全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-05-05
基金项目 ：国家转基因重大专项（2008ZX08002-005）
作者简介 ：单曙光，男，硕士研究生，研究方向 ：植物抗逆分子机理；E-mail:shanshuguang1984@163.com
通讯作者 ：程宪国，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：植物营养与抗逆分子机制；E-mail:chengxianguo@tsinghua.org.cn
大豆转录因子 GmC2H2 基因转化拟南芥效果分析
单曙光 于国红 徐娜 程宪国
（中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 农业部植物营养与肥料重点实验室 , 北京 100081）
摘 要 ： GmC2H2 转录因子基因是本实验室获得的一个编码 172 个氨基酸携带 516 bp 核苷酸的转录因子 , 属于经典
C2H2 型锌指蛋白。通过构建植物表达载体 GmC2H2-pCAMBIA1304，借助优化的 Floral-dip 法转化模式植物拟南芥，经潮霉素
Hygromycine（45-50 mg/L）抗性筛选获得转基因拟南芥植株。GUS 组织染色分析表明，GmC2H2 基因在生长 12 d 的转基因拟南
芥幼苗中，表达部位主要集中在根部。对转基因拟南芥进行了低温（1℃）和脱落酸（200 μmol/L）胁迫处理，测定其生理生化指标，
通过 real-time qPCR 确定目的基因在转基因拟南芥中的表达情况。结果表明，携带 GmC2H2 目的基因的转基因拟南芥中脯氨酸和
可溶性糖水平要高于野生型植株，而丙二醛水平要低于野生型，在抗逆性方面明显优于野生型拟南芥植株；并且胁迫处理下的转
基因拟南芥中 GmC2H2 基因的表达量要高于未胁迫处理的转基因植株，说明 GmC2H2 基因的表达受低温和 ABA 的诱导，初步明
确了该转录因子基因的功能。
关键词 ： GmC2H2 锌指蛋白 转基因拟南芥 GUS 检测 Real-time qPCR
Effects Analysis of Transcription Factor GmC2H2 in
Transgenic Arabidopsis
Shan Shuguang Yu Guohong Xu Na Cheng Xianguo
（The Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizers, Ministry of Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Institute of Agricultural
Resources and Regional Planning, Beijing 100081）
Abstract: A transcription factor named GmC2H2 is consisted of encoding 172 amino acids with an open reading frame of 516 bp length,
and belonging to the classical C2H2 zinc finger protein family. In this study, GmC2H2-pCAMBIA1304, a high efficient expression vector,
was constructed and transferred into wild type Arabidopsis using floral-dip method. 13 regenerated plant were selected in T0 generation by
Hygromycine ( 45-50 mg/L), and 10 positive seedlings were obtained by PCR and GUS detecting. The positive ration was 77%. Histochemical
staining analysis of the report gene GUS showed that GmC2H2 was expressed in the roots from 12-days-old of transgenic Arabidopsis thaliana. In
this study, to determine expression of GmC2H2, the transgenic Arabidopsis plants were treated with 1℃ and ABA, respectively. To determine the
effect of stress resistance and expression patterns of GmC2H2 gene, physiological and biochemical indexes and real-time qPCR were determined.
The increased levels of free proline and soluble sugars were observed in transgenic Arabidopsis with containing the gene GmC2H2 compared
to wild-type plants under salt stress，while the MDA has a lower level related to wild type plants . Accumulation of GmC2H2 mRNA is higher
in transgenic Arabidopsis after treatment with low temperature at 1℃ and ABA. This shows that GmC2H2 was induced by low temperature and
ABA, and initially defined the function of the transcription factor genes.
Key words : GmC2H2 Zinc finger protein Transgenic Arabidopsis GUS analysis Real-time qPCR
锌指蛋白（zinc finger protein）是一类具有“指
状”结构域的转录因子，主要功能是调控基因的表
达，其特征是通过结合 Zn2+ 来稳定一种很短的可自
我折叠成“手指”形状的蛋白结构 [1]。根据半胱氨
酸（C）和组氨酸（H）残基的数目和位置可将锌指
蛋白转录因子分为 C2H2、C6、C8、C2HC 及 C2C2
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期76
等 8 个亚类，其中以 C2H2 型最多 [2]。C2H2 型锌指
蛋白基因最早在非洲爪蟾中发现 [3]，植物中发现的
第一个 C2H2 型锌指蛋白基因是在矮牵牛中分离得
到的 ZPT2-1[4]，它在矮牵牛花瓣中特异表达，且能
和烯醇丙酮酰莽草酸 -3- 磷酸合成酶（EPSPE）基因
的 5 端上游调节区结合，因此可看作是 EPSPE 基
因的特异性激活因子。之后又在矮牵牛中发现了参
与花药发育的 C2H2 型锌指蛋白基因 [5, 6]，在拟南芥
中同样也发现了控制花发育的 SUPERMAN 锌指蛋
白基因 [7-10]。STZ（salt tolerance zinc finger）基因是
Lippuner 等 [11] 利用酵母盐敏感突变体，采取功能互
补方法，从拟南芥 cDNA 文库中筛选到了一个具有
典型 C2H2 型双锌指结构的转录因子，该基因可以
补偿因钙调磷酸酶缺陷所导致的酵母盐敏感性。目
前已经在矮牵牛、拟南芥、棉花和水稻等多种植物
中克隆出锌指蛋白基因，它们主要与植物的生长发
育以及植物的抗逆性有关 [2]。
在对非生物胁迫的作物抗逆分子育种中，与
导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的方法相
比，导入或改良一个转录因子是提高某种抗性的更
为有效的方法和途径 [12] 。大豆作为优质的种质资
源，其基因组内含有很多相关抗逆基因和抗逆转录
因子 [13,14]。自 Kim 等 [15] 报道大豆冷诱导锌指蛋白基
因 SCOF-1 以来，大豆中 C2H2 型锌指蛋白转录因子
报道较少 [14]。本研究获得一个大豆 C2H2 型锌指蛋
白基因（GenBank 登录号 : DQ055134），将其构建到
植物表达载体 pCAMBIA1304 上，导入模式植物拟南
芥中，通过传代抗性筛选和 GUS 组织染色分析，获
得携带有 GmC2H2 基因的单拷贝插入的纯合系转基
因拟南芥，然后进行低温和 ABA 处理，测定其可溶
性糖、丙二醛及脯氨酸含量等与抗逆相关的生理生
化指标，以及 GmC2H2 基因的表达水平情况，以明
确该基因的功能，为该基因在抗逆作物的育种提供
技术支持和材料支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
拟南芥（Arabidopsis thaliana Columbia），大肠菌
（Escherichia coli）DH5α 菌株，根癌农杆菌（Agrobac-
terium tumefaciens）GV3101 菌株，pGEX4T::GmC2H2
质粒由本实验室保存，植物表达载体 pCAMBIA1304
质粒由中国农业大学药物分子生物学实验室友好
惠赠。
各种内切酶、T4 DNA 连接酶均购自 NEB 公司；
Taq DNA 聚合酶和 DNA Marker 购自北京全式金生物
技术有限公司；各种培养用试剂购自 Oxoid 公司和
Sigma 公司；卡那霉素（Kan）、氨苄青霉素（Amp）、
利福平（Rif）及潮霉素（Hyg）等抗生素购自 Sigma
公司；质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒购自北京
博 迈 德 科 技 发 展 有 限 公司；RNAprep pure 植 物 总
RNA 提取试剂盒、Quant cDNA 第一链合成试剂盒、
RealMasterMix（SYBR Green）购自天根生化科技有
限公司。
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合
成；测序由北京三博远志生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 GmC2H2 基因植物表达载体的构建 将 GmC-
2H2 基因全长编码序列以质粒 pGEX4T::GmC2H2 为
模板进行 PCR 扩增。上游引物（GmC2H2F）：5-A
ACACC ATggCCATgAAgAgA ggCAgA gA-3；下游引物
（GmC2H2R）：5-AgACACTAgTAATgAAAC AATTgAg
CAC-3，将扩增产物纯化后，经 Spe I 和 Nco I 双酶
切构建到具有强启动子 CaMV35S 的 pCAMBIA1304
植物表达载体上（图 1），该载体携带由 CaMV35S
启动子启动的 Gus 报告基因。
Nco I Spe I
mGFP5
gus A
Histidine tag
CaMV 35S promoter
Kan
GmC2H2-pCAMBIA 1304
12 946 bp
GmC2H2
图 1 植物表达载体的构建示意图
1.2.2 Floral-dip 法转化拟南芥 将重组质粒 GmC2-
H2-pCAMBIA1304-35s 以及空载体质粒 pCAMBIA13-
04-35s 分 别 转 化 农 杆 菌 GV3101 菌 株， 挑 取 阳 性
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农杆菌转化子，接种到含有利福平和卡那霉素的
YEB 培 养 基 中，28 ℃、250 r/min 振 荡 培 养。 当 菌
液 OD600=1.5-2.0 时，将培养液按 1 50 比例转接培
养，在 OD600=1.8-2.0 时终止培养。离心收集菌体，
用花序浸染液（5% 的蔗糖溶液，加入体积比 0.04%
的吐温 -80）悬浮菌体，使 OD600=0.6。利用优化的
Floral-dip 法 [16] 浸染拟南芥花序：选取开花前 10 d 的
健壮植株，使整个花序浸泡于浸染液中 60 s，而莲
座叶片尽量不与浸染液接触，浸染后以较高的湿度
暗箱培养 24 h 后正常培养。隔 3 d 处理 1 次，3 次
后使其正常开花结果，收获种子（记为 T0 代）。
1.2.3 转基因植株的筛选及纯合株系的获得 种子
T0 代种子消毒后，均匀撒播于含有潮霉素（Hyg，
45-50 mg/L）的 MS 抗性平板上筛选，筛选出的抗性
植株分株系收获种子，记为 T1 代。同样，将 T1 代
种子抗性筛选，这时不同转基因株系的 T1 代种子幼
苗会对潮霉素的抗性发生不同的性状分离，分离比
接近 3 1 的株系很可能为纯合系，收获种子记为 T2
代。将 T2 代种子再经潮霉素抗性筛选，如果幼苗全
为抗性苗，则该株系为纯合的转基因植株。
1.2.4 转基因植株的 PCR 检测 采用 CTAB 法提取
野生型、空载体转基因型拟南芥的基因组 DNA。以
此为模板，正向引物 GmC2H2F、反向引物 GmC2-
H2R 为引物，进行 PCR 反应扩增检测。
1.2.5 转基因植株的 GUS 组织染色 将幼苗期 12 d
左右的纯合系转基因拟南芥幼苗浸泡于 GUS 组织染
色液（100 mmol/L pH7.2 磷酸缓冲液，0.5 mmol/L 铁
氰化钾，0.5 mmol/L 亚铁氰化钾，1 mg/mL X-Gluc，2-3
滴吐温 -20）中，37℃避光染色 12-36 h，然后用无
水乙醇脱色至无色，置于体视显微镜下观察、照相。
1.2.6 转基因拟南芥植株的胁迫处理 将出苗 3-4
周左右的转基因拟南芥阳性植株分别进行逆境胁迫
处理，即低温（1℃）和喷施 ABA（200 μmol/L），经
过 0、6、12、24 和 48 h 后分别取样。取样后立即
放于液氮速冻，后保存于 -80℃超低温冰箱中，以备
生理生化指标测定和 RNA 提取。
1.2.7 生理生化指标测定及 real-time qPCR 对胁迫
处理的植株分别进行可溶性糖、丙二醛、脯氨酸含
量以及细胞膜损伤情况测定，明确其抗逆情况，方
法参照文献 [17] 和 [18]。另外，对处理植株的根和
叶分别提取 RNA，反转录成 cDNA 后进行 real-time
qPCR 测定 GmC2H2 基因的表达情况。
2 结果
2.1 植物表达载体的构建
用 Spe I 和 Nco I 对 PCR 纯化产物和 pCAMBIA-
1304 质 粒 双 酶 切， 经 T4 DNA 连 接 酶 构 建 得 到
GmC2H2-pCAMBIA1304 植物表达载体质粒，经 PCR
鉴定（图 2）和双酶切鉴定（图 3），得到预期大小
的目的片段，后经测序序列正确，说明目的基因
GmC2H2 成功构建到载体 pCAMBIA1304 上。
M. DNA marker ；1.PCR 产物
图 2 GmC2H2 基因的 PCR 鉴定图谱
M.DNA marker ； 1. 重组质粒酶切产物
图 3 GmC2H2 基因的酶切鉴定图谱
2.2 转基因植株的抗性筛选
将 T0 代种子在潮霉素（45-50 mg/L）抗性平板
单曙光等 ：大豆转录因子 GmC2H2 基因转化拟南芥效果分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期78
上筛选，未转化的拟南芥种子不生根，长出两片子
叶后黄化死亡，而转化的拟南芥种子能够正常生长
（图 4）。将 T0 代筛选得到的拟南芥抗性苗所结 T1
种子再进行抗性筛选，T1 代种子会有不同比例的分
离，将分离比接近 3 1 的 3 个株系单株收取 T2 代
种子，T2 代种子抗性筛选后全为绿色抗性苗（图 5）。
得到的 T3 代种子即为外源基因单拷贝插入的纯合
株系。
素（45-50 mg/L）抗性平板上，选取生长 12 d 的幼
苗，进行 GUS 组织染色分析（图 7）。转化空载体
pCAMBIA1304 质粒的拟南芥，GUS 基因在整个植株
中表达（图 7-B），而携带 GmC2H2 目的基因的转基
因拟南芥，GUS 基因的表达主要集中在根部（图 7-C，
D）。同时，也表示外源基因已经整合到拟南芥基因
组上并得以稳定遗传。
图 4 培养基 T0 代转基因拟南芥种子在潮霉素抗性的筛选
图 5 培养基 T2 代转基因拟南芥种子在潮霉素抗性的筛选
M.DNA marker ；CK-. 阴性对照 ；CK+. 阳性对照 ；1-13. 转基因拟南芥植株
图 6 转基因拟南芥植株的 PCR 检测
A B
DC
A. 野生型拟南芥；B. 转化空载体 pCAMBIA1304 质粒的拟南芥；
C，D. 携带 GmC2H2 目的基因的转基因拟南芥
图 7 转基因拟南芥 GUS 组织染色
2.3 转基因植株的PCR检测
将筛选得到的 13 株拟南芥植株提取基因组
DNA，野生型拟南芥基因组 DNA 为对照进行 PCR
扩增，其中有 10 棵拟南芥基因组 DNA 扩增出 516
bp 的条带（图 6），阳性率为 77%。
2.4 幼苗期的拟南芥植株GUS组织染色分析
将筛选得到的纯合株系植株均匀撒播于潮霉
2.5 低温和ABA处理下转基因拟南芥的生理生化
指标分析
对转基因拟南芥进行低温（1℃）和 ABA 处理，
分别在 0、6、12、24 和 48 h 取样，测定其生理生
化指标。经分析得知，在 1℃条件处理下，野生型
拟南芥丙二醛的含量随低温时间的增加而增加，说
明细胞膜氧化水平高，转基因植株的丙二醛含量在
低温处理 6 h 之后变化不明显，且含量低于野生型
植株（图 8）；野生型拟南芥在可溶性糖含量方面随
时间变化不大，而转基因植株可溶性糖含量随处理
时间延长而增加（图 9）；野生型植株的脯氨酸含量
几乎没有变化，而转基因植株在低温处理 24 h 后增
加明显（图 10）；野生型植株和转基因植株随处理
时间的增加，细胞膜的损伤都加大，但是转基因植
株的细胞膜损伤率要低于野生型植株（图 11）。以上
生理指标测试表明，转基因植株在抗低温方面要优于
野生型植株。
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ABA 处理下，转基因植株和野生型植株丙二醛
含量都随处理时间的增加而增加，但是在 48 h 下降
（图 12）；野生型植株的可溶性糖含量也随着处理时
间而增加，但效果不明显，而转基因植株增加明显，
并且在 12 h 后含量趋于稳定（图 13）；野生型植株
随处理时间脯氨酸含量变化不明显，而转基因植株
在 12 h 后脯氨酸含量明显增加（图 14）；细胞膜的
损伤情况随处理时间变化不明显（图 15），可能是
由于 ABA 只是提高植株的抗逆性，对植株本身损害
方面影响不大。
图 8 低温处理条件下野生型植株和转基因植株MDA 含量变化
图 9 低温处理条件下野生型植株和转基因植
株可溶性糖含量变化
图 10 低温处理条件下野生型植株和转基因
植株脯氨酸含量变化
图 11 低温处理条件下野生型植株和转基因植株
细胞膜损伤情况
图 12 ABA 处理下野生型植株和转基因植株MDA 含量变化
图 13 ABA 处理下野生型植株和转基因植株可
溶性糖含量变化
图 14 ABA 处理下野生型植株和转基因植株
脯氨酸含量变化
单曙光等 ：大豆转录因子 GmC2H2 基因转化拟南芥效果分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期80
2.6 低温和ABA处理下转基因拟南芥中GmC2H2的
表达
为阐述目的基因 GmC2H2 在转基因拟南芥中的
表达模式，对生长 3-4 周的转基因拟南芥进行了低
温和 ABA 处理，并在指定时间段对叶和根分别进
行取样，提取总 RNA，反转录成 cDNA 后进行 real-
time qPCR 来检测目的基因在不同胁迫条件下的表达
特征。
当低温处理达到 6 h 时，转基因植株的叶和根
中 GmC2H2 基因显著被诱导，它的 mRNA 累积量
达到最高值，之后叶中的 mRNA 累积量开始下降
（图 16），而根中的 mRNA 累积量则 24 h 之后开始
下降（图 17）。在 ABA 处理条件下，叶中 GmC2H2
基因的表达随处理时间的增加逐渐被诱导，24 h 时
mRNA 累积量达到最大，之后下降（图 18），而根
中 mRNA 累积量随时间是逐渐增加的，48 h 达到最
大（图 19）。试验结果表明，在低温和 ABA 条件下，
GmC2H2 基因的表达量都有不同程度的增加，可以
推测 GmC2H2 基因调控抗逆基因方面可能受到低温
和 ABA 的诱导。
3 讨论
利用基因工程手段将一些具有抗逆功能的转录
因子导入植株中，是目前普遍使用的提高植物抗逆
性的策略。本研究中的 GmC2H2 转录因子基因是本
实验室在前期研究获得的，其核苷酸长度 516 bp，
编码 172 个氨基酸，属于经典 C2H2 型锌指蛋白基
因家族。前人对 C2H2 型锌指蛋白研究发现，C2H2
型锌指蛋白主要对参与植物各个时期的生长发育以
及提高植物的抗逆性 [2]。目前，对大豆中 C2H2 型
锌指蛋白基因研究较少 [14]。Kim 等 [15] 克隆出第一
图 15 ABA 处理下野生型植株和转基因植株
细胞膜损伤情况
图 16 GmC2H2 基因在低温处理条件下叶中的mRNA 累积特征
图 17 GmC2H2 基因在低温处理条件下根中的mRNA 累积特征
图 18 GmC2H2 基因在 ABA 处理条件下叶中的mRNA 累积特征
图 19 GmC2H2 基因在 ABA 处理条件下根中的mRNA 累积特征
2011年第12期 81单曙光等 ：大豆转录因子 GmC2H2 基因转化拟南芥效果分析
个大豆 C2H2 型锌指蛋白基因 SCOF-1，研究发现其
主要受冷诱导调控基因的表达，该基因的编码产物
含有两个典型的 C2H2 锌指结构，转基因研究证实
SCOF-1 基因的过量表达可以增强拟南芥和烟草的耐
冷性。SCOF-1 基因的表达受低温和 ABA 特异性诱导，
而不受盐胁迫诱导。SCOF-1 基因不能直接与冷调节
基因 COR（cold regulated gene）启动子区的 CTR/DRE
顺式作用元件和 ABA 应答元件 ABRE 结合。但是
SCOF-1 可以和另外一个大豆 bZIP 转录因子 SGBF-1
互作，以增强 SGBF-1 与 ABRE 元件的结合能力，从
而促进 COR 基因的表达，提高了植株的耐冷性。Sun
和 Wang 等 [19, 20] 分别在水稻和烟草中发现了一个抗
盐胁迫的 C2H2 型锌指蛋白基因，该转录因子在盐胁
迫条件下，脯氨酸和可溶性糖含量水平都有所提高。
同时还发现盐胁迫下 OsDREB2A，OsP5CS OsProT，
以及 OsLea3 等基因的表达水平提高。
4 结论
在低温（1℃）和 ABA（200 μmol/L）条件下，
转基因拟南芥的脯氨酸和可溶性糖含量水平高于野
生型植株，而可溶性糖和脯氨酸在体内的累积能提
高植株对胁迫环境的抗性 ；另外，反映细胞膜损伤
情况的丙二醛水平低于野生型植株，与所测细胞膜
的损伤率相吻合，说明转基因植株对低温等胁迫的
抗性要优于野生型植株。在低温和 ABA 刺激下，转
基因植株中 GmC2H2 基因的表达水平提高。
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（责任编辑 李楠）