全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-06-09
基金项目 : 浙江省省基金项目（Y3110340）, 浙江农林大学启动基金项目（2351001059,2351000812）
作者简介 : 丁一 , 女 , 本科生 , 研究方向 : 植物抗逆性 ; E-mail: 745078872@qq.com
通讯作者 : 于超 , 女 , 博士 , 实验师 , 研究方向 : 植物抗逆及其分子生物学 ; E-mail: yuch@zafu.edu.cn
番茄内质网 ω-3 脂肪酸去饱和酶基因原核
表达载体的构建与鉴定
丁一 王华森 于超
（浙江农林大学农业与食品科学学院，临安 311300）
摘 要： 通过 RT-PCR 的方法从番茄叶片克隆到内质网 ω-3 脂肪酸去饱和酶（LeFAD3）基因的部分编码区，该片段 cDNA
为 309 bp，将其克隆到 pET-30a （+）载体中，酶切位点分别是 BamHⅠ和 SacⅠ，构建了原核表达载体 pET-LeFAD3，并在大肠杆
菌 BL21 中表达融合蛋白，经 IPTG 诱导蛋白表达，提取蛋白并采用 SDS-PAGE 和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。酶
切鉴定结果表明，LeFAD3 基因原核表达载体构建成功 , 目的蛋白成功表达。
关键词： 番茄 内质网型 ω-3 脂肪酸去饱和酶 原核表达载体
Construction and Identification of an Endoplasmic Reticulum-localized
Tomato Omega-3 Fatty Acid Desaturase （LeFAD3） Gene Prokaryotic
Expression Vector
Ding Yi Wang Huasen Yu Chao
（Department of Horticulture，School of Agriculture and Food Science，Zhejiang A & F University，Linan 311300）
Abstract: The coding region length of LeFAD3 gene about 309 bp nucleotides was isolated by RT-PCR from tomato leaves and was
subcloned into the pET-30a （+） vector between the BamHⅠ and SacⅠsites. A recombinant of prokaryotic expression vector pET-LeFAD3 was
constructed and transformed into E. coli BL21 and then expressed by inducing with IPTG，transducted into BL21 and the exogenous protein
expression was induced by IPTG. The exogenous LeFAD3 expression was examined by SDS-PAGE and Western immunoblotting. Results showed
that LeFAD3 gene was successfully constructed, expression of LeFAD3 gene in E. coli could provides the basis for further research on LeFAD3
function.
Key words: Tomato （Lycopersicon esculentum） Endoplasmic reticulum-localized omega-3 fatty acid desaturase Prokaryotic
expression vector
ω-3 脂肪酸去饱和酶是催化二烯脂肪酸向三烯
脂肪酸转化的一种膜结合酶，其活性的高低会影响
植物的温度胁迫抗性 [1-4]。该酶是个多基因家族，大
都位于各种细胞器膜上，该酶不仅影响膜脂不饱和
脂肪酸的含量，还会影响膜上其他酶，例如，APX、
SOD 等酶及一些膜结合蛋白的活性。内质网型 ω-3
脂肪酸去饱和酶是不饱和脂肪酸合成途径中催化
18:2（9,12）转化为 18:3（9,12,15）的关键酶。近年来，
人们对内质网型 ω-3 脂肪酸去饱和酶基因的研究也
越来越深入。Murakami 等 [4] 使烟草中 ω-3 脂肪酸去
饱和酶的编码基因沉默，导致突变植株的三烯脂肪
酸比野生型植株明显减少，突变株能更好地适应高
温环境。2005 年 Zhang 等 [5] 将内质网型 FAD3 基因
转入烟草中，转基因植株不同程度的提高了烟草的
抗干旱能力。2007 年，Matos 等 [6] 用 fad2 及 FAD3+
两突变体研究低温下 TAs 对线粒体的影响，结果表
明，拟南芥遭遇低温时 AOX 不一定参与抵御低温的
保护机制中，猜测 AOX 可能与冷敏感的植物有很大
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期80
的关系。因此，通过调节植物体内不饱和脂肪酸含
量来提高作物的温度胁迫下的抗性是非常重要的。
本研究利用从番茄中克隆到的 LeFAD3 的部分
编码区成功构建了番茄原核表达载体 pET-LeFAD3，
并在大肠杆菌 BL21 中表达融合蛋白，旨在为进一
步研究 LeFAD3 生理功能打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植 物 材 料 番 茄（Lycopersicon esculentum）：
品种为“中蔬四号”，购自中国农业科学院。
1.1.2 细菌菌株与质粒载体 本研究所用的大肠杆
菌菌株为 E. coli DH5α，BL21，克隆载体为 pMD18-T
vector，表达载体为改造过的 pET-30a （+） 载体。
1.1.3 酶及生化试剂 RNA 提取所用的 Trizol 试剂
盒和 DNA 回收试剂盒购自上海博亚生物公司。Taq
DNA 聚合酶、Tris 等购自上海生物工程公司。限制
性内切酶、T4 DNA 连接酶、DNA Marker（DL2000）
等购自大连宝生物公司。
1.2 方法
1.2.1 材 料 处 理 种 子 用 50 ℃ 热 水 表 面 消 毒 10
min。浸种 10 h 后，将大小基本一致的番茄种子置
于铺有滤纸的培养皿中，将滤纸用水稍微润湿，上
加一层湿滤纸，28℃暗中催芽 3-5 d。然后将长至 2
cm 左右的番茄幼苗移入花盆中进行栽培。生长约两
个月后番茄长出第 8 片叶，取其功能叶，用液氮冷
冻后保存于 -80℃超低温冰箱中备用。
1.2.2 内质网型 ω-3 脂肪酸去饱和酶基因原核表达
载体的构建 根据 LeFAD3 的基因序列上的酶切位点
和载体上的酶切位点，设计了带酶切位点的 5 引物
FP7 ：5-GGATCCGGATTAACTACAGTTGAT-3 与 3
引 物 FP8 ：5-GAGCTCTTATCCGTAAAGCTTAAGCA
-3（下划线分别为 BamH Ⅰ和 Sac Ⅰ酶切位点），
PCR 扩增片段，以番茄 cDNA 为模板，反应程序 ：
94℃ 5 min ； 94℃ 50 s，50℃ 60 s，72℃ 60 s，35 个
循环 ；72℃延伸 10 min。将获得的正向与反向的
PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳后 , 切下目的条
带 , 用胶回收试剂盒回收。将质粒酶切鉴定后，寄
往上海博亚生物技术公司测序。之后，将扩增产物
回收后连入 pMD18-T，转入大肠杆菌中，提取质粒
后，分别用 SacⅠ和 BamHⅠ酶将质粒和 pET-30a（+）
载体分别进行双酶切，回收后将含有 LeFAD3 部分
编码区的 cDNA 插入表达载体 pET-30a（+）载体构
成原核表达载体。然后将表达载体转化 BL21，酶切
鉴定。
2 结果
2.1 LeFAD3基因在大肠杆菌中的表达
2.1.1 原 核 表 达 载 体 pET-LeFAD3 的 构 建 将
LeFAD3 基 因 的 部 分 编 码 区 正 向 插 入 到 pET-30a
图 1 原核表达载体的构建
2012年第1期 81丁一等 ：番茄内质网 ω-3 脂肪酸去饱和酶基因原核表达载体的构建与鉴定
（+） 的 T7 启 动 子 和 T7 终 止 子 之 间， 构 建 pET-
LeFAD3 表达载体（图 1），酶切位点分别为 SacⅠ和
BamHⅠ。载体中含有 Kan 编码序列，转该质粒的
大肠杆菌具有卡那抗性。T7 启动子下游有 lac 操纵子，
受 IPTG 诱导，在 T7 启动子和 T7 终止子之间还有
组氨酸标签编码区，并且表达的蛋白是含有组氨酸
标签的融合蛋白，组氨酸标签的存在为下一步蛋白
质的纯化提供了便利。
2.1.2 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 将构建好的 pET-
LeFAD3 转化大肠杆菌 BL21，利用大肠杆菌 BL21
作为模板进行菌落和菌液 PCR 验证，引物为特异
引物 FP7 和 FP8。结果（图 2）显示，含质粒 pET-
LeFAD3 的 菌 株 扩 增 出 309 bp 的 条 带。 大 肠 杆 菌
BL21 的菌液经 IPTG 诱导表达后，提取蛋白质进行
SDS-PAGE，结果（图 3）显示，转基因的大肠杆菌
有 18 kD 的条带，表明表达的蛋白为融合蛋白。
2.1.3 pET-LeFAD3 重组蛋白的鉴定 为了进一步对
LeFAD3 重组蛋白产物进行鉴定，将原核表达载体
pET-LeFAD3 在大肠杆菌 BL21 中表达融合蛋白，免
疫小白鼠，制备抗体，其抗血清效价为 1 500。使
用该抗体进行蛋白质免疫印迹分析，结果（图 4）
发现，与不含重组质粒的 BL21 菌液和含重组质粒
但未经 IPTG 诱导的 BL21 菌液相比，含重组质粒并
经 IPTG 诱导后的 BL21 菌液在 40 kD 左右能检测到
明显的蛋白条带，与上述 SDS-PAGE 结果一致，表
明该蛋白产物确实为 LeFAD3 重组蛋白。
3 讨论
内质网型 ω-3 脂肪酸去饱和酶 FAD3 位于内质
网膜上，负责质体膜内膜膜脂之外所有不饱和甘
油 酯 的 合 成。Sigenthaler 和 Murata［5］ 认 为， 特 殊
的脂类结构在确保正常生理功能方面起重要作用。
Vrinten 等［6］发现亚麻种子里的亚麻酸主要来源于
FAD3 去饱和作用，这一结果在拟南芥中的报道相符。
Chappell 等［7］发现在大豆中 GmFAD3A 基因突变提
高了豆油的稳定性并且使豆油的气味更加让人满意。
张萌等［8］将内质网型 FAD3 基因与质体型 FAD8 基
因分别转入烟草中，发现过量表达 FAD8 基因的植
株比过量表达 FAD3 基因植株对干旱较敏感，转基
因植株不同程度的提高了烟草的抗干旱能力。本
研究中成功构建了番茄 LeFAD3 基因的原核表达载
体，目的蛋白成功表达，为今后进一步在体外研究
LeFAD3 基因功能打下了基础。
4 结论
从番茄叶片克隆到的 309 bp cDNA 片段，即内
质网 ω-3 脂肪酸去饱和酶基因（LeFAD3）的部分编
码区，将其克隆到 pET-30a(+) 载体中，构建了原核
表达载体 pET-LeFAD3。经酶切鉴定，成功构建了番
茄 LeFAD3 基因的原核表达载体，目的蛋白成功表
A.LeFAD3 基因的编码区全长 ；B.pET-LeFAD3 的酶切鉴定
图 2 pET-LeFAD3 的酶切鉴定
M. 蛋白质 Marker ；1.pET-30a（+）未经 IPTG 诱导 ；2.pET-30a（+）经 IPTG
诱导 6 h ；3.pET-LeFAD3 未经 IPTG 诱导 ；4.pET-LeFAD3 经 IPTG 诱导 6 h
图 3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.pET-30a（+）未经 IPTG 诱导 ；2.pET-LeFAD3 未经 IPTG 诱导 ；
3.pET-LeFAD3 经 IPTG 诱导 6 h
图 4 LeFAD3 重组蛋白的鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期82
达，为今后进一步在体外研究 LeFAD3 基因功能打
下了基础。
参 考 文 献
［1］ Hugly S, Somerville C. A role for membrane lipid polyunsaturation
in chloroplast biogenesis at low temperature. Plant Physiol,
1992,99(1):197-202.
［2］ Kodama H, Hamada T, Horiguchi G, et al. Genetic enhancement of
cold tolerance by expression of a gene for chloroplast omega-3 fatty
acid desaturase in transgenic tobacco. Plant Physiol,1994,105(2):
601-605.
［3］ Kodama H, Horiguchi G, Nishiuchi T, et al. Fatty acid desaturation
during chilling acclimation is one of the factor involved in conferring
low-temperature tolerance to young tobacco leaves. Plant Physiol,
1995,107(4):1177-1185.
［4］ Murakami Y, Tsuyama M, Kobayashi Y, et al. Trienoic fatty acids
and plant tolerance of high temperature. Science, 2000,287(5452):
476-479.
［5］ Zhang M, Barg R, Yin M, et al. Modulated fatty acid desaturation via
overexpression of two distinct ω-3 desaturases differentially alters
tolerance to various abiotic stresses in transgenic tobacco cells and
plants. The Plant J,2005,44(3):361-371.
［6］ Matos AR, Hourton-Cabassa C, Cicek D, et al. Alternative oxidase
involvement in cold stress response of Arabidopsis thaliana fad2 and
FAD3+ cell suspensions altered in membrane lipid composition.
Plant Cell Physiol,2007,48(6):856-865
［7］ Sigenthaler PA, Murata N. Lipids in photosynthesis: Structure
function and genetics ［M］ . Dordrecht: Kluwer Academic Press,1998.
［8］ Vrinten P, Hu ZHY, Munchinsky MA, et al. Two FAD3 desaturase
genes control the level of linolenic acid in flax seed. Plant
Physiol,2005,39(1):79-87.
［9］ Chappell ASC, Bilyeu KD. Short communication a GmFAD3A
mutation in the low linolenic acid soy bean mutant C1640. Plant
Breeding,2006,125(5):535-536.
（责任编辑 马鑫）
［9］ 武强，万方浩，李照会．苹果绵蚜在我国的入侵状况调查及防
治对策．植物保护，2009， 35 （5）：100-104．
［10］ 安瑞生，谭声江，陈晓峰．微卫星 DNA 在分子遗传标记研究
中的应用．昆虫知识，2002，39（3）：165-170．
［11］ 周志湘，万方浩，张桂芬，等．烟粉虱基因组 DNA 快速提取
方法．植物保护，2007，33（5）：131-133．
［12］ Sunnucks P, Hales DF．Numerous transposed sequencesof
mitochondrial cytochrome oxidase I-II in Aphids of the genus
Sitobion （Hemiptera: Aphididae）. Molecular Biologyand Evolution,
1996, 13（3）: 510-524．
［13］ Lavandero B，Figueroa CC，Ramirez CC，et al．Isolation and
characterization of microsatellite loci from the woolly apple aphid
Eriosoma lanigerum （Hemiptera: Aphididae: Eriosomatinae）.
Molecular Ecology Resources, 2009,9（1）：302-304．
［14］ 王永模．微卫星标记技术对麦长管蚜的生殖模式与迁飞规律
研究［D］．北京 : 中国农业大学，2007．
［15］ 滕希，武强，万方浩．盐析法提取烟粉虱基因组 DNA．生物
技术通报，2009（8）：166-168．
（责任编辑 马鑫）
（上接第 73 页）