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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
抗除草剂基因及抗生素基因等作为转基因中常
用的选择标记不仅一直存在争议［1］，而且还因会毒
害植物本身，限制了转基因产品的推广应用［2］，所
以研究者一直在寻找一种安全可靠且便于检测的转
基因标记基因。花青素作为一种对人体有益的天然
收稿日期 ：2013-10-11
基金项目 ： 国家转基因生物新品种培育重大专项（2013ZX08003-001），国家自然科学基金项目（31240081），山西省科技攻关项目
（20110311009），山西省财政支农项目（2011NYGX-05）
作者简介 ：赵欣梅，女，硕士研究生，研究方向 ：作物遗传育种 ；E-mail ：zxm880329@126.com
通讯作者 ： 孙毅，男，博士，研究方向 ：植物基因工程和分子生物学研究 ；E-mail ：sunyi692003@163.com
花青素合成调控转录基因作为直观标记的载体构建及其
在玉米幼胚中的瞬时表达
赵欣梅1，2  吴树彪2  王亦学2  崔贵梅2  王晓清2  杜建中2   
王小丽1，2  尚勇进2  孙毅1，2，3
（1. 山西大学生物工程学院，太原 030006 ；2. 山西省农业科学院生物技术研究中心，太原 030031 ；3. 农业部黄土高原作物基因资源与种质
创制重点实验室，太原 030031）
摘 要 ： 采用花青素调控因子 C1/Bperu 分别与玉米胚特异性启动子 Glb1 和组成型启动子 CaMV35S 构建成植物转化载体
pGlb1CB 和 p35SCB，并利用基因枪转化方法，将重组表达载体转入玉米幼胚。显微观察结果证实，这两个载体均能在玉米幼胚细
胞中瞬时表达。用花青素作为标记基因不仅可以在一定程度上减少公众对转基因生物安全性方面的担忧，而且可以帮助直观地从
转化当代和后代种子中通过颜色标记筛选到转化籽粒，从而可以大大简化筛选程序，提高效率，节约检测成本。
关键词 ： 花青素 直观标记 载体构建 瞬时表达 玉米幼胚
The Vector Construction of Anthocyanins as a Visual Marker Gene and
Its Transient Expression in Maize Immature Embryos
Zhao Xinmei1，2 Wu Shubiao2 Wang Yixue2 Cui Guimei2 Wang Xiaoqing2 Du Jianzhong2
Wang Xiaoli1，2 Shang Yongjin2 Sun Yi1，2，3
（1. Biological Engineering Institute，Shanxi University，Taiyuan 030006 ；2. Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of Agricultural
Sciences，Taiyuan 030031 ；3. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，
Ministry of Agriculture，Taiyuan 030031）
Abstract:  Anthocyanin regulatory factor C1/Bperu genes are constructed respectively with a maize embryo specific promoter GLB1 and a
constitutive promoter CaMV35S into plant transformation vectors pGlb1CB and p35SCB, and the recombinant expression vectors were introduced
into maize embryos by particle bombardment. Microscopic observation confirmed that the two vectors were actively expressed in maize immature
embryo cells. The use of anthocyanins as a marker gene not only could reduce the safety concerns from the public over GMO substantially, but
could also be used as a visual indicator for the selection of transgenic plants, which could greatly simplify the screening procedures, improve the
efficiency and reduce the costs.
Key words:  Anthocyanins Visual marker Vector construction Transient expression Maize immature embryo
植物色素，用其做选择标记基因既可避免人们对转
基因食品安全性的担忧，又可进行直观选择以简化
选择程序。近年来的研究表明，花青素可以抗氧化，
清除体内自由基，所以其对糖尿病、心血管疾病、
癌症及与衰老有关的退化性疾病有预防和抵抗作
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期78
用［3］，故从转基因植物营养角度和安全性的方面来
考虑，用花青素作为标记对人和动物是有益无害的。
因其在植物中的广泛存在，对自然环境也是安全的。
近年来关于花青素的研究主要集中在其生物合
成途径，代谢调控及生物学功能方面。近年来花青
素用于转基因中标记基因的研究也有少数报道，在
单子叶植物中，Doshi 等［4，5］构建了花青素调控因
子 Bperu、C1 与胚特异启动子 Ltp1 的载体 pLtp1CB
并通过基因枪法转入了小麦和小黑麦（小麦与黑麦
的杂交麦）中，获得了紫色胚的小麦和小黑麦转
化种子。Zale 等［6］用 Floral Dip 方法将花青素调控
基因 Lc 和 C1 作为转化标记，在小麦上做了转化试
验，Shen 等［7］通过农杆菌介导法将花青素调控因
子 Bperu、C1 与玉米胚特异启动子 globulin 构建的
载体导入玉米，获得了紫色胚的玉米转化种子，宫
硖等［8］用花青素代谢调控基因 Bi 和 C1 作为报告基
因，以 epsp 作为筛选标记基因，构建了植物表达载
体 pBAC9009，用基因枪法获得了紫色玉米植株。在
双子叶中， Kortstee 等［9］用花青素作标记进行了苹
果，草莓和马铃薯的转基因试验。
组成型启动子的活性高，在植物体的各组织
中均有不同程度和持续的表达［8］。组织或器官特
异型启动子专一性较强，使得外源基因在特定条件
下或植株某个组织中表达，可以增强外源基因的表
达效果，并能减少植株负担，对作物的农艺性状影
响也不明显［10］。Glb1 是一种控制玉米球蛋白合成
的胚特异性表达的组织特异性启动子，它的表达受
ABA 调节，在玉米胚部表达量高［11-13］。本研究拟
在 Doshi 提供的载体上进行改造，用玉米球蛋白胚
特异性启动子 Glb1 代替原有大麦脂质转移蛋白胚特
异性启动子 Ltp1，构建适合于转化玉米植株的载体
pGlb1CB。此外，还利用 CaMV35S 代替 Ltp1 构建载
体 p35SCB，以期得到具有自主知识产权的转化载体，
为植物基因转化研究奠定基础，并可为其他的转基
因研究作参考。
1 材料与方法
1.1 材料
玉米自交系郑 -58 由山西省强盛种业公司提供 ；
载 体 pLtp1CB 由 Doshi 教 授（Agriculture and Agri-
Food Canada，Lethbridge Research Centre，Canada）提
供（图 1），载体 pGlb1G 由 Scott 教授（Interdepartmental
Genetics，Iowa State University，Iowa，USA） 提 供，
载体 p35SBt 由本实验室保存 ；pEasy-T 载体、DH5α
大 肠 杆 菌、Taq DNA 聚 合 酶 购 自 Transgene 公 司 ；
T4 DNA 连接酶购自 Thermo 公司 ；DNA 胶回收试剂
盒、Sanprep 柱式质粒小量抽提试剂盒购自上海生工，
PCR 引物由上海生工合成 ；DNA 序列由 Invitrogen
公司测定 ；普通生化试剂购自艾德莱等公司。基因
枪型号为 PDS-1000/He（Bio-Rad）。
Right Border
Ltp1
promoter C1 gene Nos Nos
Ltp1
promoter Bperu gene
BamH I Age I EcoR I Xba I Spe I EcoR I Sph I
图 1 载体 pLtp1CB 结构示意图
1.2 方法
1.2.1 启动子功能验证 载体 pGlb1G 和 pLtp1CB 的
基因枪瞬时表达检测 对载体 pGlb1G 的启动子 Glb1
测序并比对发现在 470 bp 处缺失了一个碱基 T，为
了证明缺失碱基是否会影响启动子功能，对该载体
进行基因枪瞬时表达检测。同时对载体 pLtp1CB 也
进行了验证。取授粉后 20 d 左右的玉米优良自交系
郑 -58 果穗，经 20% 的次氯酸钠表面消毒 20 min 后
挑取其幼胚接种到 MS 培养基上过夜培养，然后将
其转移到高渗 MS 培养基上暗培养 4 h 后用基因枪轰
击。纯化好的 pGlb1G 和 pLtp1CB 载体调整浓度为 3
μg/μL，制备基因枪微弹，并以不含任何质粒其余均
相同的微弹处理作为空白对照，轰击幼胚。
1.2.2 Glb1 和 CaMV35S 基因启动子的克隆 根据
GenBank 中玉米球蛋白基因 Glb1 的序列（EF0649-
79）设计合成两对引物，在第一对引物的上游引物 5
端加入 BamH I 酶切位点，下游引物 5 端加入 Age I
酶切位点（下划线部分）：Glb1/fw1 ：5-GGATCCTA-
2014年第4期 79赵欣梅等 ：花青素合成调控转录基因作为直观标记的载体构建及其在玉米幼胚中的瞬时表达
TTAGTCGTTAGCTTCTTTAAT-3，Glb1/rv1 ：5-ACC-
GGTGGGTTGGC-TGTATGCAGAACTAA-3 ；在 第 二
对引物的上游引物 5 端加入 Xba I 的酶切位点，下
游引物 5 端加入 Spe1 的酶切位点（下划线部分）：
Glb2/fw2 ：5-TCTAGATATTAGTCGTTAGCTTCTTTA-
AT-3，Glb2/rv2 ：5-ACTAGTGGGTTGGCTGTATGC-
AGAACTAA-3。采用碱裂解法提取质粒 pGlb1G，以
该质粒为模板 PCR 扩增 Glb1 序列，琼脂糖凝胶电
泳，割胶回收并纯化后连接到 pEasy-T 载体上。获
得重组质粒进行筛选并测序，利用 NCBI 对测序
结果进行同源性比对。同理克隆 CaMV35S 基因的
启 动 子 序 列， 合 成 的 两 对 引 物 分 别 为 35S1/fw1 ：
5-GGATCCCTCGAGAGAGATAGATTTGTAGAG-3，
35S1/rv1 ：5-ACCGGTGAATCGGCCAACGCGCGGGG-
AGAG-3 ；35S2/fw2 ：5-TCTAGACTCGAGAGAGAT
AGATTTGTAGAG-3，35S2/rv2 ：5-ACTAGTGAATC-
GGCCA ACGCGCGGGGAGAG-3。
1.2.3 直观表达载体的构建 ①用 BamH I 和 Age I
双酶切质粒 pLtp1CB 和 pEasy-T-Glb1，酶切结果得
到 Glb1 片段和含有 Bperu/C1 的载体大片段，用 T4
连 接 酶 进 行 连 接， 得 到 Glb1 和 Bperu/C1、Ltp1 基
因融合的载体 pGlb1Ltp1CB（表 1）。接着采用热激
法将该载体转入 DH5α 大肠杆菌中，用 Glb1/fw1 和
Glb1/rv1 进行菌落 PCR，提取质粒并酶切验证和测
序以验证连入片段的序列是否正确。至此，在原始
的载体 pLtp1CB 上，有一个 Ltp1 启动子被置换成了
Glb1。②用 Xba I 和 Spe I 双酶切质粒 pGlb1Ltp1CB
和 pEasy-T-Glb2， 将 酶 切 pEasy-T-Glb2 得 到 的
Glb2 的片段和酶切质粒 pGlb1Ltp1CB 得到的含有
Bperu/C1 基因的大片段，用 T4 连接酶进行连接，得
到 Glb1 和 Bperu/C1 基因融合的载体。同样采用热激
法将该载体转入 DH5α 大肠杆菌中，用引物 Glb2F
和 BperuR（5-CCACGGAGTGGAGATCTTA-3）菌落
PCR 检测，将条带大小正确的菌斑摇菌提取质粒
Left Border Right Border
Glb1
promoter C1 gene Nos Nos
Glb1
promoter Bperu gene
BamH I AgeI EcoR I Xba I Spe I EcoR I SphI
A
Right Border
CaMV35S
promoter C1 gene Nos Nos
CaMV35S
promoter Bperu gene
BamH I Age I EcoR I Xba I Spe I EcoR I Sph I
B
图 2 植物转化载体 pGlb1CB 结构（A）及 p35SCB 结构（B）示意图
酶切并测序验证。从而构建成了胚特异表达的载体
pGlb1CB（图 2-A）。③同上述①和②中采用的方法，
构建组成型表达载体 p35SCB（图 2-B）。
表 1 本研究中用到的质粒及其基因组成
质粒 质粒基因组成
pGlb1G Glb1∶GFP∶nos
p35SBt 35S∶Bt∶nos
pLtp1CB Ltp1∶C1∶nos∶Ltp1∶Bperu∶nos
pGlb1CB Glb1∶C1∶nos∶Glb1∶Bperu∶nos
p35SCB 35S∶C1∶nos∶35S∶Bperu∶nos
pGlb1Ltp1CB Glb1∶C1∶nos∶Ltp1∶Bperu∶nos
1.2.4 表达载体的基因枪瞬时表达 同 1.2.3 中所述
的方法，将纯化好的质粒 pGlb1CB、p35SCB、pLtp-
1CB 和 Puc18 浓度调整为 3 μg/μL，用作制备基因枪
微弹，轰击幼胚并观察，其中 pGlb1CB 和 p35SCB
为待检测载体，pLtp1CB 为阳性对照，pUC18 空载
体为阴性对照，并设立了不含任何质粒其余均相同
的微弹作为空白对照。
2 结果
2.1 启动子功能验证
用载体 pGlb1G 和 pLtp1CB 制作的微弹轰击玉
米幼胚，接受轰击的玉米幼胚在暗室 25℃过夜培养，
然后转移到 MS 培养基上，继续在 25℃光照下培养
24 h 后观察结果。通过荧光显微镜观察，用 pGlb1G
制作的微弹轰击的玉米幼胚，在玉米幼胚中弹的部
位呈现绿色荧光（图 3-A），在正常显微镜下观察发
现以 pLtp1CB 制作微弹轰击的玉米幼胚，在玉米幼
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期80
胚中弹的部位呈现紫红色（图 3-B），而空白对照既
不呈现绿色荧光也未表现紫色（图 3-C）。试验表明
载体 pGlb1G 和 pLtp1CB 均能正常表达，可以进行下
一步构建。
在 NCBI 上对测序结果进行比对发现，Glb1 和 Glb2
的片段在 470 bp 处缺失了一个碱基 T，而 35S1 和
35S2 在 85 bp 处多了碱基 G，在 462 bp 和 463 bp 处
缺失了碱基 A 和 T。因此，需进行启动子功能验证，
结果证明缺失或增加的碱基不在启动子的关键部位，
不影响目的基因的正常表达，可以进行下一步构建。
2.3 表达载体pGlb1CB和p35SCB的构建
经双酶切重组质粒 pEasy-T-Glb1，双酶切质粒
pLtp1CB 得到的含有 Bperu/C1 基因的大片段，经连
接、转化和酶切验证，构建得到中间载体 pGlb1Ltp-
1CB ；再双酶切质粒 pEasy-T-Glb2，与双酶切质粒
pGlb1Ltp1CB 得 到 的 含 有 Bperu/C1 基 因 的 大 片 段，
经连接、转化和酶切验证，构建得到表达载体 pGlb-
1CB。同理，获得了另一个表达载体 p35SCB（图 6）。
A B
C D
A ：载体 pGlb1G 基因枪瞬时表达 ；B ：载体 pGlb1G 的空白对照 ；C ：载体
pLtp1CB 基因枪瞬时表达 ；D ：载体 pLtp1CB 的空白对照
图 3 载体 pGlb1G 及载体 pLtp1CB 基因枪瞬时表达
490
bp
M 1 2 3 4 5
M ：2000 bp DNA Marker ；1 ：阴性对照 ；2，3 ：Glb1 ；4，5 ：Glb2
图 4 Glb1 及 Glb2 PCR 扩增片段
845
bp
M 1 2 3 4 5
M ：2000 bp DNA Marker ；1 ：阴性对照 ；2，3 ：35S1 ；4，5 ：35S2
图 5 35S1 及 35S2 PCR 扩增片段
960
845
490
bp
M M M1 2 3 4 5 6
M ：2000 bp DNA Marker ；1 ：载体 pLtp1CB BamH Ⅰ和 Age Ⅰ双酶切（960
bp）；2 ：载体 pLtp1CB Spe Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切（960 bp）；3 ：载体 pGlb1CB
BamH Ⅰ和 Age Ⅰ双酶切（490 bp）；4 ：载体 pGlb1CB Spe Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切
（490 bp）；5 ：载 体 p35SCB BamH Ⅰ 和 Age Ⅰ 双 酶 切（845 bp）；6 ：载 体
p35SCB Spe Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切（845 bp）
图 6 重组质粒双酶切验证图
2.4 表达载体的基因枪转化瞬时表达
瞬时表达系统可以短暂而高水平地表达目的
基 因。 将 pGlb1CB 载 体（ 图 7-A） 和 p35SCB 载
体（图 7-B）转入玉米幼胚的瞬时表达试验表明，
2.2 Glb1和CaMV35S基因启动子的克隆
分别对质粒 pGlb1G 和 p35SBt 进行 PCR 扩增，
得到两个同样 490 bp 大小的片段 Glb1、Glb2（图
4）和两个同样 845 bp 大小的片段 35S1、35S2（图
5）。将扩增片段分别连接到 pEasy-T 载体上，并用
热激法转入大肠杆菌中。对获得菌落进行 PCR 检测，
从 PCR 检测结果阳性的菌落中提取质粒，并进行双
酶切鉴定。各选 10 个酶切大小正确的菌落测序并
2014年第4期 81赵欣梅等 ：花青素合成调控转录基因作为直观标记的载体构建及其在玉米幼胚中的瞬时表达
在 48 h 后 该 载 体 能 够 正 常 表 达， 使 部 分 玉 米 幼
胚着弹部位细胞变成紫色。阳性对照也表达紫色
（图 7-C），阴性对照（图 7-D）和空白对照（图 7-E）
不表达紫色。
子特异性启动子的表达强度有时也会发生改变，如
棉花的 α- 球蛋白启动子在转基因拟南芥和烟草中驱
动 GUS 的表达活性只是在棉花中表达量的 16.7% 和
1%［16］，说明在转基因研究中，利用植物本身的种
子特异性启动子比较好。因而本试验用了 Glb1 代替
Ltp1，为下一步转化玉米做准备。
载体 pGlb1CB 可以使转基因玉米的当代和后代
胚表现紫色而不影响植株的其它性状，适合作标记
基因。载体 p35SCB 以组成型强启动子 CaMV35S 启
动花青素表达，可以大大提高植物本身及果实中花
青素的含量，改良植物品质；提高人和动物的摄入量，
或者将玉米秸秆做成饲料喂养动物，对动物也存在
诸多益处。因而，研究者可以根据试验需要及不同
的研究目的选择合适的载体。
将以上载体 pGlb1CB 和 p35SCB 用于植物转基
因研究，在转化植株的当代和后代中可以通过肉眼
直接观察到籽粒颜色变化的转化籽粒，从而大大提
高检测效率，节省检测成本。这类标记的广泛使用
将对植物转基因研究具有重要意义。
4 结论
本研究分别将玉米胚特异性启动子 Glb1 和组成
型启动子 CaMV35S 与花青素调控因子 C1/Bperu 构
建成了植物转化载体 pGlb1CB 和 p35SCB，在玉米幼
胚中的基因枪瞬时表达检测结果显示，玉米幼胚中
弹部位细胞产生紫色，说明载体 pGlb1CB 和 p35SCB
均能在植物细胞中正常表达。
致谢
感谢 F. Eudes教授（Agriculture and Agri-Food
Canada, Lethbridge Research Centre, Canada）提供 pLt-
p1CB载体和 M. P. Scott教授（Interdepartmental Gen-
etics，Iowa State University，Iowa，USA）提供 pGlb1G
载体。感谢山西省农业科学院旱作农业研究中心张
明义研究员和张艳琴副研究员为我们的瞬时表达实
验提供技术支持。
参 考 文 献
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A B
C
E
D
A ：pGlb1CB 载 体 瞬 时 表 达 ；B ：p35SCB 载 体 瞬 时 表 达 ；C ：阳 性 对 照
pLtp1CB 载体瞬时表达 ；D ：阴性对照 ；E ：空白对照
图 7 表达载体的基因枪转化瞬时表达
3 讨论
试验结果显示，Glb1、Glb2 扩增片段在 470 bp
处缺失了一个碱基 T 后，仍可以调控花青素的表达，
表明缺失碱基未影响启动子的功能。同理，CaMV-
35S 碱基序列缺失或增加均未影响启动子功能。个
别碱基缺失后该启动子功能验证的观察还未见报道，
本研究的验证说明构建的启动子具有正常的胚特异
性表达功能。然而，该启动子其它位点个别碱基的
缺失对其功能影响的程度还有待进一步研究。
不同植物的种子特异性启动子存在种间表达特
异性及稳定性的问题［14］，如蚕豆 USP 基因启动子
可以驱动报告基因在转基因拟南芥种子中特异性表
达，但在转基因豌豆中，该启动子会驱动报告基因
在花药、花粉和种皮中都表达［15］；外源启动子在种
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期82
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（责任编辑 马鑫）