。
关键词： 番茄 多聚半乳糖醛酸酶 果实特异启动子 遗传转化体系
Fruit-specific Promoter Cloning and Tomato Transformation
Jiang Nana1,2,3 Zhao Chuanzhi1,2 Zhao Guangjing4 Li Changsheng1,2 Xia Han1,2 Wang Xingjun1,2
（1High-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory for Genetic Improvement of Crop Animal and Poultry of
Shandong Province, Jinan 250100 ；2Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Biotechnology, Huanghuaihai, Ministry of Agriculture,
Jinan 250100 ；3Shandong Modern Vocational College, Jinan 250100 ；4Shandong Province Qingzhou High School, Qingzhou 262500）
Abstract: In order to obtain fruit-specific and highly expressed foreign gene in transgenic tomato, we cloned the promoter of Poly-
galacturonase （PG）. The tomato regeneration and transformation system were established using “zhongshu 4”. PG promoter: GUS construct
was made and introduced into tomato through Agrobacterium mediated transformation. Results showed that the best callus initiation and shoot
induction medium was MS + 1.0 mg/L ZT. The shoots induction rate reached 91% with low portion of abnormal shoots. 200 mg/L of cefotaxime
could effectively inhibit the growth of Agrobacteria. Histochemical analysis showed that GUS was specifically expressed in transgenic tomato
fruit.
Key words: Tomato Polygalacturonase Fruit specific promoter Genetic transformation
番 茄（Lycopersicon esculentum Mill.） 果 实 含 有
丰富的类胡萝卜素和维生素，是重要的蔬菜和水
果。此外，番茄是研制植物口服疫苗［1］和生产药用
蛋白的理想载体，在番茄中已经成功表达了白介素
12［2］，人表皮生长因子［3］等。番茄作为植物基因工
程的模式材料之一，是最早开展基因转化研究的高
等植物之一。农杆菌介导的番茄遗传转化研究最早
可以追溯到 1986 年［4］，然而番茄的转化率一直不高，
成了番茄基因工程研究中急需解决的问题［5］。影响
番茄转化率的因素很多，例如再生体系的建立、外
植体选择、抗生素和激素浓度等。本研究以番茄栽
培种中蔬四号为研究对象，分析了不同配比的细胞
分裂素和生长素对番茄不定芽诱导率，建立并优化
了番茄再生和遗传转化体系。
番茄果实是番茄的收获器官和基因工程的主要
靶器官，是植物生物反应器生产目的蛋白的重要载
体。而外源基因在番茄中的表达具有时间性和空间
性，所以番茄果实特异启动子的鉴定和应用是实现
2012年第1期 75姜娜娜等 ：番茄果实特异性启动子的克隆与遗传转化研究
外源基因在转基因果实中特异高效表达的重要工
具。番茄多聚半乳糖醛酸酶基因（Polygalacturonase，
PG）与细胞壁分解以及果实软化相关，在番茄成熟
过程中起着重要作用［6］。PG 基因是典型的番茄果实
特异表达基因，其表达量随着番茄的成熟过程而急
剧增加。在成熟果实中 PG 基因 mRNA 量可占成熟
果实 mRNA 总量的 1%［7］。本研究提取番茄基因组
DNA，根据 NCBI 中报道的 PG 基因（X14074）设计
引物，从番茄中克隆 PG 启动子。构建由 PG 果实特
异启动子驱动的 PG ：GUS 植物表达载体，通过农杆
菌介导的方法转化番茄，旨在为利用基因工程实现
外源基因在果实中的特异表达提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
番茄品种中蔬 4 号购自山东省农业科学院种子
市场，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、表达载
体 pBI101 和农杆菌菌株 C58C1 为本实验室保存 ；
pGEM-T-Easy 载 体 购 自 Promega 公 司 ； TaqMix 购
自东胜创新生物公司 ；PCR 产物回收试剂盒购自
Omega 公司 ；引物合成和测序由上海生工生物工程
有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 番茄基因组 DNA 的提取 番茄基因组 DNA 的
提取采用改良的 SDS 方法［8］：将叶片放入 1.5 mL 离
心 管 中， 加 入 100 μL 提 取 液（0.2 mol/L Tris-HCl
pH7.5, 0.25 mol/L NaCl, 0.025 mol/L EDTA, 0.5%
SDS），用研磨棒研磨 ；再加入 300 μL 提取液冲洗研
磨棒，涡旋 20 s ；13 000 r/min 离心 5 min，将上清转
移到新的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠
倒混匀，室温静置 5 min ；13 000 r/min 离心 10 min ；
倒掉上清，加入 500 μL 70% 乙醇冲洗 ；离心，倒掉
上清，吹干后加水溶解。
1.2.2 PG 启动子的克隆和植物表达载体的构建 根
据 NCBI 登 录 的 番 茄 基 因 组 片 段 序 列（X140
74），设计上下游引物（PGF:5-AAGCTTCTTAAAAAG
GCAAATTG-3，PGR:5-GGATCCGATATATTGTTATA
TGGTAT-3），分别引入 Hind III 和 BamH I 酶切位
点（下划线部分），以番茄基因组 DNA 为模板进行
PCR 扩增。反应程序 ：94℃预变性 3 min ；94℃变性
30 s，51℃退火 30 s，72℃延伸 1 min 50 s，30 个循环；
72℃延长 10 min。连接到 T 载体并测序。将目的基
因片段从 T 载体上切下插入 pBI101 载体中，得到重
组表达载体（图 1），转化大肠杆菌 DH5α。取菌落
小量提取质粒 DNA，用 Hind III 和 BamH I 进行双酶
切验证，同时用引物 PGF 和 PGR 进行菌落 PCR 检测。
将构建好的植物表达载体转入农杆菌 C58C1 中。
1.2.3 番茄再生和遗传转化体系的优化
1.2.3.1 外植体的获得 称取 1 g 种子置于三角瓶
内， 分 别 用 75% 乙 醇、3% NaClO 漂 洗 1 min 和
10 min，用无菌水清洗 4-6 次，每次 5 min。将种
子种在 1/2 MS 培养基上，24℃光照培养 6-8 d（16 h
光照 /8 h 黑暗）。切取子叶外植体，近轴面向上置
于 MS 培养基上，每种培养基含有不同的激素组合
（表 1）。培养皿置于光照培养箱中弱光培养（16 h
光照 /8 h 黑暗），统计各种培养基上子叶外植体不
定芽的分化情况。
1.2.3.2 番 茄 的 遗 传 转 化 在 含 有 50 mg/L 利 福
平 和 50 mg/L 卡 那 霉 素 的 LB 平 板 培 养 基（NaCl
10 g/L + Peptone 10 g/L + Yeast extract 5 g/L） 上 活
化 农 杆 菌， 挑 取 单 菌 落 接 种 于 20 mL YEB 培 养
基（5 g/L Peptone + 5 g/L Yeast extract + 5 g/L Beef
extract + 5 g/L Sucrose + 2.5 g/L MgSO4·7H2O ） 上，
摇 菌 至 OD600 值 为 0.6， 离 心， 用 MS0 重 悬， 加
入乙酰丁香酮混匀，将预培养 1-2 d 的子叶外植
体置于菌液中侵染 10 min，将外植体转移到共培
养 基（MS+1.0 mg/L ZT） 中 培 养 2 d ；再 将 外 植 体
转 入 培 养 基（MS+Cef） 中 培 养， 添 加 不 同 浓 度
的 头 孢 霉 素 ：150、200、250、300 及 400 mg/L。
观察不同浓度的头孢霉素对农杆菌的抑制效果，
10 d 后将子叶转入分化筛选培养基（MS + 1.0 mg/L
ZT+200 mg/L Cef + 50 mg/L Kan） 中， 每 隔 2-3 周
图 1 PG 启动子表达载体的构建示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期76
编号 培养基
激素组合 （mg/L）
外植体不定芽分化率（%）
2,4-D IAA NAA 6-BA ZT
1 MS — — — — 0.5 72
2 MS — — — — 1.0 91
3 MS — — — — 1.5 83
4 MS — — — — 2.0 55
5 MS — 0.2 — — 1.0 78
6 MS — 0.5 — — 1.0 89
7 MS — 1.0 — — 1.0 43
8 MS — 2.0 — — 1.0 20
9 MS — — 0.2 2.0 — 23
10 MS — — 0.5 2.0 — 50
11 MS — — 1.0 2.0 — 76
12 MS — — 2.0 2.0 — 15
13 MS 0.2 — — 2.0 — 0
14 MS 0.5 — — 2.0 — 0
15 MS 1.0 — — 2.0 — 0
16 MS 2.0 — — 2.0 — 0
继代一次 ；当幼苗长至 2 cm 时从外植体上切下，
转 入 生 根 培 养 基（MS0 + 0.5 mg/L IBA + 25 mg/L
Kan + 200 mg/L Cef）中，待根系发达后转入含蛭石
与土的花盆中，并浇营养液。为防止小苗萎蔫，将
栽有小苗的花盆放入大塑料盆中并用地膜覆盖盆口，
2-3 d 后逐步掀开地膜，1 周后将地膜撤掉。
1.2.3.3 番 茄 转 基 因 植 株 的 PCR 检 测 和 GUS 染
色 提取转基因植株的基因组 DNA，分别于载体中
的 Kan 基因设计引物：NPT Ⅱ-F: 5-GTGGAGAGGCTA
TTCGGCTATGACTG-3 ；NPTⅡ-R: 5-GGCTCTTCAGC
AATATCACGGGTAGC-3。以中蔬 4 号基因 组 DNA
为阴性对照，质粒载体为阳性对照，进行 PCR 扩增，
扩增程序为 ：94℃ 5 min ；随后 94℃ 1 min，58℃
1 min，72℃ 2 min，32 个循环 ；后 72℃ 7 min 结
束反应。PCR 结束后，分别取 10 μL PCR 反应产
物经 1% 琼脂糖凝胶电泳后拍照。GUS 组织化学
染色和 X-Gulc 的配制参照 Jefferson 的方法［9］。
2 结果
2.1 番茄PG启动子的克隆
以番茄基因组 DNA 为模板，用 PGF 和 PGR 引
物从番茄中扩增 PG 基因的启动子。PCR 产物大小
在 1.5 kb 左右（图 2-A）。将 PCR 扩增产物克隆至
pGEM-T-Easy 载体上，并进行测序，结果显示扩增
片段的序列与 NCBI 的 PG 基因（X14074）启动子序
列一致，片段长度为 1 472 bp。
2.2 植物表达载体的构建
以 Hind Ⅲ/BamH Ⅰ双酶切将启动子片段从重
组质粒上切下，连入表达载体 pBI101，得到重组
质粒。挑取阳性克隆，酶切鉴定显示，pBI101-gus
经 Hind Ⅲ/BamH Ⅰ双酶切（图 2-B）和 PCR 验证
结果（图 2-C）表明，启动子片段已成功的克隆到
pBI101 中。
2.3 番茄再生和遗传转化体系的优化
培 养 基 中 添 加 不 同 配 比 的 细 胞 分 裂 素 和 生
长素对番茄不定芽的诱导有不同的影响。观察含
有不同激素组成的培养基上番茄子叶的芽分化情
况，结果（图 3-A）发现，培养基中添加 0.5 mg/L
IAA+1.0 mg/L ZT 对不定芽的诱导率要高于 1.0 mg/L
NAA+2.0 mg/L 6-BA 对 不 定 芽 的 诱 导 率。 单 独 添
加 ZT 也能较好的诱导不定芽的产生。生长在含有
1.0 mg/L ZT 的培养基上的外植体发芽率最高，且出
现的畸态芽的比例小。生长在含有 0.5 mg/L ZT 培养
表 1 含有不同激素组合的 MS 培养基
2012年第1期 77姜娜娜等 ：番茄果实特异性启动子的克隆与遗传转化研究
基上的外植体虽然芽体出现的早，但总的芽诱导率
较低。随着 ZT 浓度的提高，畸态芽所占的比例增
加。添加 2, 4-D 和 6-BA 的培养基上的外植体出现褐
化，无不定芽的产生。将经过农杆菌侵染的番茄子
叶外植体接种到含有不同浓度的头孢霉素的培养基
中，观察农杆菌的生长情况，结果发现，当头孢霉
素的浓度为 150 mg/L 时，在 1 周以内可以抑制农杆
菌的生长，但 1 周后开始出现农杆菌。当抗生素的
浓度增加到 200 mg/L 及以上时，在 3 周内都未出现
农杆菌的生长。
2.4 转基因植株的PCR检测
将表现卡那抗性的番茄幼苗在生根培养基中生
根后（图 3-B），移栽到营养土中（图 3-C）。提取
其基因组 DNA，以转基因植株及对照植株的 DNA
为模板，NPT Ⅱ基因的特异引物进行 PCR 扩增反
应，转基因的番茄植株中均扩增出 NPT Ⅱ的特异
条带，而对照植株未出现阳性条带，初步说明含有
PG:GUS 融合基因的表达载体已经整合到番茄的基
因组中。
M. DNA Marker; 1. PG 启动子 ；A. 从番茄中扩增 PG 基因的启动子 ；B.
表达载体 pBI101-gus 双酶切验证 ；C. 表达载体 pBI101-gus PCR 验证
图 2 番茄 PG 启动子的克隆与表达载体的构建
A. 番茄组织培养再生体系的建立 ； B. 转基因番茄幼苗 ； C. 移栽后的转基因番茄
图 3 番茄再生和遗传转化体系
2.5 转基因番茄的GUS染色
选取 PCR 鉴定（图 4-A）为阳性的转基因番茄
植株，对其果实横切后进行 GUS 组织化学染色。如
图 4-B 所示，可以清晰地看到番茄种子和果肉中部分
组织呈蓝色。该结果表明，GUS 基因在转基因番茄
中成功表达。对转基因番茄幼苗根、茎、叶的染色
结果表明，GUS 在营养器官中无表达（结果未显示）。
3 讨论
近年来番茄一直是生物反应器研究领域的热点，
如 Zhou 等［10］在番茄中成功表达了 HIV 抗原，He 等［11］
在番茄中表达了乙肝病毒表面抗原，曹慧颖等［12］
在番茄中表达了人胸腺素 α1 基因，这些研究进展预
示着番茄在该领域广阔的应用前景。但是和其他生
物反应器一样，番茄生物反应器也面临着一些问题 ：
表达量低、生物安全性、转基因后代出现非预期表
型等。如在番茄中过量表达隐花色素基因，可以使
番茄果实中番茄红素及总的类胡萝卜素的含量提高，
但同时也引起了一些负效应，包括转基因后代植株
矮化、分枝增多等［13］，这些不良的农艺性状严重影
响了番茄的产量和品质。 利用果实特异启动子可以
在一定程度上解决上述问题。本研究从番茄中克隆
了果实特异性 PG 启动子，初步研究了 PG 启动子在
番茄中的表达特征，为番茄基因工程和番茄生物反
应器研究奠定基础。本研究的结果显示，GUS 在果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期78
实中的表达量较低，其原因可能是多方面的，下一
步将分析不同长度的 PG 启动子驱动 GUS 的表达情
况，比较 GUS 在不同发育时期的番茄果实中的表达
变化规律，分析更多的转基因植物探讨插入位点的
不同对 GUS 表达的影响。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）
M. DNA Marker; 1-7. 部分转基因番茄 ; 8. 阳性对照 ; 9. 阴性对照
图 4 转基因番茄的 PCR 鉴定（A）及 GUS 染色（B）