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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):119-124
漆 酶（ 对 苯 二 酚 - 氧 化 还 原 酶，laccase，EC
1.10.3.2）是一种含多铜的氧化还原酶，能够催化多
种底物的氧化，如邻位和对位酚类、氨基苯酚、芳
基二胺、多酚、聚胺和木质素等［1-3］。此外，它还
可以耦合无机离子还原分子氧生成水。最早漆酶被
发现于日本漆树的汁液中，目前研究发现漆酶广泛
存在于植物、昆虫、真菌和细菌中［4-6］。部分漆酶
已经广泛应用在工业过程中，如漂白、降解、脱色
收稿日期 ：2014-12-01
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31170553），国家林业局“948”项目（2012-4-03）
作者简介 ：王紫娟，女，硕士研究生，研究方向 ：污染物降解，蛋白提纯 ；E-mail ：huerniaoming@163.com
通讯作者 ：赵敏，教授，研究方向 ：微生物降解 ；E-mail ：82191513@163.com
疣孢漆斑菌 Myrothecium verrucaria GH-01 漆酶的纯化
和酶学性质研究
王紫娟  赵敏
（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）
摘 要 ： 疣孢漆斑菌具有生长周期短，分泌漆酶酶活高等特点。利用已分离得到的疣孢漆斑菌 GH-01（Myrothecium
verrucaria GH-01）发酵产生粗酶液。进而通过分级沉淀、透析和层析的方法对漆酶粗酶液进行纯化。SDS-PAGE 和 Native-PAGE 结
果表明纯化可获得具有漆酶活性的单体蛋白。酶学性质研究表明，该漆酶催化最适温度为 40℃，在底物 ABTS 存在条件下的最适
pH 值为 4.0，且在低温及碱性条件具有较好的稳定性。此外通过漆酶对 4 大类染料脱色能力的研究，发现该漆酶对偶氮类的橙黄
Ⅰ和蒽醌类的茜素红脱色有较好的脱色效果，反应 1 h 脱色率达 80% 以上 ；对三苯甲烷类的碱性品红脱色能力较弱，脱色率只能
达到 20% 左右 ；脱色率最差的是杂环类的亚甲基蓝。在含 10 U 漆酶的体系中，对 50 mg/L 的染料降解效果相对最佳。
关键词 ： 疣孢漆斑菌漆酶 ；纯化 ；酶学性质
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.018
Purification and Enzymatic Properties of Laccase from Myrothecium
verrucaria GH-01
Wang Zijuan Zhao Min
（College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040）
Abstract ： Myrothecium verrucaria has the advantages of short growth cycle and high enzyme activity of secreting laccase. In this
study, the crude enzyme was produced by the M. verrucaria GH-01 obtained by separation. Further we purified the crude enzyme by fractional
precipitation, dialysis and chromatography. The results of SDS-PAGE and Native-PAGE indicated that the monosome protein with laccase activity
was obtained by purification. The study of enzymatic properties of laccase showed that the optimal temperature of catalyzed reaction for laccase
was 40℃, and the laccase activity against ABTS showed a maximum at pH4.0. It had the favorable stability under the low temperature and
alkaline conditions. Besides, studying the laccase decolorizing of 4 representative dyes demonstrated that the laccase decolorizing rate for orange
I of azo dyes and alizarin red of anthraquinone class was the highest with decolorizing rate over 80% by 1 h, lower for fuchsin of triphenylmethane
class with decolorizing rate only 20% and lowest for methylene blue of heterocyclic class. In 10 U laccase system, the decolorizing degree of the
50mg/L dye concentration was optimal.
Key words ： Myrothecium verrucaria GH-01 ；purification ；enzymatic properties
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8120
和制备生物电极等［1-5］。由于其具有宽范的底物特
异性、催化反应没有过氧化物和有毒物质的生成，
以及对环境无污染的特性［7］，因而近年来得到了越
来越多的关注，成为了环保应用酶的研究热点。
由于目前对真菌漆酶的研究较为深入，而产
漆酶真菌的主要来源是担子菌亚门的白腐真菌，而
对于丝状真菌研究较少。疣孢漆斑菌为半知菌的一
种，其菌株具有生长周期短、生活史简单、易于遗
传改造等优点，可为后续可大规模发酵提供良好的
基础［8］。本研究利用一株高产漆酶的疣孢漆斑菌 M.
verrucaria GH-01 获得漆酶，并对该酶进行纯化和酶
学性质的研究，探索其在染料脱色应用中的可能性，
旨在为拓展半知菌漆酶种类、研究漆酶催化性能以
及后续该漆酶的应用奠定良好基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 疣孢漆斑菌 GH-01（Myrothecium
verrucaria GH-01）：采自黑龙江凉水林区，经筛选和
鉴定，保存于东北林业大学微生物实验室。
1.1.2 试剂和仪器 2，2- 联氮 - 二（3- 乙基 - 苯并
噻 唑 -6- 磺 酸 ） 二 铵 盐（ABTS），DEAE-Sepharose
FF 凝胶，SephadexG-75 凝胶，蛋白质 marker，其它
试剂均为国产分析纯。紫外可见分光光度计、数显
恒温水浴锅、台式离心机、梯度混合器、恒温振荡
培养箱、稳压稳流电泳仪、涡旋混匀器、紫外检测仪、
自动部分收集器等。
1.1.3 培养基 平板活化固体 PDA 培养基 ：马铃薯
200 g，切成大约 1 cm3 的小块，沸水煮 30 min，过
滤取滤液补足至 1 000 mL。加入蛋白胨 30 g，葡萄
糖 40 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO4 3 g，加入 20 g
琼脂，121℃灭菌 15 min。
发酵培养基 ：去皮马铃薯 200 g，切成约 1 cm 3
的小块，在 1 L 水中煮沸 30 min，过滤取滤液补足
1 L。加入蛋白胨 36 g，葡萄糖 24 g，MgSO4·7H2O 1.8
g，KH2PO4 3.6 g，铜离子浓度 0.2 mmol/L，把培养基
分装到 250 mL 三角瓶中，121℃灭菌 15 min。
1.2 方法
1.2.1 样品制备 在培养 8 d 的平板活化固体 PDA
培养基上用打孔器打 6 个直径为 1 cm 的菌饼，接种
到装有 100 mL 发酵培养基中，28℃下恒温培养箱振
中 140 r/min 振荡培养 10 d 作为发酵液。将发酵液样
品在 10 000 r/min 条件下离心 10 min，上清液即为粗
酶液。
1.2.2 漆 酶 活 力 测 定 漆 酶 酶 活 测 定 以 ABTS 为
底物，利用紫外分光光度法测定。将 2.95 mL 0.1
mol/L 柠檬酸 - 磷酸氢二钠缓冲液（pH4.0）和 1 mL
1 mmol/L 的 ABTS 溶 液 组 成 的 反 应 体 系 置 于 28℃
水 浴 锅 内， 加 入 适 当 稀 释 的 酶 液 50 μL（ 空 白 对
照为经过高温灭活的酶液），反应 3 min，利用紫
外分光光度法测定 420 nm 处吸光度的变化值。每
个 样 品 取 3 次 测 量 的 平 均 值。 漆 酶 活 力 的 计 算
公式 ：
ΔA·V·n
ε420·v·L·t·c
䞦⍫࣋U/L
式中，△ A ：吸光度的变化值 ；V ：溶液的体积（L）；
ε420 ：消光系数（3.6×10
4 mol-1·cm-1·L）；v ：加入
粗酶液的体积（mL）；L ：比色皿的光径（cm）；t ：
反应时间（min）；c ：10-6 mol。
1.2.3 漆酶的分离纯化 将粗酶液上清逐渐加入硫
酸铵，测其不同饱和度下的漆酶活力（在冰浴中
进行）。选择最佳饱和度，收集沉淀。用 10 mmol/L
pH7.8 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液反复冲洗沉淀使
其溶解。8 000 r/min 下离心 10 min，去除不溶杂质，
收集上清液。将上清液置于透析袋中 4℃透析过夜，
聚乙二醇（PEG20000）适当浓缩。浓缩好的样品加
入缓冲液平衡过的 DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子
交换层析柱中。 用缓冲液配制的 0-1 mol/L NaCl 溶
液梯度洗脱。收集在 280 nm 处有吸收峰的溶液，测
定其漆酶活力，将有酶活性的溶液按活力高低分别
收集并适当浓缩。随后将样品加入缓冲液平衡过的
SephadexG-75 凝胶过滤柱中，用缓冲液洗脱，收集
漆酶活力较高的部分。
1.2.4 蛋 白 质 电 泳 SDS-PAGE 和 Native-PAGE 参
照郭尧君［9］的方法。SDS-PAGE 电泳采用 5% 浓缩
胶和 12% 分离胶进行，凝胶用考马斯亮蓝 R250 染
色。Native-PAGE 采用 5% 浓缩胶和 12% 分离胶进行，
用含有 3 mmol/L ABTS 的 Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液对
凝胶染色，观察绿色的条带。
2015,31(8) 121王紫娟等 ：疣孢漆斑菌 Myrothecium verrucaria GH-01 漆酶的纯化和酶学性质研究
1.2.5 漆酶的性质研究 测定温度对粗漆酶活性的
影响 ：将含有漆酶的缓冲液在 20-60℃下保温 3 min
后测定酶活力。测定温度对粗漆酶稳定性的影响 ：
将酶液置于 4-60℃下保温，每隔一段时间后取样，
在 30℃下测定酶活力。测定 pH 值对粗漆酶活性的
影响 ：将底物溶解于 pH3.0-8.0 的磷酸氢二钠 - 柠
檬酸缓冲液中测定漆酶活力。测定 pH 值对粗漆酶
稳定性的影响 ：将酶液溶于 pH3.0-8.0 的磷酸氢二
钠 - 柠檬酸缓冲液中，每隔一段时间取样，测定酶
活力。
1.2.6 染料降解研究 染料降解反应在磷酸氢二
钠 - 柠 檬 酸 缓 冲 液（10 mmol/L pH8.0） 中， 温 度
28℃中进行，以加入高温灭活的漆酶为对照，用紫
外分光光度计检测染料在其最大吸收波长处的吸光
度变化。考察漆酶对偶氮类染料橙黄 I、蒽醌类染料
茜素红、三苯甲烷类染料碱性品红和杂环类染料亚
甲基蓝等四类染料的降解脱色程度、染料浓度对脱
色影响及漆酶含量对降解的影响。
脱色率 =（1-A/A0）×100%
式中，A0 ：脱色反应前溶液吸光值，A ：脱色
反应后溶液吸光值。所有脱色反应均重复 3 次取平
均值。
2 结果
2.1 硫酸铵饱和度的确定
在 0℃冰浴条件下，逐渐加入硫酸铵，饱和度
从 0-80% 对 M. verrucaria GH-01 发酵上清液进行盐
析，结果如图 1 所示。随着硫酸铵的加入，蛋白被
慢慢析出。当硫酸铵的饱和度达到 65% 时，发酵液
100
80
60
40
20
0
0 20 40 60 80⺛䞨䬥価઼ᓖ%⴨ሩ䞦⍫%
图 1 硫酸铵分级沉淀的结果
上清的酶活为 49.8 U/L，上清液的相对酶活为最开
始的 2.8%，说明酶蛋白基本都被硫酸铵沉淀结合了。
因此确定硫酸铵的饱和度为 65%。
2.2 纯化后漆酶的电泳结果
从发酵液上清的粗酶液到纯化最终获得的酶
液，结果如表 1 所示。最终获得 8 mL 液体样品，
总 酶 活 1 782.93 U， 总 蛋 白 3.75 mg， 漆 酶 比 活 力
475.45 U/mg，回收率 29.34%，纯化倍数 4.77。
表 1 漆酶的纯化结果
纯化步骤
总蛋白
/mg
总活力
/U
比活力 /
（U·mg-1）
纯化倍数
回收率
/%
粗酶 61.04 6076.80 99.55 1.00 100
盐析、透析 23.10 4302.37 186.25 1.87 70.80
DEAE-Sepharose 6.79 2701.94 397.93 4.00 44.46
SephadexG-75 3.75 1782.93 475.45 4.77 29.34
2.3 纯化后漆酶的电泳结果
将最终纯化得到的酶液进行 SDS-PAGE 和 Native
SDS-PAGE 电泳，结果如图 2 所示。SDS-PAGE 电泳
（图 2-A）显示，出现蓝色单一条带，说明了从 M.
verrucaria GH-01 发酵上清液纯化后得到的漆酶为单
体蛋白，目的蛋白分子量约为 60 kD。通过对 Native
SDS-PAGE 电泳的一块胶的不同处理，一半用考马
斯亮蓝染色并脱色，另一半进入到含有 ABTS 的缓
冲溶液中。结果（图 2-B）表明，纯化酶液的单一
性和漆酶活性。至此获得 M. verrucaria GH-01 电泳
纯单体蛋白。
97.2
kD
1 2 3 4
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
A B
1 ：蛋白质 marker ；2 ：纯酶 ；3 ：ABTS 染色过的纯酶 ；4 ：考马斯亮蓝染色
过的纯酶
图 2 漆酶 SDS-PAGE（A）和 Native-PAGE（B）
电泳结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8122
2.4 温度对漆酶活性的影响及热稳定性的研究
在不同温度下测定 M. verrucaria GH-01 的漆酶
活力，结果（图 3）显示，漆酶活性最适反应温度
为 40 ℃，在 20-60℃下也表现了较高活性。温度对
漆酶稳定性的影响如图 4 所示，0℃保存条件下，漆
酶保存 3 h 活力基本无变化 ；20、30℃条件下保存
漆酶 3 h，漆酶活力保持 70% 以上 ；40-60℃保存下
的漆酶活力下降较快。综合考虑温度对漆酶活力及
稳定性的影响，本实验后续对染料的降解实验，温
度选择 30℃。
下降到 5%，说明了此漆酶不耐酸。
2.6 漆酶对不同染料的脱色
4 种染料橙黄 I、亚甲基蓝、茜素红的染料浓
度为 50 mg/L，加入等量漆酶 10 U，结果如图 7 所
示。漆酶对橙黄 I 和茜素红脱色程度较高，反应 1 h
后脱色率达到 80% 以上，对碱性品红脱色率较低在
20%，而对亚甲基蓝脱色率最低。随着时间的变化，
料橙黄 I 和亚甲基蓝变化幅度较小 ；而茜素红和碱
性品红随时间变化，降解率有一定幅度的升高。
2.7 考察不同染料含量对脱色率的影响
分别配制含量为 5-100 mg/L 的 4 种不同染料，
其中都加入含量为 10 U 的漆酶。染料的脱色情况（图
8）表明，脱色效率较好的橙黄 I、茜素红以及脱色
率较低的碱性品红都是在染料浓度为 50 mg/L 时脱
色效率达到最高 ；而亚甲基蓝的浓度为 10 mg/L 和 5
mg/L 时脱色效率较好。
100
80
60
10
20
0
20 30 40 50 60⑙ᓖć⴨ሩ䞦⍫%
图 3 温度对粗漆酶活力的影响
100
80
60
40
20
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180ᰦ䰤min⴨ሩ䞦⍫%
图 4 温度对漆酶稳定性的影响
2.5 pH值对漆酶活性的影响及pH稳定性的研究
不同 pH 值对粗漆酶活力的影响（图 5）显示，
漆酶活性最适反应 pH 值为 4.0，在 pH 值为 3、7、
8 的条件下，酶活相对较低。pH 值对漆酶稳定性的
影响（图 6）显示，pH 值为 6.0 的条件下，粗漆酶
保存 3 h 活力保持在 75% 以上 ；pH 值为 3.0、4.0 条
件下保存粗漆酶 3 h，酶活力粗漆酶活力下降较快，
2000
2200
2400
2600
1800
1600
1400
1200
1000
0 3 4 5 6 8 97
pH
䞦⍫U·L-1 
图 5 pH 值对粗漆酶活力的影响
10000
8000
6000
4000
2000
0
0 12 24 36 48 60
pH 3.0
pH 4.0
pH 5.0
pH 6.0
pH 7.0
pH 8.0ᰦ䰤h䞦⍫U·L-1 
图 6 pH 值对漆酶稳定性的影响
2015,31(8) 123王紫娟等 ：疣孢漆斑菌 Myrothecium verrucaria GH-01 漆酶的纯化和酶学性质研究
2.8 漆酶含量的影响
漆酶含量对橙黄Ⅰ的降解脱色影响，如图 9 所
示。虽然漆酶的含量不同，但经过 24 h 的降解脱色，
脱色效率都达到 80% 以上。说明此漆酶对橙黄Ⅰ有
很好的脱色效果。另外，随着漆酶的含量增加，其
脱色效率有小幅上升。由此可见漆酶含量对橙黄Ⅰ
的降解有一定的影响，但影响较小。
3 讨论
虽然漆酶在动物、植物、微生物中等均能找到
其存在的证据，但真菌漆酶由于其产酶量高和纯化
技术相对容易，从而得到了最广泛的研究。在真菌
漆酶的研究中又以子囊真菌（Ascomycetes）和担子真
菌（Basidiomycetes）研究的最多，而半知菌研究的
特别少。目前对半知菌漆酶的研究主要集中在产酶
菌株的分离筛选和产酶条件水平上，如拟盘多毛孢
属（Pestalotiopsis sp.）、新月弯孢（Curvularia lunata）
和棘胞木霉（Trichoderma asperellum）等，但产酶水
平与白腐真菌相比较低［9-12］。本研究不仅拓展了漆
酶蛋白来源而且其对染料的降解方面表现出了很好
的应用价值。
从 M. verrucaria GH-01 发酵上清液中，通过硫
酸铵分级沉淀、透析和离子交换柱层析纯化到了具
有胞外漆酶活性的酶蛋白液，并通过 SDS-PAGE 和
Native -PAGE 证明了此酶为单体蛋白和具有漆酶活
性。但从一些真菌中得到的漆酶，由于糖基含量的
不同和自身结构差异，会使得其在分子质量存在较
大差异，基本范围在 50-130 kD 之间 ；同时也会有
同工漆酶的出现。 Mimoz［13］ 就从 Pleurotus eryngii
的上清发酵液中纯化出性质不同的两种漆酶同工酶，
它们的糖基含量和酶学性质等存在很大差异，而白
蜡地层孔菌（Fomitella fraxinea）的两种同工酶 Lac1
和 Lac2 性质就很接近［14］。虽然漆酶的大小、性质
及其结构都有一定的差距，但从一些漆酶的结晶分
析中可知，其三级结构又有着一定的共性，大部分
的漆酶催化中心都有 4 个 Cu2+，他们在漆酶的催化
反应中起着重要作用［15］。这也是值得我们去探索与
研究的方面。
漆酶的酶学性质研究表明，我们所得的漆酶
与大部分真菌漆酶的性质基本相符，其最适温度为
40℃，30℃条件下保存粗漆酶 3 h，其酶活力在 70%
以上 ；最适 pH 为 4.0，并在低温及在碱性条件可
以较好的维持漆酶的稳定性。染料在化工行业大量
使用，但由于其一些染料自然条件下很难降解，需
要特殊处理才能降解。而漆酶的一个重要应用就是
对染料的降解。所得漆酶在对 4 种染料的脱色实验
中，对橙黄 I 和茜素红降解程度较高，反应 1 h 后降
90
80
70
60
10
55
0
15 min 1 h 24 hᰦ䰤㝡㢢⦷% ₉哴I⻡ᙗ૱㓒㥌㍐㓒ӊ⭢ส㬍
图 7 不同染料随时间的降解情况
90
80
70
60
20
10
15
5
0 ₉哴I ⻡ᙗ૱㓒 㥌㍐㓒 ӊ⭢ส㬍㝡㢢⦷% 100 mg/L50 mg/L25 mg/L10 mg/L5 mg/L
图 8 漆酶含量对不同的染料的降解情况
88
82
84
86
80
78
74
76
72
0 4 8 12 16 20 24
10 U
8 U
6 U
4 U
2 Uᰦ䰤h㝡㢢⦷%
图 9 漆酶含量对橙黄Ⅰ的降解情况
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8124
解率即可达到 80% 以上，对碱性品红降解率较低在
20%，漆酶对亚甲基蓝降解率最低 ；染料浓度为 50
mg/L 时，其中 3 种染料的脱色率都是最好的 ；漆酶
对橙黄 I 脱色效果随着酶量的增加而逐渐显著。综
上所述，该漆酶具有较好的应用前景和潜在的应用
价值。
4 结论
对已经分离鉴定出的疣孢漆斑菌 GH-01 所产漆
酶对其进行分离纯化，得到单体纯蛋白。该漆酶催
化反应的最适温度为 40℃，最适 pH 值为 4.0。该漆
酶在低温及碱性条件具有较好的稳定性。在对染料
的脱色能力的研究中，该漆酶对橙黄Ⅰ和茜素红脱
色效果较佳，对碱性品红和亚甲基蓝脱色能力较弱。
当染料未被酶饱和时，随着漆酶浓度的增加，脱色
率也会增加。在含 10 U 漆酶的体系中，对 50 mg/L
的染料降解效果相对最好。
参 考 文 献
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（责任编辑　李楠）