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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
RAPD 是在 PCR 基础上建立起来的一种 DNA
分子水平上的大分子多态性检测技术［1，2］。RAPD
标记具有操作简单、花费低、DNA 用量少且不需同
位素标记等优点，广泛应用于黄瓜［3］、南瓜［4］、西
瓜［5］、甜瓜［6］、苦瓜［7］、瓠瓜［8］和西葫芦［9］等的
遗传多样性研究，以及遗传图谱构建，亲缘关系分
析和品种鉴定等研究中。但是 RAPD 也存在稳定性
差、重复性差的缺点，因此在利用 RAPD 技术时，
需要建立一个稳定的反应体系。目前关于 PCR 体系
优化的报道大多集中在对单个因素的最佳水平进行
摸索，需要多次的梯度试验，过程繁琐且不能兼顾
各因素间的交互作用［10］。利用正交试验法对影响
RAPD 反应体系的主要因素同时进行研究，可较快
建立优化的 RAPD 反应体系［11， 12］。
冬瓜（Ben incasa hispida Cogn.）是我国重要的
瓜类蔬菜，节瓜（Benincasa hispida Cogn. var. chieh-
qua How.）是华南地区的特产蔬菜。虽然冬瓜和
节瓜在我国栽培历史悠久，但其研究工作起步较
晚，目前仅知道节瓜是冬瓜的一个变种。因此有必
要从分子水平上对冬瓜和节瓜种质资源进行系统鉴
定和评价。在利用 RAPD 技术对冬瓜和节瓜进行亲
缘关系鉴定之前，必须建立 RAPD 的技术体系。李
成伟等［13］在节瓜种子纯度鉴定中没有进行体系的
优化。陈清华等［14］运用 RAPD 标记节瓜性型基因
收稿日期 : 2012-02-29
基金项目 : 现代农业产业技术体系建设专项（CARS-25-C-04）
作者简介 : 宋世威 , 男 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 蔬菜生理与分子生物学 ; E-mail: swsong@scau.edu.cn
通讯作者 : 陈日远 , 男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 蔬菜生理与分子生物学 ; E-mail: mrychen@scau.edu.cn
冬瓜和节瓜 DNA提取及 RAPD反应体系优化
宋世威 李珍 刘厚诚 孙光闻 陈日远
（华南农业大学园艺学院，广州 510642）
摘 要： 以 8份冬瓜和节瓜为材料，采用改良 CTAB法提取基因组 DNA，采用正交试验设计，对冬瓜和节瓜 RAPD条件进
行了优化，建立了最佳反应体系：25 μL反应体系中含 1×buffer，模板 DNA、Mg2+、dNTPs、引物和 Taq酶的浓度分别为 20 ng、2.0
mmol/L、0.24 mmol/L、0.3 μmol/L和 1.0 U。PCR扩增程序为：94℃预变性 5 min ；94℃变性 45 s，36.9℃退火 45 s，72℃延伸 1.5
min，共 40个循环；72℃延伸 10 min，12℃保存。
关键词： 冬瓜 节瓜 RAPD 体系优化
DNA Extraction and Optimization of RAPD Reaction in
Wax Gourd and Chieh-qua
Song Shiwei Li Zhen Liu Houcheng Sun Guangwen Chen Riyuan
（College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）
Abstract: DNA of 8 Wax gourd （Ben incasa hispida Cogn.） and Chieh-qua （Benincasa hispida Cogn. var. chieh-qua How.） were
extracted with modified CTAB method. Using the orthogonal experimental design, RAPD conditions of Wax gourd and Chieh-qua were optimized
and the best reaction system was established. 1×buffer solution was in the 25 μL reaction systems, and the concentration of template DNA,
Mg2+, dNTPs, primer and Taq enzyme were 20 ng, 2.0 mmol/L, 0.24 mmol/L, 0.3 μmol/L and 1.0 U, respectively. The optimal PCR amplification
program was as follows ：predenaturation at 94℃ for 5 minutes, denaturation at 94℃ for 45 seconds, annealing at 36.9℃ for 45 seconds,
extension at 72℃ for 1.5 minutes. The cycle repeated 40 times. Extension was at 72℃ for 10 minutes and stored at 12℃.
Key words: Wax gourd Chieh-qua RAPD Reaction system
2012年第8期 155宋世威等 ：冬瓜和节瓜 DNA 提取及 RAPD 反应体系优化
OPQ-451150，仅对退火温度、Mg2+ 浓度和循环数进行
了两个梯度的正交优化，而反应体系中其他成分则
没有优化。本研究旨在优化各种因素，建立稳定的
冬瓜与节瓜 RAPD 扩增体系，为进一步利用该技术
研究其亲缘关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 冬瓜和节瓜材料共 8 份（表 1），
分别从各地农科院和种子市场购得。试验使用的主
要试剂 ：RNase A、λDNA、dNTPs、Taq酶及相配套
的反应缓冲液购自 TaKaRa 公司，RAPD 引物购自上
海生工公司 ；PCR Marker（D2000）购自天根生物工
程公司。
260、280 和 320 nm 的吸收值，计算 OD260/OD280 的
比值，估算 DNA 的纯度。
1.2.3 RAPD 反应体系的优化 将经过准确定量的
DNA 样品用 ddH2O 稀释成 5 ng/μL 的工作液，4℃保
存备用 ；RAPD 引物经过定量后，用 ddH2O 稀释成
5 μmol/L 工作液，-20℃保存备用。
对模板 DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度、Taq酶
5 个因素，每个因素设 4 个水平，设计因素水平表（表
2）和 L16 45 正交试验进行优化（表 3），每个组合两
次重复。退火温度 33℃-42℃，设 12 个梯度，即 ：
33.0℃、33.2℃、33.8℃、34.5℃、35.5℃、36.9℃、
38.4℃、39.6℃、40.6℃、41.3℃、41.8℃和 42℃，
每个梯度两次重复。
表 1 供试材料及来源
编号 品种名称 来源 编号 品种名称 来源
1 丰青 1 号冬瓜 安徽 5 广东黑皮冬瓜（888） 广东
2 兴蔬黑冠冬瓜 湖南 6 碧玉出口节瓜 广东
3 青皮实心冬瓜 湖南 7 夏冠 1 号节瓜 广东
4 兴蔬白星冬瓜 湖南 8 旺优七星节瓜 广东
1.1.2 主要仪器 PCR 仪（Thermocycler biometra，
德国），凝胶成像系统（Bio-Rad，Gel Doc2000，美
国），核酸蛋白测定仪（Epperdorf Biophotometer，德
国），电泳仪（JM-250，大连捷迈科贸有限公司以及
Bio-RAD，PAC300，美国），电泳槽（Bio-Rad，sub-
cell model 192）。
1.2 方法
1.2.1 冬瓜和节瓜基因组 DNA 提取 清晨从田间材
料中采摘植株嫩叶放入采样袋中，清洗干净后吸干
叶面水分，-20℃保存备用。叶片 DNA 提取采用改
良 CTAB 法［15］。
1.2.2 DNA 检测 电泳检测 ：取 DNA 样品原液 1
μL，以 λDNA/Hind Ⅲ为标准，制备 0.8% 的琼脂糖
凝胶，在 0.5×TBE 缓冲液中（电压 5 V/cm）稳压
电泳 1 h，于凝胶成像系统下观察记录，估算被测
DNA 的浓度，了解 DNA 的质量。
核酸蛋白仪检测 ：取 DNA 样品原液 1 μL 并稀
释至 100 μL，用 TE 缓冲液或 ddH2O 作为空白对照，
校正零点，于核酸蛋白分析仪上检测 DNA 在 230、
表 2 影响因素及梯度设定
因素 Mg
2+
（mmol/L）
dNTPs
（mmol/L）
Taq酶
（U）
引物
（μmol/L）
DNA
（ng）
1 1.5 0.12 0.75 0.1 15
2 2.0 0.16 1.0 0.2 20
3 2.5 0.20 1.25 0.3 25
4 3.0 0.24 1.5 0.4 30
表 3 RAPD优化体系正交设计表
组合 Mg
2+
（mmol/L）
dNTPs
（mmol/L）
Taq酶
（U）
引物
（μmol/L）
DNA
（ng）
1 1.5 0.12 0.75 0.1 15
2 1.5 0.16 1.0 0.2 20
3 1.5 0.20 1.25 0.3 25
4 1.5 0.24 1.5 0.4 30
5 2.0 0.12 1.25 0.4 30
6 2.0 0.16 1.5 0.3 25
7 2.0 0.20 0.75 0.2 20
8 2.0 0.24 1.0 0.1 15
9 2.5 0.12 1.5 0.2 20
10 2.5 0.16 1.25 0.1 15
11 2.5 0.20 1.0 0.4 30
12 2.5 0.24 0.75 0.3 25
13 3.0 0.12 1.0 0.3 25
14 3.0 0.16 0.75 0.4 30
15 3.0 0.20 1.5 0.1 15
16 3.0 0.24 1.25 0.2 20
2 结果
2.1 冬瓜和节瓜基因组DNA提取
OD260/OD280 一般用来衡量 DNA 纯度，其比值
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期156
为 1.8-1.9 时表明 DNA 纯度最好。本研究采用改进
的 CTAB 方法提取冬瓜和节瓜基因组 DNA，测得
OD260/OD280 值在 1.82-1.97 之间，表明所提取的 DNA
纯度较高，RNA 基本去除完全，没有蛋白和多酚等
污染。凝胶电泳结果（图 1）表明，冬瓜和节瓜基
因组 DNA 纯度较高，带型整齐一致。
2.2 RAPD反应体系的优化
由图 2 可以看出，第 8 个组合扩增出的条带清
晰，多态性较好，主带明显，重复性好，确定第 8
94℃ 45 s，36.9℃ 45 s，72℃ 90 s，共 40 个循环 ；
72℃延伸 10 min，12℃保存。产物用 1.5% 琼脂糖凝
胶电泳，电泳缓冲液为 0.5×TBE，电压为 5 V/cm，
电泳 1.5 h 后在 Bio-Rad 凝胶分析系统上拍照分析。
3 讨论
植物 DNA 的提取是进行分子生物学研究的基
础。由于冬瓜和节瓜叶片含有较多的多糖和酚类物
1-4. 分别为 λDNA 50 ng、100 ng、150 ng 及 200 ng ；5-11. 稀释后 DNA 样品
图 1　DNA样品检测
个组合为冬瓜和节瓜基因组 DNA 的 RAPD-PCR 最
佳反应体系，即 25 μL 反应体系中含 1×buffer，模
板 DNA 20 ng，Mg2+ 浓度 2.0 mmol/L，dNTPs 浓度 0.24
mmol/L，引物浓度 0.3 μmol/L，Taq酶 1.0 U。
2.3 退火温度的优化
由图 3 可以看出，随退火温度的提高（33℃-
36.9℃），扩增出的条带增加，温度太高条带趋于弥
散，主带不清晰，所以最终确定的最佳退火温度为
36.9℃，条带多，主带明显、清晰。
2.4 体系验证
对以上试验得到的最优体系和最佳退火温度分
别采用不同的模板和引物进行验证（图 4，图 5）均
可以得到清晰稳定的条带，表明建立的优化体系用
于冬瓜和节瓜 RAPD 分析比较理想。
由以上分析确定扩增程序 ：94℃预变性 5 min ；
图 2 正交优化图片
引物 AS13，模板为 8 号材料，1-16. 依次为正交设计的组合顺序 ；M. DNA Marker
图 3 退火温度优化图片
引物为 M06，模板为 8 号材料，1-12. 退火温度依次为 33.0℃、33.2℃、33.8℃、34.5℃、35.5℃、36.9℃、38.4℃、39.6℃、40.6℃、41.3℃、41.8℃及 42℃
质，在提取其 DNA 时必须要去除这两种干扰 PCR
效果的物质，以获得高质量的 DNA。本研究采取改
良 CTAB 法提取冬瓜和节瓜基因组 DNA，采样时间
选在清晨日出之前，此时植株叶片糖类较少。另外，
瓜类材料在保存过程中容易褐化，因此建议采样后
立即提取 DNA。异丙醇和乙醇两次沉淀后采用低转
速短时间离心（8 000 r/min，离心 2 min），避免了
2012年第8期 157宋世威等 ：冬瓜和节瓜 DNA 提取及 RAPD 反应体系优化
其他大分子物质和 DNA 一同沉淀，这一点与谢大森
等［16］提取冬瓜高质量 DNA 的 CTAB-Free 法类似。
本试验中改良的 CTAB 法提取的冬瓜和节瓜的 DNA
纯度较高，带型整齐一致，符合 RAPD 分析的要求。
本研究采用正交优化，对影响 RAPD 反应条件
的主要因素进行筛选，可较快地找到最优的水平组
合，同时进行两次重复，可以兼顾试验结果的稳定
性并减少加样过程的误差。本课题组应用本研究的
优化方法，对 41 份冬瓜和节瓜种质资源进行了遗传
多样性分析，获得了理想的结果［17］，证明了该方法
的可靠性。
4 结论
试验结果表明，适合冬瓜和节瓜 RAPD 反应的
体系为 ：25 μL 反应体系中含 1×buffer，模板 DNA、
Mg2+、dNTPs、引物和 Taq酶的浓度分别为 20 ng、
2.0 mmol/L、0.24 mmol/L、0.3 μmol/L 和 1.0 U。PCR
扩增程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 45 s，
36.9℃退火 45 s，72℃延伸 1.5 min，共 40 个循环 ；
72℃延伸 10 min，12℃保存。
参 考 文 献
［1］ Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphisms
amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic
Acids Research, 1990, 18（22）：6531-6535.
［2］ Welsh J, Mcclelland M. Fingerprinting genomes using PCR with ar-
bitrary prime. Nucleic Acids Research, 1990, 18（24）：7213-7218.
［3］ 李锡香 , 朱德蔚 , 杜永臣 , 等 . 黄瓜种质资源遗传多样性的 RA-
PD 鉴定与分类研究植物遗传资源学报 , 2004, 5（2）：147-152.
［4］ 李俊丽 , 向长萍 , 张宏荣 , 等 . 南瓜种质资源遗传多样性的
RAPD 分析 . 园艺学报 , 2005, 32（5）：834-839.
引物为 AY16，模板为 1-7 号材料（具体见表 1） 引物为 N10、N13、N14、N15、N16，模板为 4、8 号材料（具体见表 1）
图 4　同一引物不同模板扩增图片 图 5　不同引物两个模板扩增图片
［5］ Zhang XP, Rhodes BB. RAPD molecular marker in watermelon.
Cucurbit Genetics Cooperative, 1994, 17 ：116-119.
［6］ 智海英 , 马海龙 , 岳青 . 薄皮甜瓜种质资源遗传多样性的 RAPD
分析 . 中国农学通报 , 2011, 27（19）：228-233.
［7］ 张长远 , 孙妮 , 胡开林 . 苦瓜品种亲缘关系的 RAPD 分析 . 分
子植物育种 , 2005, 3（4）：515-519．
［8］ 高山 , 许端祥 , 林碧英 , 等 . 瓠瓜种质资源遗传多样性的 RAPD
分析 . 分子植物育种 , 2007, 5（4）：502-506.
［9］ 陈凤真 , 何启伟 .西葫芦种质资源遗传多样性的RAPD分析 .中
国蔬菜 , 2010（16）：26-31.
［10］ 孙敏 , 乔爱民 , 王和勇 , 等 . 黄瓜 DNA 提取及其 RAPD-PCR
反应体系的优化 . 种子 , 2004, 3（6）：9-14.
［11］ 张彦萍 , 刘海河 . 西瓜 RAPD-PCR 的正交优化研究 . 河北农业
大学学报 , 2005, 28（4）：51-53.
［12］ 许端祥 , 高山 , 林碧英 , 等 . 瓠瓜 RAPD-PCR 反应体系的优
化 . 上海农业学报 , 2009, 25（1）：121-123.
［13］ 李成伟 , 李卓杰 , 陈润政 . RAPD 方法在节瓜种子纯度鉴定中
的应用初探 . 种子 , 1999（3）：13-14.
［14］ 陈清华 , 谢大森 , 何晓明 , 等 .节瓜性型基因的RAPD标记 .广
东农业科学 , 2003（5）：19-21.
［15］ Aljanabi SM, Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high
quality genomic DNA for PCR-based techniques. Uncleic Acids
Research, 1997, 25（22）：4692-4693.
［16］ 谢大森 , 何晓明 , 彭庆务 , 等 . 冬瓜 DNA 提取方法的研究 . 中
国蔬菜 , 2010（2）：38-41.
［17］ 宋世威 , 李珍 , 刘厚诚 , 等 . 冬瓜和节瓜种质资源遗传多样性
的 RAPD 分析 . 中国蔬菜 , 2010（22）：47-53.
（责任编辑 马鑫）