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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
黑曲霉作为一种重要的产纤维素酶菌种，广泛
应用于发酵工业。相对于常用的绿色木霉和里氏木
霉等菌株，黑曲霉具有安全无毒素，胞外分泌纤维
素酶便于提纯，β-葡萄糖苷酶糖化能力较强等优点，
成为产酶菌种的重要研究对象［1-3］。目前，国内外
学者对于黑曲霉的研究多集中在培育条件的优化、
分离提纯、固定化以及基因遗传操作等方面，但在
产出酶的相互作用关系和酶解机制方面研究进展缓
慢，成为制约纤维素酶菌种应用的瓶颈［4-6］。纤维
素酶是一组起协同作用的复合酶系，菌种来源不同，
所产生的纤维素酶系组分亦不相同，而即使同一来
源的纤维素酶组分也会随菌株生长培养条件的不同
收稿日期 ： 2013-11-03
基金项目 ：国家“863”课题（2013AA050701）
作者简介 ：张欢，女，助理研究员，研究方向 ：木质纤维素燃料乙醇技术 ；E-mail ：zhanghuan032987@163.com
通讯作者 ：寇巍，E-mail ：kouwei6@126.com
黑曲霉（AS0006）产纤维素酶的纯化研究
张欢1  曹焱鑫1  蒋林2  王晓明1  刘齐1  董晓莹1  寇巍1
（1. 辽宁省能源研究所，营口 115003 ；2. 营口市疾病预防控制中心，营口 115003）
摘 要 ： 利用实验室中黑曲霉菌株 AS0006 进行粗酶发酵，对产出的纤维素酶液进行不同饱和度（NH4）2SO4 的分级沉淀，
经过 Sephadex G-25、Sephadex G-100 分离纯化后，得到两种内切酶（EG）组分、一种外切酶（CBH）组分。通过酶活性及电泳检
测发现，两种 EG 酶组分的相对分子质量分别为 29.63 kD、37.49 kD，CBH 酶组分相对分子质量为 56.51 kD。相较原始粗酶液，EG
回收率可达 18.07%、纯化倍数为 3.46，CBH 回收率可达 12.96%、纯化倍数为 4.14，β-葡萄糖苷酶（CB）回收率可达 22.37%、纯
化倍数为 3.58。
关键词 ： 黑曲霉 纤维素酶 分离纯化
Study on Purification of Cellulase from Aspergillus niger AS0006
Zhang Huan1 Cao Yanxin1 Jiang Lin2 Wang Xiaoming1 Liu Qi1 Dong Xiaoying1 Kou Wei1
（1. Liaoning Institute of Energy Resources，Yingkou 115003 ；2. Yingkou Center for Disease Control and Prevention，Yingkou 115003）
Abstract:  Two endoglucanases（EG）components and a cellobiohydrolase（CBH）from Aspergillus niger AS0006 were separated
and purified by（NH4）2SO4 fractional precipitation, Sephadex G-25 and Sephadex G-100 chromatography. According to cellulase activity and
electrophoresis detection found that the molecular weight of two EG components were 29.63 kD and 37.49 kD, respectively, the molecular weight
of CBH component was 56.51 kD. Compared to the crude enzyme, the recovery rate of EG components could reach 18.07%, the purification
fold was 3.46, the recovery rate of CBH component could reach 12.96%, the purification fold was 4.14, the recovery rate of β-glucosidase（CB）
could reach 22.37% and the purification fold was 3.58.
Key words:  Aspergillus niger Cellulase Purification
而有所差异，对单一的酶组分的纯化研究可实现对
其性质及其它酶组分之间相互作用关系的了解，分
析纤维素酶的酶解机制，从而为获得针对秸秆等不
同纤维原料复合酶制剂提供理论依据，因此在纤维
素酶的分离纯化技术和研究方法上取得突破至关重
要［7-9］。针对上述问题，本试验选用课题组自行筛
选出的一株产纤维素酶的黑曲霉菌株 AS0006，并
对其所产酶系进行分离纯化。纯化过程采用不同饱
和 度（NH4）2SO4 分 级 沉 淀、Sephadex G-25 除 盐、
Sephadex G-100 分离提纯、SDS-PAGE 电泳检测。并
详细计算了各酶组分比活力、纯化倍数及回收率等
重要参数。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期188
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 黑曲霉菌株 AS0006 筛选自黑龙江省
伊春金山屯林区土壤，因筛选出的 6 株产纤维素酶
菌株中，其各协同酶组分活力及滤纸酶活力均达到
最大（内切葡聚糖酶活力为 60.88 U/mL，外切葡聚
糖酶活力为 14.94 U/mL，β-葡萄糖苷酶活力为 65.08
U/mL，滤纸酶活力为 76.72 U/mL），故选用黑曲霉
AS0006 所产的纤维素酶作为分离纯化的研究对象。
1.1.2 培养基 利用 Design-Expert 正交设计软件得
到黑曲霉 AS0006 优化培养基为稻草粉 9.47 g/L，麸
皮 49.33 g/L，（NH4）2SO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，
KH2PO4 0.5 g/L， 蒸 馏 水 3 L，pH6.0。121℃ 灭 菌
20 min。
1.1.3 试验仪器 CXG-A 电脑恒温层析柜（上海
精科公司）；HL-2 恒流泵，HD-2000 紫 外 检 测 仪，
BSZ-100 自动部分收集器，HD-A 电脑层析采集仪（上
海嘉鹏公司）；DZF-6020 浓缩真空干燥箱（上海博
迅公司）；DYY-10C 电泳系统（北京六一仪器厂）。
1.2 方法
1.2.1 纤维素酶活力的测定 纤维素各协同酶组分
活力测定参照 Horikoshi 方法［10］，酶活力单位定义
参照行业标准 QB2583-2003。蛋白质含量测定按考
马斯亮蓝（Bradford）染色法［11］，以 A595 牛血清白
蛋白为标准。
1.2.2 （NH4）2SO4 盐析分级沉淀 将经离心抽滤后
得到的酶清液依次用 30%、60%、70%、90% 饱和
度的（NH4）2SO4 进行分级沉淀，8 000 r/min、4℃
离心 20 min，收集蛋白沉淀，分别溶于量柠檬酸 -磷
酸（pH 5.0）缓冲液中，4℃保存备用。
1.2.3 Sephadex G-25 凝 胶 过 滤 除 盐 本 试 验 采 用
Sephadex G-25 凝胶过滤技术对（NH4）2SO4 分级沉
淀后所得的各蛋白酶液除盐，5 mL 蛋白上样量至 1.0
cm×20 cm 层析柱中，以 pH 5.0 的柠檬酸 -磷酸缓冲
液平衡并洗脱，洗脱速度 1 mL/min，收集对应各峰
的蛋白酶液进行酶活性及蛋白含量的测定。
1.2.4 酶液的浓缩 将酶液至于 30℃条件下，0.08
MPa 恒压真空干燥。干燥后的酶蛋白用柠檬酸 -磷酸
（pH5.0）缓冲液定溶至 5 mL，4℃保存备用。
1.2.5 Sephadex G-100 分 子 筛 凝 胶 过 滤 层 析 将
去盐浓缩后的 5 mL 蛋白清液上样于经柠檬酸 -磷
酸（pH5.0） 平 衡 好 的 Sephadex G-100 凝 胶 层 析 柱
（1.6 cm×80 cm），以平衡缓冲液洗脱，洗脱速度 0.5
mL/min，收集所有出峰酶液，对其进行酶活性及蛋
白含量的测定。
1.2.6 SDS-PAGE 蛋 白 电 泳 采 用 SDS-PAGE 不 连
续垂直凝胶电泳，电极液采用 Tris-甘氨酸缓冲体系，
分离胶缓冲液 pH8.8，浓度为 10%，浓缩胶缓冲液
pH6.8，浓度为 5%，70 V 恒压电泳 2.5 h［12］。
2 结果
2.1 Sephadex G-25凝胶过滤脱盐效果分析
图 1- 图 3 分别为 3 种不同饱和度（60%、70%、
90%）（NH4）2SO4 沉 淀 出 的 蛋 白 经 过 Sephadex
G-25 凝胶过滤后的层析谱图，其中 30% 饱和度析出
的为杂蛋白，故忽略不计。经分析得知各图中对应
的第 1 个峰均为蛋白活性峰，第 2 个是无机盐和小
分子蛋白峰。这是因为在分子筛层析脱盐的过程中
0.1
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图 1 60%（NH4）2SO4 沉淀蛋白脱盐层析图
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图 2 70%（NH4）2SO4 沉淀蛋白脱盐层析图
2014年第6期 189张欢等 ：黑曲霉（AS0006）产纤维素酶的纯化研究
蛋白质相对分子量和盐的相对分子量差异巨大，蛋
白酶液中小分子盐会随着溶剂进入凝胶颗粒的网孔
中，使其保留时间变长、迁移速率变慢。而相对分
子量较大的蛋白质却不能随着溶剂进入到凝胶网孔
中，因此可以先于小分子盐从层析柱中流出，从而
实现除盐效果。经过研究分析后，将各图中对应第
一个峰中的蛋白清液分别收集起来，进行酶活力及
蛋白含量测定试验。
2.2 脱盐酶液酶活性检测分析
图 4 中每组柱形图分别表示经过不同饱和度
（60%、70%、 90%）（NH4）2SO4 分 级 沉 淀 除 盐 后，
蛋白酶液中各协同酶组分活力参数的比较。在每组
饱和度情形下，柱形图从左至右的顺序依次为内切
葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）和 β-葡萄
糖苷酶（CB）活力。
（NH4）2SO4 沉淀脱盐酶液中，虽然含有的 CB 要高
于 70% 饱和度的脱盐酶液，但其不存在 CBH，且
EG 活力要低于 70% 饱和度的脱盐酶液，所以综
合考虑到各单一酶活力及协同效应。本试验选取
经 70% 饱和度（NH4）2SO4 沉淀后的脱盐蛋白酶液
作为进一步分离纯化的研究对象。测试分析后，经
70% 饱和度（NH4）2SO4 沉淀除盐后的蛋白酶液中
EG 酶活力可达 180.21 U/mL，CBH 酶活力可达 41.53
U/mL，CB 酶 活 力 为 217.35 U/mL， 蛋 白 质 含 量 为
596.75 μg/mL。
2.3 Sephadex G-100层析
将 脱 盐 浓 缩 后 的 5 mL 蛋 白 酶 液 用 Sephadex
G-100 葡聚糖凝胶分离提纯，层析结果如图 5 所示。
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图 3 90%（NH4）2SO4 沉淀蛋白脱盐层析图
0
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100
150
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300
60 70 90
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1 
EG
CBH
CB
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图 4 不同饱和度（NH4）2SO4 沉淀脱盐后酶活力测定
由 图 4 可 知， 经 过 60% 饱 和 度（NH4）2SO4
沉 淀 脱 盐 后 的 蛋 白 酶 液 中 CBH 和 CB 酶 活 力 很
低，几乎没有 ；EG 酶活力低于 70%、90% 饱和度
（NH4）2SO4 脱盐酶液中的酶活性。经 90% 饱和度
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0.02
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I
II
III
IV V
图 5 Sephadex G-100 纯化蛋白层析图
从图 5 凝胶层析谱图中可以看出，脱盐酶液经
过 Sephadex G-100 进一步分离纯化后，出现了 5 个
主要的蛋白活性峰。通过对各协同酶组分活力参数
的分析发现 EG 酶主要集中在主峰Ⅴ中，CBH 主要
集中在Ⅲ峰中，而 CB 酶则主要集中在Ⅰ峰内。
2.4 纯化回收率的计算
对比分析各分离纯化步骤中单一酶组分的比活
力、回收率及纯化倍数，其结果见表 1-表3 所示。
分析表中数据可知，Sephadex G-25 脱盐虽会造
成部分蛋白酶的损失，但却存在一定分离提纯的效
果。经 Sephadex G-25 脱盐后各协同酶组分纯化倍数
分别为 1.59、3.12、1.36。经 Sephadex G-100 分离纯
化后各组分酶比活力得到显著提高，其数值分别为
1 031.43 U/mg、274.73 U/mg、1 280.18 U/mg， 纯 化
倍数分别为 3.46、4.14、3.58。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期190
2.5 SDS-PAGE蛋白电泳检测
经上述研究发现，分离纯化后 3 种协同酶组分
主要集中在 3 个不同的主峰中，分别收集 3 个峰对
应的蛋白酶液，通过 SDS-PAGE 电泳检测（图 6），
计算出现的单一条带酶组分的相对分子质量。
37.49 kD。CBH 酶在泳道 2 中呈现出一条单一蛋白
电泳条带，表明已达到电泳纯程度，计算其相对分
子量为 56.51 kD。CB 酶在泳道 3 中基本为单条带，
但稍有拖带现象出现，说明样品的纯度不够，使得
杂质蛋白成为 CB 酶蛋白的干扰项，这与在 Sephadex
G-100 层析图谱中看出的，且在 CB 酶纯化的过程中
形成一个相对较宽的谱峰（Ⅰ）结论相吻合，虽然
未能达到电泳纯程度，但可知其相对分子量范围在
115.74 -168.33 kD 之间。可见，通过上述纯化步骤，
已基本实现了不同种类纤维素酶的纯化工作。
3 讨论
综合考虑除盐后各单一酶组分活性及协同效应，
本试验选取经 70% 饱和度（NH4）2SO4 沉淀后的除
盐酶液进行后续分离纯化的工作，经 Sephadex G-100
分子筛凝胶过滤后发现，与粗酶液相比，其 EG 酶
的比活力由 298.04 U/mg 提高到 1 031.43 U/mg，回
收率达到 18.07%、纯化倍数达到 3.46，CBH 酶的
比活力由 66.37 U/mg 升高到 274.73 U/mg，回收率为
12.96%、纯化倍数为 4.14，而 CB 酶的比活力由原
来的 357.67 U/mg 提高到 1 280.18 U/mg，回收率可
达 22.37%、纯化倍数达到 3.58。单一酶组分的回收
率均较低下，其原因可能是由于纯化过程操作步骤
较繁琐，导致纤维素酶部分失活所致［13，15］。通过
SDS-PAGE 电泳检测分析可知，纯化出的两种 EG 酶
表 1 EG 酶的纯化效果
提纯步骤 酶活力（U） 蛋白（mg） 比活力（U/mg） 回收率（100%） 纯化倍数
粗酶液 4509.35 15.13 298.04 100.0 1.0
Sephadex G-25 1089.57 2.30 473.73 24.16 1.59
Sephadex G-100 814.83 0.79 1031.43 18.07 3.46
表 2 CBH 酶的纯化效果
提纯步骤 酶活力（U） 蛋白（mg） 比活力（U/mg） 回收率（100%） 纯化倍数
粗酶液 1038.73 15.65 66.37 100.0 1.0
Sephadex G-25 308.30 1.49 206.91 29.68 3.12
Sephadex G-100 134.62 0.49 274.73 12.96 4.14
表 3 CB 酶的纯化效果
提纯步骤 酶活力（U） 蛋白（mg） 比活力（U/mg） 回收率（100%） 纯化倍数
粗酶液 5436.61 15.20 357.67 100.0 1.0
Sephadex G-25 1540.74 3.17 486.04 28.34 1.36
Sephadex G-100 1216.17 0.95 1280.18 22.37 3.58
170
kD
1M 2 3
130
95
72
55
43
34
26
17
10
M ：蛋白质 Marker ；1 ：EG 酶 ；2 ：CBH 酶 ；3 ：CB 酶
图 6 Sephadex G-100 纯化后各酶组分的电泳检测结果
从图 6 泳道 1 中可以看出有两条单一的蛋白电
泳条带存在，说明分离纯化出两种 EG 酶组分，分
析原因可能是因为在 Sephadex G-100 层析图谱主峰
Ⅴ旁出现一个较小的肩峰，但因相对分子质量太过
接近，出峰时间太快，未能使得 EG 酶组分得到较
好的分离，根据标记蛋白分子量及其相对迁移率，
计算出两种 EG 酶组分相对分子量分别为 29.63 kD、
2014年第6期 191张欢等 ：黑曲霉（AS0006）产纤维素酶的纯化研究
组分相对分子质量分别为 29.63 kD、37.49 kD，CBH
酶相对分子量为 56.51 kD，至于 CB 酶蛋白因为一些
干扰项的存在，没有达到电泳纯程度，可确定其相
对分子量范围在 115.74 -168.33 kD 之间［16，17］。
4 结论
本试验选用黑曲霉菌株 AS0006 产生的纤维素
酶系进行纯化特性分析，为纤维素酶在酶解机理方
面的研究奠定了理论基础，使其对纤维素复合酶制
剂的开发具有一定指导意义，以达到能够获得高活
性纤维素复合酶制剂的目的。
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（责任编辑 李楠）