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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(2):143-147
胸腺肽 THY 超家族（Thymosin superfamily）蛋
白属于保守的假想蛋白，迄今为止已经在果蝇（Dr-
osophila melanogaster）、 埃 及 伊 蚊（Aedes aegypti）、
家蚕（Bombyx mori）等昆虫物种中发现含 THY 保守
结构域的序列［1-3］。THY 蛋白保守区序列与 β 族胸
腺素（β-Thymosin，Tβ）有较高的同源性，Tβ 是一
种多功能分子，在促进创伤愈合、组织再生、抗细
胞凋亡和抗炎症等方面起到重要作用［4］。Tβ 含有一
个 WH2 结构域，为一个 actin 单体结合位点，含有
WH2 结构域的蛋白广泛存在于各物种中，属于肌动
蛋白结合蛋白，在肌动蛋白动力学中发挥多样调节
作用［5，6］。在与肌动蛋白结合过程中，Tβ 会改变构象，
有利于识别分子靶标，可与免疫和细胞生长的级联
信号间相互传递信息［7，8］。通过调节肌动蛋白的动
收稿日期 ： 2014-07-01
基金项目 ：国家科技支撑计划（2011BAC06B12），国家自然科学基金项目（81360254）
作者简介 ：王宇，男，博士研究生，研究方向 ：昆虫分子生物学 ；E-mail ：wangzhongyuwy@163.com
通讯作者 ：吴建伟，男，博士，研究方向 ：昆虫免疫学及生物活性物质利用 ；E-mail ：wjw@gmc.edu.cn
家蝇 Thymosin（THY）基因的克隆及原核表达
王宇1、2  吴高吉1  罗曼1  彭传林1  修江帆1  尚小丽1  吴建伟1
（1. 贵阳医学院基础医学院，贵阳 550004 ；2. 贵州省疾病预防控制中心，贵阳 550004）
摘 要： 采用 EST 测序技术从构建的家蝇（Musca domestica）幼虫 cDNA 质粒文库中筛选到胸腺肽（Thymosin，THY）基因，
以该基因的 cDNA 文库质粒为模板，设计引物，通过 PCR 扩增，测序鉴定，获得 THY 基因完整编码序列。运用生物信息学方法对
该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建 pET-28a（+）-THY 重组质粒，转化到大
肠杆菌 BL21（DE3）中进行诱导表达。研究结果表明，THY 基因 ORF 全长 384 bp，编码 127 个氨基酸，理论分子量 14.3 kD，等
电点为 5.22，具有 THY 家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒 pET-28a（+）-THY，经 IPTG 诱导，蛋白在大肠杆菌中获得表达，
经亲和层析柱纯化获得目的蛋白，Western blot 检测发现纯化的目的蛋白大小正确。
关键词 ： 家蝇 ；胸腺肽 ；克隆 ；原核表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.021
Cloning and Prokaryotic Expression of Musca domestica
Thymosin Gene
Wang Yu1，2 Wu Gaoji1 Luo Man1 Peng Chuanlin1 Xiu Jiangfan1 Shang Xiaoli1 Wu Jianwei1
（1. Basic Medical College，Guiyang Medical College，Guiyang 550004 ；2. Guizhou Provincial Center for Disease Control Prevention，
Guiyang 550004）
Abstract ： In order to clone and analyze the prokaryotic expression of thymosin gene from Musca domestica, the thymosin gene which was
isolated from Musca domestica cDNA library, was analyzed by the bioinformatics methods in the following aspects, including general physical and
chemical properties, signal peptide and subcellular localization. The expression construct pET-28a（+）-THY was preformed. The open reading
frame of the thymosin gene was 384 bp that encoded a putative protein with 127 amino acids. The protein with predicted molecular weight 14.3
kD and pI of 5.22, has the conserved thymosin domain that belongs to thymosin family. The result showed that the recombinant prokaryotic
expression vector pET-28a （+）-THY was successfully constructed and fusion protein was expressed in E. coli. SDS-PAGE and Western blot
analysis indicated that the fusion protein that purified using Ni2+ affinity chromatography had the predicted size.
Key words ： Musca domestica ；thymosin ；cloning ；prokaryotic expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2144
力学结构使得肌动蛋白骨架处在不断重塑的过程中，
进而在细胞运动能力、成纤维细胞迁移、内吞作用
中发挥重要作用［9］。对家蚕 THY 的研究中发现其通
过结合肌动蛋白在参与调节家蚕形态学结构的改变
和生理功能的形成过程中起到重要的作用［1］。
家蝇呈世界性分布，是重要的媒介昆虫，对环
境适应能力强，有强大的先天性免疫系统及生长代
谢调节功能。目前关于家蝇生长代谢发育调节基因
的研究鲜有报道，同时未见家蝇 THY 基因的研究。
本研究通过构建 pET-28a（+）-THY 原核表达载体，
并对其原核表达产物进行纯化获得 THY 蛋白质，旨
在为进一步研究家蝇 THY 蛋白的生物学功能奠定基
础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试虫、载体和菌株 家蝇 3 龄幼虫由贵阳医
学院病原生物学实验室饲养，饲养温度 28℃，相对
湿度 65%，光照周期 10L∶14D。pET-28a（+）质粒，
大肠杆菌 BL21（DE3）由贵阳医学院病原生物学实
验室常规保存。
1.1.2 试剂 总 RNA 提取试剂盒（RNAiso PLUS）、
逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNA标志物（DL2000
DNA Marker）、琼脂糖等购置于 TaKaRa 公司 ；蛋白
Marker 购 自 Fermentas 公 司 ；Ni-NTA Agarose 购 自
Merk 公司 ；一抗兔抗 His-Tag 单克隆抗体、二抗辣
根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgA 抗体、DAB 显色试
剂盒购自中杉金桥公司，其余所用的化学试剂（无
水乙醇、三氯甲烷、异丙醇等）均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 THY 基因的生物信息学分析 通过 NCBI 网
站（http ：//www.ncbi.blastX）获取家蝇（Musca dom-
estica XP_005179401.1）；果蝇（Drosophila melanoga-
ster NP_525065.1）；埃及伊蚊（Aedes aegypti XP_00-
1663844.1）；家蚕（Bombyx mori NP_001103818.1）；
地中海实蝇（Ceratitis capitata XP_004527242.1）的
THY 同源蛋白序列进行序列比对，分析该基因蛋白
的氨基酸序列与其他蛋白质氨基酸序列的相似性，
判断其是否为全长基因等 ；用 DNAclub 软件分析
cDNA 序列和开放阅读框 ；运用 Signal P 分析信号肽
序列 ；运用 PHD 的在线分析工具分析蛋白保守结构
域 ；利用蛋白分析专家系统（Expert protein analysis
system，ExPASy）的在线分析软件 Protparam，分析
预测蛋白质的氨基酸残基性质、分子量及理论等电
点等［10］。
1.2.2 总 RNA 提取及 cDNA 合成 总 RNA 的抽提
按照 TaKaRa 公司的 RNAiso PLUS 说明书进行操作。
总 RNA 经电泳检测，GeneQuant 公司核酸定量分析
仪测定 A260/A280 比值及浓度，选取 A260/A280 比值范
围为 1.8-2.0 的样本，以 1 μg 总 RNA 为模板，按照
cDNA 合成试剂盒说明书合成 cDNA。
1.2.3 引物的设计合成、基因扩增 根据 GenBank
登录号：用 Premier 5.0 设计引物，设计引物 THY-F：5-
CGCGAATTCATGGCTGCACCTGCTCTT-3，带 EcoR I
酶切位点 ；THY -R ：5-CGCCTCGAGTTAACCTCTC-
TTTTCTTCCTCG-3，带 Xho Ⅰ酶切位点。以 cDNA
为模板，应用上述设计的特异引物扩增目的基因，
PCR 产物行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定回收、测序
鉴定。
1.2.4 重组原核表达质粒的构建及鉴定 将 PCR 产
物胶回收后和原核表达质粒 pET-28a（＋）用 EcoR I
和 Xho Ⅰ进行双酶切后回收，连接、转化大肠埃希
菌 BL21/DE3 感受态细胞，卡那霉素筛选阳性单克隆，
提取的重组质粒进行双酶切、PCR 扩增和 DNA 测序
鉴定后进行原核表达。
1.2.5 重组蛋白的诱导表达、纯化及 Western blot 鉴
定 挑取含有 pET-28a（+）-THY 重组质粒的 E.coli
BL21/ DE3 的单菌落接种于含卡那霉素的 LB 液体培
养基中（空质粒 pET-28a（+） 的 BL21/DE3 作为阴
性对照），放入 37℃摇床，摇至 OD600 约为 0.6 时，
取 1 mL 作为诱导前样品，加入 IPTG 至终浓度为 1
mmol/L，5 h 后所有样品离心后收集菌体处理后离心
取上清行 SDS-PAGE 电泳分析。依据上述诱导表达
方法对阳性克隆进行大量的诱导表达，离心收集菌
体，冰上超声裂解后离心收集上清并过滤，参照 Ni-
IDA Agarose 说明书进行蛋白纯化，收集蛋白洗脱液，
SDS-PAGE 电泳分析目的蛋白，将洗脱的蛋白经超
滤管（分子截留为 10 kD）离心浓缩目的蛋白，超滤
后的蛋白 -80℃保存备用。通过 Western blot 检验重
组目的蛋白，用 5% 脱脂奶粉 4℃过夜封闭 ；TBST
2015,31(2) 145王宇等：家蝇Thymosin（THY）基因的克隆及原核表达
冲洗，加入 1∶500 稀释的抗 His 标签的抗体（一抗），
室温孵育 2 h ；TBST 冲洗后加入 1∶2 000 稀释的辣
根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG 抗体（二抗），室温
孵育 1 h［11］。采用 DAB 显色试剂盒显色。
2 结果
2.1 家蝇THY基因的生物信息学分析
通过生物信息学分析，该 cDNA 序列 ORF 长
为 384 bp，编码 127 个氨基酸（图 1）。其含有一个
能够识别结合位点的保守短基序 LKHTET，该基序
在哺乳动物及家蚕 THY 的研究中证实与肌动蛋白结
合关系较密切。预测家蝇 THY 蛋白的理论分子量
为 14.3 kD，等电点为 5.22，属于酸性蛋白质。多重
序列比对结果分析显示，家蝇 THY 与其他物种来源
的 THY 氨基酸序列同源性较高（与果蝇为 82%，埃
及伊蚊为 70%，家蚕为 74%，地中海实蝇为 84%），
均具有 3 个保守的 Thymosin 超家族结构域（图 2）。
在哺乳细胞体内表达的半衰期为 30 h，在酵母和大
肠杆菌中体内表达的半衰期分别大于 20 h 和 10 h。
在溶液中的不稳定指数为 46.63，预测在溶液中性
质不稳定。脂肪族指数 71.57，总亲水性平均系数
GRAVY -0.993，蛋白质总体疏水性系数低。信号肽
1
61
121
181
241
301
361
图 1 THY 基因开放阅读框 cDNA 序列及对应编码的氨基酸序列
预测结果显示无信号肽。
2.2 原核重组质粒的鉴定
将重组质粒进行 PCR 和双酶切鉴定，产物行
1.5% 琼脂糖凝胶电泳。结果（图 3）显示约 380 bp
处有一清晰的条带，与目的基因的大小基本相符，
测序证明重组质粒构建成功。
2.3 蛋白表达、纯化及鉴定
将构建好的重组质粒转化到 BL21/DE3 中表达，
15% SDS-PAGE 电泳分析结果（图 4 第 4、5 泳道）
所示，大约在 18 kD（与 His 标签约 4 kD 融合后）
Thymosin domain I
Thymosin domain III
Musca domestica THY 1
Aedes aegypti THY 1
Bombyx mori THY 1
Ceratitis capitata THY 1
Drosophila melanogaster THY 1
Musca domestica THY 81
Aedes aegypti THY 84
Bombyx mori THY 86
Ceratitis capitata THY 81
Drosophila melanogaster THY 83
Thymosin domain II
双箭头线条表示 Thymosin 结构域 ；虚线方框内为保守基序 LKHTET
图 2 不同物种来源的 THY 氨基酸序列比对分析
左右处出现表达条带，将蛋白纯化后超滤浓缩，结
果如第 7 泳道所示，证明目的蛋白纯化成功。对诱
导表达后纯化的融合蛋白做 Western blot 验证，用
DAB 法在 PVDF 膜上显色，结果显示目的条带单一
且清晰，说明目的蛋白表达正确。蛋白浓度测定为
0.35 mg/mL。
3 讨论
昆虫 THY 是一个多功能分子，具有创伤修复、、
组织再生，通过结合肌动蛋白调节昆虫的生理功能
及形态结构，其序列具有高度保守性。对家蚕 THY
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2146
的研究发现其具有结合肌动蛋白进而影响家蚕生长
发育的功能，同时其在体内的调节作用较强，是机
体能够维持内稳态的关键因子［1］。
本 研 究 从 家 蝇 幼 虫 cDNA 文 库［12］ 中 筛 选 到
THY 基因序列，全长 384 bp，编码 127 个氨基酸，
理论分子量为 14.3 kD，等电点为 5.22，属于酸性蛋
白质。通过结构域预测显示家蝇 THY 蛋白中含有 3
个 Thymosin 的功能域，属于 THY 超家族。为进一
步了解该蛋白的特性，将目的基因克隆入 pET-28a
（+）载体，构建 pET-28a（+）-THY 重组表达质粒，
将重组质粒转化到 BL21 感受态细胞中，用 IPTG 诱
导表达得到相对分子质量约为 18 kD 的重组胸腺肽，
并通过 Western blot 验证显示纯化后的蛋白与目的蛋
白大小一致。
Tβ 中与肌动蛋白结合关系极为密切的六肽基序
LKKTET 在整个家族蛋白中很保守，这段序列扮演
着识别结合位点的重要角色［13-16］。在家蝇 THY 和
其他物种的 THY 蛋白结构域中也发现这样的保守的
序列（图 2 已标注出六肽基序所在区，在昆虫中多
为 LKHTET），推测在家蝇体内该基序也具有结合肌
动蛋白的功能，通过阻断该位点与肌动蛋白的结合
有可能控制家蝇生长发育，从而为家蝇的防治提供
新靶点。与 THY 高度同源的 Tβ 功能研究中也是围
绕其与肌动蛋白的关系展开的，研究显示 Tβ 与免疫
调节，肿瘤发生，细胞迁移，血管生存，创伤愈合
等有密切关系的生物学活性［17］，这些研究结果为下
一步家蝇 THY 的功能研究提供理论基础。
4 结论
本研究克隆了家蝇 THY 基因，全长 384 bp，编
码 127 个氨基酸，成功构建 pET-28a（+）-THY 重
组质粒并在大肠杆菌中进行表达，亲和层析法纯化
了目的蛋白 THY，继而用 Western blot 验证获得的
目的蛋白。
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bp
1 2M
2000
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：PCR 产物 ；2 ：重组质粒（pET-28a（+）-THY）
用 EcoR Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切
图 3 重组质粒的 PCR 及双酶切鉴定
kD
1M 2 3 4 5 6 7 8
97.2
66.4
44.3
29.0
17.1
10.3
M ：蛋白 marker ；1 ：质粒空载未诱导 ；2 ：质粒空载诱导 ；3 ：重组质粒未
诱导 ；4 ：重组质粒诱导 ；5 ：重组质粒诱导后上清 ；6 ：重组质粒诱导后沉淀 ；
7 ：纯化浓缩后 THY 蛋白 ；8 ：Western blot 检测纯化后蛋白
图 4 THY 重组蛋白的诱导表达
2015,31(2) 147王宇等：家蝇Thymosin（THY）基因的克隆及原核表达
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（责任编辑 李楠）