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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
利用秸秆等纤维素类生物质生产清洁能源及化
工原料，可有效地缓解环境污染与能源危机的双重
压力［1］。利用微生物产生的纤维素酶来转化纤维素
成可发酵利用的还原糖，是纤维素资源化的有效途
径。现有的纤维素酶大多来源于真菌和放线菌，这
类菌繁殖周期长，且多产酸性纤维素酶［2］。
细菌产生的纤维素酶一般为中性或者碱性酶，
因为其对天然纤维素的水解能力较弱，因此对其重
视不够。近年来，随着中性和碱性纤维素酶在洗涤、
收稿日期 ：2014-05-21
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31200068）
作者简介 ：贾博涵，男，研究方向 ：环境微生物工程 ；E-mail ：jiabohanscu@163.com
通讯作者 ：苟敏，女，博士，硕士生导师，研究方向 ：有机废弃物资源化 ；E-mail ：gouminscu@163.com
一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及酶学特性研究
贾博涵  周伟  赵罗迪  杨埔  苟敏
（四川大学建筑与环境学院，成都 610065）
摘 要 ： 从采集的含腐烂树叶的土壤中，筛选到 1 株产纤维素酶能力较高的菌株 JJ-3，经 16S rRNA 基因序列分析，鉴定该
菌株为产酸克雷伯氏杆菌（Klebsiella oxytoca）。产酶条件及酶学特性研究表明 ：以滤纸为碳源、蛋白胨为氮源、初始 pH 为 8.0 的
培养基中发酵 3 d 更利于纤维素酶的合成；菌株发酵液在中性和碱性条件下均有较高的滤纸酶活力，分别可达 118.7 U/mL（pH7.0），
167.8 U/mL（pH8.0）和 120 U/mL（pH9.0）；所产纤维素酶的最适酶反应 pH 为 7.0，最适酶反应温度为 40℃，对温度比较敏感，在
pH7.0-8.0 的范围内具有较好的稳定性，能满足中性和碱性纤维素酶的要求。
关键词 ： 纤维素酶 产酸克雷伯氏杆菌 产酶条件 酶学特性
Isolation，Identification and Enzymatic Characterization of a
Cellulase-Producing Bacteria
Jia Bohan Zhou Wei Zhao Luodi Yang Pu Gou Min
（College of Architecture and Environment，Sichuan University，Chengdu 610065）
Abstract: A cellulase-producing bacteria strain JJ-3 with high activity was isolated from the soil containing rotted leaves, which
was identified as Klebsiella oxytoca based on the 16S rRNA sequence analysis. The optimal enzyme-producing conditions of strain JJ-3 was
investigated and was as follows ：filter paper as carbon source, peptone as nitrogen source, pH8.0, three-day fermentation. And the fermentation
culture had higher FPase activity under neutral and alkaline conditions, with 118.7 U/mL（pH7.0）, 167.8 U/mL（pH8.0）, 120 U/mL（pH9.0）.
The results of enzymatic characterization showed that the optimal pH and temperature for enzyme reaction was 7.0 and 40℃, respectively. FPase
was sensitive to temperature, while it kept good stability during the pH7.0 to 8.0. This study suggested that the cellulase from strain JJ-3 meets
the request of neutral and alkaline cellulase.
Key words: Cellulase Klebsiella oxytoca Enzyme-producing conditions Enzymatic characterization
造纸、纺织和废水处理等行业的成功应用，细菌纤
维素酶已显示出良好的经济价值［3］。然而，现有细
菌纤维素酶的研究和应用还处于起步阶段，需求量
较大，而且其水解活力较低，反应成本高，难以实
现工业化［4］。因此，筛选优良的产纤维素酶的细菌
资源对实现纤维素资源化具有重要意义。本研究从
采集的含腐烂树叶的土壤中筛选产纤维素酶能力高
的菌株，旨在为获得中性和碱性纤维素酶的菌株提
供参考。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期188
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 菌株分离自四川大学江安校区内
几处腐烂树叶下的表层土壤。
1.1.2 培养基 富集培养基：玉米秸秆 1 g，滤纸 1 g，
报纸 0.5 g，（NH4）2SO4 0.2 g，酵母粉 0.05 g，NaCl
0.5 g，KH2PO4 0.4 g，CaCl2·6H2O 0.45 g，MgSO4·
7H2O 0.03 g，蒸馏水 100 mL，pH 调至 8.0，灭菌。
初筛培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）0.2 g，
（NH4）2SO4 0.2 g，酵母粉 0.05 g，NaCl 0.5 g，KH2PO4
0.4 g，CaCl2·6H2O 0.45 g、MgSO4·7H2O 0.03 g，琼
脂 2 g，蒸馏水 100 mL，pH 调至 8.0，灭菌。
发 酵 产 酶 培 养 基 ：CMC-Na 0.2 g，（NH4）2SO4
0.2 g， 酵 母 粉 0.05 g，NaCl 0.5 g，KH2PO4 0.4 g，
CaCl2·6H2O 0.45 g、MgSO4·7H2O 0.03 g，Tween-80
0.02 g，蒸馏水 100 mL，pH 调至 8.0，灭菌。
1.2 方法
1.2.1 纤维素酶产生菌的分离鉴定
1.2.1.1 纤维素酶产生菌的富集 配制 0.9%（W/V）
的 NaCl 溶液 100 mL，将采集的土壤样品混合均匀
后悬浮于 NaCl 溶液中，并于 30℃、150 r/min 条件
下振荡 2 h。取 10 mL 静置后的上清液接种至 100
mL 富集培养基中培养 3 d（30℃，150 r/min），再取
10 mL 培养液接种到新鲜培养基中继续培养，重复
多次富集。
1.2.1.2 纤维素酶产生菌的筛选 用水解圈初筛，
发酵复筛相结合的方法进行纤维素酶产生菌的筛选。
将富集培养液涂布到初筛培养基平板上进行菌种分
离，并采用刚果红染色法进行初筛，挑选能够产生
较大透明圈的菌株。将初筛菌株接种到发酵产酶培
养基中，测定滤纸酶活性，取酶活最大的菌株（命
名为 JJ-3）进一步研究。
1.2.1.3 菌株鉴定及 16S rRNA 基因序列分析 菌株
JJ-3 的种属鉴定由上海生工完成，并将菌株的 16S
rRNA 基因序列提交到 GenBank 数据库。利用软件
Clustal X1.8 进行多序列比对后［5］，采用软件 MEGA-
3.1 构建菌株 JJ-3 的系统发育树，构树方法为邻连法
（Neighbor-Joining），bootstrap 检测 1 000 次［6］。
1.2.2 菌株 JJ-3 产酶条件的优化
1.2.2.1 碳源对菌株产酶能力的影响 以 1%（W/V）
的 CMC-Na、滤纸、微晶纤维素、玉米秸秆和葡萄
糖为唯一碳源的发酵产酶培养基中，分别接种菌株
JJ-3，发酵培养 3 d，测定滤纸酶活性。
1.2.2.2 氮源对菌株产酶能力的影响 以 1%（W/V）
的滤纸为唯一碳源，在液体发酵培养基中分别加入
0.25%（W/V）的不同氮源（硝酸钾、酵母粉、蛋白胨、
尿素和硫酸铵），接种菌株 JJ-3 发酵培养 3 d，测定
滤纸酶活性。
1.2.2.3 培养基 pH 对菌株产酶能力的影响 以滤纸
和蛋白胨为唯一碳氮源，调节发酵培养基的初始 pH
为 5.0-9.0，分别接种菌株 JJ-3 发酵培养 3 d，测定
滤纸酶活性。
1.2.2.4 发酵时间对菌株产酶能力的影响 以滤纸
和蛋白胨为唯一碳氮源，调节发酵培养基的初始 pH
为 8.0，接种菌株 JJ-3 分别发酵培养 1-5 d，测定滤
纸酶活性。
1.2.3 菌株 JJ-3 的滤纸酶酶学特性
1.2.3.1 温度对酶活的影响及酶的热稳定性 将测
定滤纸酶酶活的水浴反应温度分别设定为 30℃-
70℃，其它条件同 1.2.4 的方法测定酶活，以最高值
为 100%，获得滤纸纤维素酶在不同 pH 条件下的相
对酶活力。将粗酶液分别置于上述温度中处理 1 h 后，
测定剩余酶活力，以未处理的粗酶液作为对照，评
价纤维素酶的热稳定性。
1.2.3.2 pH 对酶活的影响及酶的 pH 稳定性 利用
磷酸缓冲液把滤纸酶酶活测定中底物溶液的 pH 调
节为 4.0-9.0，其它条件同 1.2.4 的方法测定酶活，
以最高值为 100%，获得滤纸纤维素酶在不同温度下
的相对酶活力。将粗酶液分别置于 pH 为 4.0-9.0 的
磷酸缓冲溶液中处理 1 h 后，加入滤纸测定剩余酶
活力，以未处理的粗酶液作为对照，评价纤维素酶
的 pH 稳定性。
1.2.4 纤维素酶活力的测定 菌株 JJ-3 以 8% 的接
种量接种到发酵产酶培养基中，于 30℃、150 r/min
培养 3 d，取发酵液于 4 000 r/min 离心 20 min，取
上清（粗酶液）测定纤维素酶活性。通常采用滤纸
纤维素酶（FPase）来衡量纤维素菌酶系的综合降
解能力［7］。以滤纸为底物，应用二硝基水杨酸法在
540 nm 处测定吸光度值，每组做 3 个平行样，计算
2014年第11期 189贾博涵等：一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及酶学特性研究
FPase 活力［7］。在上述条件下，每分钟由底物生成
1 μmol 还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位，用
U/mL 表示。
2 结果
2.1 纤维素酶产生菌的分离与鉴定
采用水解圈初筛，发酵复筛的方法从土壤中分
离到 6 株产纤维素酶的菌株，其中菌株 JJ-3 合成纤
维素酶的能力最高（平板培养 3 d 后，菌落直径为 0.6
cm，透明圈直径 1.3 cm，复筛时酶活为 38.5 U/mL），
作为后续研究的对象。
在固体培养基上，菌株 JJ-3 的菌落呈圆形，表
面光滑，隆起，边缘整齐，半透明，灰白色。经鉴
定，该菌株的 16S rRNA 基因序列与产酸克雷伯氏杆
菌（Klebsiella oxytoca）具有 99% 的序列相似性。将
该序列登录 GenBank，获得序列号为 KJ801560，菌
株 JJ-3 的系统发育位置见图 1。
Escherichia coliHG9416665995100939695 7789833673
0.005
Klebsiella trevisaniiAF129444Klebsiella pneumoniaeAB641122Klebsiella ozaenaeAB682259Klebsiella milletisAY217656Klebsiella granulomatisEU333881Klebsiella singaporensisAF250285Klebsiella variicolaHG933294Klebsiella rhinoscleromatisNR_037084Klebsiella oxytocaJJ-3KJ801560Klebsiella oxytocaKF054939Klebsiella terrigenaAF129442Klebsiella ornithinolyticaAF129441
Klebsiella planticolaAF181574
图 1 菌株 Klebsiella oxytoca JJ-3 的系统发育树
2.2 菌株JJ-3发酵条件的优化
2.2.1 碳源对菌株产酶能力的影响 在液体产酶培
养基中，分别以 1% 的 CMC-Na、滤纸、微晶纤维
素、玉米秸秆和葡萄糖为唯一碳源，对菌株 JJ-3 进
行发酵培养。图 2-A 显示，上述底物存在时，菌株
JJ-3 都具有纤维素酶活，以滤纸为唯一碳源时 FPase
活性最高（59.8 U/mL），其次为葡萄糖、玉米秸秆、
微晶纤维素和 CMC-Na。
2.2.2 氮源对菌株产酶能力的影响 考察了不同氮
源（硝酸钾、酵母粉、蛋白胨、尿素和硫酸铵）对
菌株 JJ-3 产纤维素酶的影响。图 2-B 显示，以蛋白
胨为氮源可获得最大的 FPase 活性（182.8 U/mL），
其次是酵母粉 ；以硝酸钾和硫酸铵为氮源时，FPase
活性分别只有以蛋白胨为氮源时的 17% 和 24.8% ；
尿素存在时几乎没有 FPase 活性。
2.2.3 培养基 pH 对菌株产酶能力的影响 菌株 JJ-3
在不同 pH 值（5.0-9.0）的液体发酵培养基中培养，
3 d 后测定各自的纤维素酶活力。图 2-C 表明，菌株
JJ-3 在 pH 值为 5.0-9.0 的培养基中生长时，均具有
一定的 FPase 酶活性，中性和弱碱性条件更有利于
获得高活性的 FPase，pH 值为 8.0 时纤维素酶活性最
高（167.8 U/mL），其次是 pH 值为 9.0 时的 120 U/mL
和 pH 值为 7.0 时的 118.7 U/mL。
2.2.4 发酵时间对菌株产酶能力的影响 菌株 JJ-3
在以滤纸为碳源、蛋白胨为氮源、pH 值为 8.0 的液
体发酵培养基中培养不同的天数，确定最佳的发酵
时间。图 2-D 显示，培养时间对 FPase 活性影响较
大，发酵 3 d 和 4 d 时具有最大的 FPase 活性（约
104 U/mL），继续发酵则活性迅速降低，因此确定 3
d 是最佳的发酵时间。
2.3 菌株JJ-3的滤纸酶酶学特性
2.3.1 温度对酶活的影响及酶的热稳定性 温度对
FPase 酶反应的影响（图 3）显示，FPase 在 30℃-
50℃范围内具有一定活性，40℃为其最适酶反应温
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期190
度 ；温度升高到 50℃时，剩余酶活仅为 33.1% ；温
度继续升高，FPase 活性被完全抑制。粗酶液在不
同温度保温 1 h 后 FPase 活性均有不同程度的下降，
其热稳定性与温度对酶反应的影响具有相同的趋势
（图 3），表明菌株 JJ-3 的纤维素酶对温度比较敏感。
2.3.2 pH 对酶活的影响及酶的 pH 稳定性 pH 对
FPase 酶反应的影响（图 4）显示，FPase 在 pH 值
为 5.0-8.0 的范围内具有一定活性，pH 值为 7.0 时
酶活性最高，当 pH 为 9.0 时酶活性被完全抑制，表
明菌株 JJ-3 的纤维素酶在中性环境能更好地降解纤
维素。此外，菌株 JJ-3 的纤维素酶对酸有一定的耐
受能力。用不同的 pH 缓冲液处理粗酶 1 h 后，在
pH 值为 7.0-8.0 的范围内仍有 50%-53% 的纤维素
酶活，表现出较好的稳定性，而当 pH>8.0 时 FPase
活性完全丧失（图 4）。
3 讨论
从自然界筛选高效的纤维素酶生产菌是实现纤
维素资源化的前提和基础。刚果红平板法是最常用
的识别产纤维素酶菌株的方法，具有直观、快捷的
优势。一般认为，纤维素酶活性与刚果红染色的透
明水解圈大小（或者水解圈与菌落的直径比值 Hc）
呈正比，且水解圈出现越早，产酶越快。但也有研
39
59.8
40
46.2
49.1
0
10
20
30
40
50
60
70
CMC-Na └㓨 ᗞᲦ㓔㔤㍐ 〨⿶ 㪑㨴㌆└㓨䞦⍫U/mLA
0
30
60
90
120
150
180
74.5
88.8
118.7
167.8
120
5 6 7 8 9
└㓨䞦⍫U/mL ษޫสpHC 8.8 54.2 104.71 104 76.4020406080100120 1 2 3 4 5└㓨䞦⍫U/mL ᰦ䰤(d)D
31.2
71.4
3.5
182.8
45.5
0
40
80
120
160
200 ⺍䞨䫮 䞥⇽㊹ ቯ㍐ 㳻ⲭ㜘 ⺛䞨䬥└㓨䞦⍫U/mLB
A ：碳源 ；B ：氮源 ；C ：培养基 pH ；D ：发酵时间
图 2 菌株 JJ-3 的发酵条件优化
0
20
40
60
80
100
120
20 30 40 50 60 70 80
FPase⍫ᙗ
FPaseっᇊᙗ⴨ሩ䞦⍫% ⑙ᓖć
图 3 温度对酶活的影响及酶的热稳定性
2014年第11期 191贾博涵等：一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及酶学特性研究
究表明 ：不同菌株的最佳产酶条件存在差异，即使
同一菌株在液体培养和固体培养时也表现出不同的
生理特性，透明圈无法完全代表菌株的产酶能力［8］。
因此，水解圈筛选后的液体发酵或滤纸条崩解等复
筛验证过程必不可少［9］。采用水解圈初筛，发酵复
筛的方法，本研究从校园土壤中获得一株拥有较高
纤维素酶活力的产酸克雷伯氏杆菌。产酸克雷伯氏
杆菌属于革兰氏阴性菌，多数研究认为该菌具有固
氮能力［10］，但对其降解纤维素的探讨仅有零星报道。
如蔡燕飞［11］从环境中分离出一株产酸克雷伯氏杆
菌株，对香蕉杆具有一定的降解效果。Wood 等［12］
发现产酸克雷伯氏杆菌具有较好耐糖能力，因此利
用其分解纤维素产生的葡萄糖来合成重要的化工原
料 2，3-丁二醇。因此，本研究获得的菌株可为纤维
素的利用提供有效的微生物资源。
不同微生物生产纤维素酶的条件不同，因此优
化培养条件是提高纤维素酶产量的最直接有效途径。
据报道，大多数微生物来源的纤维素酶需要底物的
诱导才能产生，而且容易利用碳源的存在（如葡萄
糖等）会抑制纤维素酶的合成［13］。但菌株 JJ-3 以
CMC-Na、滤纸、微晶纤维素、玉米秸秆和葡萄糖为
唯一碳源时，均检测到一定的纤维素酶活性。而且
以葡萄糖为碳源时具有较好的纤维素酶活性（49.1
U/mL），说明葡萄糖对纤维素酶的合成并未表现出
阻遏作用。这些结果推测菌株 JJ-3 的纤维素酶可能
为组成型表达，韩如旸等［14］报道菌株 Clostridium
sp. EVA1 产生的纤维素酶也有类似结果。研究发现
氮源对菌株 JJ-3 产酶能力的影响较大，蛋白胨是最
佳的氮源，尿素几乎完全抑制了纤维素酶的生成，
说明有机氮源比无机氮源更有利于纤维素酶的合成。
也有研究发现纤维素降解菌 Penicillium decumbens
L-06 的 FPase 活性在以蛋白胨为氮源时最高［15］。尿
素为氮源会大大抑制 Aspergillus sp. YN1 中 FPase 的
合成［16］。菌株 JJ-3 在不同 pH 值的发酵培养基中
（5.0-9.0）均可合成纤维素酶，但中性和弱碱性条件
获得的 FPase 活性更高，基本具备作为中性和碱性
纤维素酶的要求。酶学特性显示菌株 JJ-3 合成的纤
维素酶属于中温酶，在中性和弱碱性范围内表现出
较好的稳定性，但对温度非常敏感。因此，后续研
究可通过诱变或基因工程手段，来提高其对环境条
件的耐受能力，以保证其在纤维素资源化中的应用。
4 结论
以秸秆、滤纸和报纸为原料，经水解圈初筛
和发酵复筛，从校园含腐烂树叶的土壤中获得一
株生产纤维素酶的细菌菌株，鉴定其为产酸克雷
伯 氏 杆 菌（Klebsiella oxytoca），GenBank 登 录 号 为
KJ801560。产酶条件优化结果显示 ：菌株 JJ-3 的纤
维素酶可能为组成型表达，无需底物诱导就能产生；
有机氮源和中性或碱性条件更利于纤维素酶的合成；
且最优产酶条件如下 ：碳源为滤纸，氮源为蛋白胨，
培养基初始 pH 为 8.0，发酵 3 d。酶学特性结果显示：
FPase 的最适酶反应温度为 40℃，对温度比较敏感 ；
最适酶反应 pH 为 7.0，在 pH 值为 7.0-8.0 的范围内
仍有 50%-53% 的纤维素酶活，表现出较好的稳定性，
基本满足中性和碱性纤维素酶的要求。
参 考 文 献
［1］王庆昭 , 郑宗宝 , 刘子鹤 , 等 . 生物炼制工业过程及产品［J］.
化学进展 , 2007, 19（7）：1198-1205.
［2］顾方媛 , 陈朝银 , 石家骥 , 等 . 纤维素酶的研究进展与发展趋
势［J］. 微生物学杂志 , 2008, 28（1）：83-87.
［3］刘刚 , 余少文 , 孔舒 , 邢苗 . 碱性纤维素酶及其应用的研究进
展［J］. 生物加工过程 , 2005, 3（2）：9-14.
［4］Himmel ME, Ding SY, Johnson DK, et al. Biomass recalcitrance ：
engineering plants and enzymes for biofuels production［J］.
Science, 2007, 315（5813）：804-807.
［5］Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, et al. The CLUSTAL_
X windows interface ：flexible strategies for multiple sequence
FPase⍫ᙗ
FPaseっᇊᙗ
0
3 4 5 6 7
pH
8 9 10
20
⴨ሩ䞦⍫% 406080100120
图 4 pH 对酶活的影响及酶的 pH 稳定性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期192
alignment aided by quality analysis tools［J］. Nucleic Acids
Research, 1997, 25（24）：4876-4882.
［6］ Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4 ：molecular evolutionary
genetics analysis（MEGA）software version 4.0［J］. Mol Biol
Evol, 2007, 24（8）：1596-1599.
［7］ Li X, Gao P. Isolation and partial properties of cellulose-decomposing
strain of Cytophaga sp. LX-7 from soil［J］. J Applied Microbiol,
1997, 82（1）：73-80.
［8］ 陈燕 , 周孙全 , 郑奇士 , 等 . 常温纤维素降解菌的分离与鉴
定［J］. 上 海 交 通 大 学 学 报 ：医 学 版 , 2010, 30（8）：1018-
1021.
［9］ 廖青 , 江泽普 , 邢颖 , 等 . 发酵床中纤维素降解菌的分离与鉴
定［J］. 生物技术通报 , 2014（3）：106-110.
［10］ 覃丽萍 , 黄思良 , 李杨瑞 . 植物内生固氮菌的研究进展［J］.
中国农学通报 , 2005, 21（2）：150-152.
［11］ 蔡燕飞 , 李华兴 , 彭桂香 , 等 . 纤维素分解菌的筛选及鉴定［J］.
林产化学与工业 , 2005, 25（2）：67-70.
［12］ Wood BE, Yomano LP, York SW, et al. Development of industrial-
medium-required elimination of the 2, 3-butanediol fermentation
pathway to maintain ethanol yield in an ethanologenic strain of
Klebsiella oxytoca［J］. Biotechnol Prog, 2005, 21（5）：1366-
1372.
［13］ 高培基 , 许平 . 环境资源微生物技术［M］. 北京 ：化学工业
出版社 , 2004 ：15-109.
［14］ 韩如旸 , 梅建凤 , 闵航 , 等 . 嗜热厌氧纤维素降解菌对纤维素
的粘附及其酶活性研究［J］. 浙江大学学报 ：农业与生命科
学版 , 2001, 27（2）：165-168.
［15］ 刘韫滔 , 禤淑霞 , 龙传南 , 等 . 纤维素降解菌 L-06 的筛选、鉴
定及其产酶条件的分析［J］. 生物工程学报 , 2008, 24（6）：
1112-1116.
［16］ 赵 方 圆 , 范 宁 杰 , 陈 一 楠 , 等 . 纤 维 素 降 解 菌 Aspergillus
sp.YN1 的产酶条件及酶学特性［J］. 微生物学通报 , 2010, 37
（8）：1194-1199.
（责任编辑 马鑫）