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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
人乳寡糖及其类似物由于安全、可靠，不产生
抗药性，并且具有部分免疫功能［1］，以人乳寡糖及
其类似物为原料开发新型药物成为当前医药领域的
一大热点。目前我国对人乳寡糖的研究开发仍处于
初始阶段且多采用化学合成法获得人乳寡糖及其类
似物。由于糖苷供体价格昂贵［2］、合成路径复杂［3］
收稿日期 ： 2014-05-04
基金项目 ：国家高技术研究发展计划“863 计划”资助项目（2012AA021502），教育部长江学者和创新团队发展计划项目（IRT1166）
作者简介 ：靳文斌，男，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程，E-mail ：jinwenbin-1988@163.com
通讯作者 ：李玉，女，教授，研究方向 ：应用微生物与酶工程 ；E-mail ：liyu@tust.edu.cn
合成唾液酸乳糖重组大肠杆菌的构建
靳文斌  张萧萧  李玉  路福平
（天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 工业酶国家工程实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）
摘 要 ： 唾液酸寡糖具有抗感染、提高免疫力、促进双歧杆菌增殖等功能，对其微生物合成方法的研究具有重要的理论
和应用价值。克隆和表达来源于 Campylobacter jejuni 的 N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC）、乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB）、
CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA）和来源于 Nesseria meningitidis 的唾液酸转移酶基因（nst），利用表达载体 pSTV29，在大肠
杆菌 Escherichia coli JM109 内构建合成唾液酸乳糖的代谢途径。在接种量 2%、装液量 50 mL/250 mL 三角瓶、摇床转速 180 r/min、
温度 34℃的条件下发酵 30 h，并以 10 g/L 乳糖为底物，利用 HPLC 检测到唾液酸乳糖的合成量为 2.45 g/L，为人乳唾液酸寡糖及其
类似物的异体合成提供了新的思路。
关键词 ： 唾液酸乳糖 大肠杆菌 代谢工程
The Construction of E.coli Engineering Strain for Sialyllactose
Production
Jin Wenbin Zhang Xiaoxiao Li Yu Lu Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，
Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，the College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin
300457）
Abstract: Free sialylated oligosaccharides are known to have anti-infective and immunostimulating properties and also known to promote
bifidobacterium proliferation, thus investigating the microbial synthetic route of sialylated oligosaccharides is of great value. Biosynthesis of
sialyllactose involves N-acetylglucosamine-6-phosphate-epimerase（neuC）, sialic acid synthase（neuB）, CMP-Neu5Ac synthetase（neuA）
and α-2, 3-sialyltransferase（nst）. We engineered a biosynthetic pathway sialyllactose production in E.coli JM109, using the expression vector
pSTV29, by coexpressing the α-2, 3-sialyltransferase gene from Neisseria meningitidis with the neuA, neuB and neuC Campylobacter jejuni genes
encoding CMP-NeuAc synthetase, sialic acid synthase and N-acetylglucosamine-6-phosphate-epimerase, respectively. Under the optimized
fermentation conditions（inoculum volume 2%, 10g/L lactose, fermentation volume 50 mL/250 mL, temperature 34℃, rotation speed 180 r/min,
fermentation time 30 h）, sialyllactose of 2.45 g/L was obtained. The above results provide a platform for exploring commercial production of
sialylated oligosaccharides and its functional analogues in heterogeneous microbial hosts.
Key words: Sialyllactose E.coli Metabolic engineering
及分离纯化困难，限制了人乳寡糖及其类似物的工
业应用。伴随着相关基因不断解析和微生物代谢路
径不断得到阐明［4-7］，使得利用生物技术的方法大
量获得人乳寡糖成为可能。
唾液酸寡糖是人乳寡糖的重要组成成分，具有
抗感染、提高免疫力、促进双歧杆菌增殖等功能［8］，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期202
在食品医药行业具有广阔的市场前景，近年来受到
人们的广泛关注。由于化学合成法涉及复杂的保护
和去保护步骤，人们把目光转向了生物技术的方
法。利用组合生物学技术，人们已成功合成壳聚
糖［9，10］、岩藻糖基化寡糖［11］、神经节苷脂等碳水
化合物［12］，为合成唾液酸寡糖提供了新思路，解决
了难以实现规模合成的难题。
本 研 究 主 要 是 将 来 源 于 空 肠 弯 曲 杆 菌（C.
jejuni）的 N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC）、乙
酰神经氨酸合成酶基因（neuB）、CMP-乙酰神经氨
酸合成酶基因（neuA）和来源于脑膜炎奈瑟氏菌（N.
meningitidis）的唾液酸转移酶基因（nst）引入大肠
杆菌 JM109，在其体内构建合成唾液酸乳糖的合成
途径，以乳糖为底物合成唾液酸乳糖，合成途径如
图 1。
为国产分析纯试剂。
1.1.3 培养基 LB 培养基（g/L）：蛋白胨 10，酵母
浸粉 5，NaCl 10，pH7.0，121℃灭菌 20 min。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖 40，酵母粉 5，硫
酸 铵 5， 磷 酸 氢 二 钠 4， 磷 酸 二 氢 钾 0.5，pH6.8，
115℃灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 工 程 菌 JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst
的 构 建 将 质 粒 pUC57-neuA-neuB-neuC 和 质 粒
pSTV29 分别用限制性内切酶 Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶
切，酶切产物经纯化回收后，用 Solution Ⅰ于 16℃
连接过夜，利用电转化法转入大肠杆菌 Escherichia
coli JM109 中，通过氯霉素抗性平板筛选转化子，获
得工程菌 JM109/pSTV29-neuB-neuC，用同样的方法
构建工程菌 JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC 和工程
菌 JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst，重组质粒用
双酶切法进行鉴定。
1.2.2 唾液酸乳糖及其中间产物的发酵合成 将
构 建 的 工 程 菌 JM109/pSTV29-neuB-neuC、JM109/
pSTV29-neuA-neuB-neuC 和 JM109/pSTV29-neuA-
neuB-neuC-nst 分别接种于 5 mL LB 液体培养基中，
37℃ 180 r/min 培养过夜。按 2% 接种量转入 50 mL
新鲜的大肠杆菌发酵液体培养基中，氯霉素终浓度
为 40 μg/mL，34℃培养至 OD600=0.4-0.6，加入 IPTG
至终浓度为 1 mmol/L，34℃诱导培养 30 h。
1.2.3 唾液酸乳糖及其中间产物的分析检测 HPLC
和 LC-MS 分析条件为色谱柱 ：Aminex HPX-87H Col-
umn，300 mm×7.8 mm ；检测器 ：示差折光检测器 ；
流动相 ：H2O+0.05 mol/L H2SO4 ；柱温 ：40℃ ；进样
量 ：10 μL ；流速 ：0.5 mL/min。
取诱导培养后的发酵液和菌体细胞，超声破碎
（功率 500 W，振幅 35%，每个循环超声 4 s，冷却
5 s，10 min），4℃，12 000 r/min 下离心 10 min，收
集上清进行 HPLC 分析。用配置好的 1 mg/mL 的 N-
乙酰神经氨酸、1 mg/mL 的唾液酸乳糖的标品溶液
作为对照以确定发酵液中相应产物的出峰位置。并
对发酵液进行 LC-MS 分析，对产物进行进一步确定。
根据 N-乙酰神经氨酸的分子量（311）、唾液酸乳糖
的分子量（633）设定扫描质量范围 100-700，负离
lacY
Gal β1-4Glc
Gal β1-4Glc
CMP-NeuAc CMP
CTP
NeuAc
neuA
neuB
nauA
Pyruvate
ManNAc
nanK
ManNAc-6-p
PEP
neuC
glmU
UDP-GlcNAc
GlcN-1-p
glmM
GlcN-6-p
glmS nagB
Fru-6-p
nagA
GlcNAc-6-p
Glc
nanE
Sialyllactose
nst
图 1 合成唾液酸乳糖工程菌代谢途径
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒 Escherichia coli JM109 和大肠杆
菌表达质粒 pSTV29 均为本实验室保藏 ；重组质粒
pUC57-neuA-neuB-neuC 和 pUC57-nst 均由英潍捷基
（上海）贸易有限公司进行 neuA、neuB、neuC、nst
基因合成时提供。
1.1.2 试 剂 限 制 性 内 切 酶 Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ、
Kpn Ⅰ、Sac Ⅰ和 Solution Ⅰ，大连宝生物工程有限
公司 ；1 kb DNA Ladder、普通琼脂糖凝胶 DNA 回收
试剂盒、质粒小量提取试剂盒，北京天为时代科技
有限公司 ；氯霉素，上海生工生物工程公司 ；其他
2014年第10期 203靳文斌等：合成唾液酸乳糖重组大肠杆菌的构建
子模式，检测 N-乙酰神经氨酸标品，再根据标品的
信号大小设置 SIM 碰撞诱导解离参数，进样量为 10
μL 检测发酵样品。
2 结果
2.1 工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst的
构建
2.1.1 重组质粒 pSTV29-neuB-neuC 的构建及鉴定
将 PstⅠ/EcoRⅠ双酶切处理过的质粒 pUC57-neuA-
neuB-neuC 和质粒 pSTV29 与 SolutionⅠ混合，连接产
物转化大肠杆菌 JM109，获得工程菌 JM109/pSTV29-
neuB-neuC。对阳性转化子质粒采用 PstⅠ/EcoRⅠ双
酶切验证，结果如图 2 所示。从图 2 中可以看出，
在 2 300 bp 及 3 000 bp 左右出现两条带，与串联基
因 neuB、neuC 和质粒 pSTV29 大小一致，说明重组
质粒 pSTV29-neuB-neuC 构建成功。
阳性转化子质粒采用 PstⅠ/KpnⅠ双酶切验证，结
果 如 图 4 所 示。 从 图 4 中 可 以 看 出， 在 3 900 bp
及 3 000 bp 出现两条带，与串联基因 neuA、neuB、
neuC、nst 和质粒 pSTV29 大小一致，说明重组质粒
pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst 构建成功。
3000
bp
1 M
2000
M ：1 kb DNA ladder ；1 ：pSTV29-neuB-neuC/Pst Ⅰ /EcoR Ⅰ
图 2 重组质粒 pSTV29-neuB-neuC 酶切电泳图
2.1.2 重组质粒 pSTV29-neuA-neuB-neuC 的构建及
鉴定 将 Pst Ⅰ /Kpn Ⅰ双酶切处理过的质粒 pUC57-
neuA-neuB-neuC 和 质 粒 pSTV29 与 SolutionⅠ 混
合，连接产物转化大肠杆菌 JM109，获得工程菌
JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC。对阳性转化子质粒
采用 PstⅠ/KpnⅠ双酶切验证，结果如图 3 所示。从
图中可以看出，在 2 900 bp 及 3 000 bp 出现两条带，
与串联基因 neuA、neuB、neuC 和质粒 pSTV29 大小
一致，说明重组质粒 pSTV29-neuA-neuB-neuC 构建
成功。
2.1.3 重组质粒 pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst 的构建
及鉴定 将 KpnⅠ/SacⅠ双酶切处理过的质粒 pSTV-
29-neuA-neuB-neuC 和 质 粒 pUC57-nst 与 SolutionⅠ
混合，过夜连接，连接产物转化大肠杆菌 JM109，
构建工程菌 JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst。对
3000
bp
1M
2000
M ：1 kb DNA ladder ；1 ：pSTV29-neuA-neuB-neuC/Pst Ⅰ /Kpn Ⅰ
图 3 重组质粒 pSTV29-neuA-neuB-neuC 酶切电泳图
4000
bp
1M
3000
M ：1 kb DNA ladder ；1 ：pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst/Pst Ⅰ /Sac Ⅰ
图 4 重组质粒 pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst 酶切电泳图
2.2 唾液酸乳糖及其中间产物的分析检测
2.2.1 N-乙酰神经氨酸和 CMP-乙酰神经氨酸的分析
检测 工程菌 JM109/pSTV29-neuB-neuC 发酵后，对
发酵反应液超声破碎，离心收集上清，HPLC 检测
结果如图 5 所示。由图 5-B 可以看出对发酵液进行
HPLC 分析，在大约 14 min 处出现了预期的峰，这
与图 5-A 中 N-乙酰神经氨酸标品的出峰时间相同，
可以判定构建的工程菌 JM109/pSTV29-neuB-neuC 可
以合成 N-乙酰神经氨酸。
采用同样的发酵和检测方法，对工程菌 JM109/
pSTV29-neuA-neuB-neuC 合成 CMP-乙酰神经氨酸的
情 况 进 行 分 析，HPLC 检 测 工 程 菌 JM109/pSTV29-
neuA-neuB-neuC 的发酵反应液在 CMP-乙酰神经氨酸
的出峰位置处没有吸收峰形成。
为了进一步确定所生成的产物是 N-乙酰神经氨
酸，应用 LC-MS 对发酵产物进行质谱分析。发酵样
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期204
品检测结果如图 6 所示，根据 N-乙酰神经氨酸的结
构及分子量，设置扫描质量范围为 100-700，在负
离子模式下，得到 N-乙酰神经氨酸标品的 M/Z ：334
（M+Na）-。
如图 6-A，N-乙酰神经氨酸标品的信号大小设
置 SIM 碰撞诱导解离参数为 334，进样量为 10 μL。
检测发酵样品，如图 6-B 所示，发酵样品出现的质
谱信号发现在 M/Z ：334.1（M+Na）- 有离子峰，这与
N-乙酰神经氨酸标品离子峰大小一致，进一步证明
了发酵液中的产物为 N-乙酰神经氨酸。
2.2.2 产物唾液酸乳糖的分析检测 工程菌 JM109/
pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst 发酵后，超声破碎，离
心收集上清，发酵样品检测结果如图 7 所示。由图 7-B
可以看出对发酵液进行 HPLC 分析时，在大约 8 min
处出现了预期的峰，这与图 7-A 中唾液酸乳糖标品
的出峰时间相同，对照组中同样在相同时间具有吸
收峰，但是在 8 min 处图 7-B 中峰面积与图 7-C 中峰
面积相比较，在 8 min 处图 7-B 峰面积明显偏大，因
此可以判定构建的工程菌 JM109/pSTV29-neuA-neuB-
neuC-nst 合成了唾液酸乳糖。
为了进一步确定所生成的产物是唾液酸乳糖，
应用 LC-MS 对发酵产物进行质谱分析。发酵样品检
测结果如图 8 所示，根据唾液酸乳糖的结构及分子
量，设置扫描质量范围为 100-700，在负离子模式下，
得到唾液酸乳糖标品的 M/Z ：632（M-H）-。
15000
25000
20000
30000
mRU
10000
5000
0
15000
25000
20000
30000
mRU
10000
5000
0
15000
mRU
C
B
A
10000
5000
0
0 5 10 15
0 5 10 15
0 5 10 15
NeuA
NeuAc
A ：N-乙酰神经氨酸标品 ；B ：发酵液中 N-乙酰神经氨酸 ；C ：对照组
图 5 N-乙酰神经氨酸标品和发酵液液相色谱图
100
80
60
40
20
Max: 201363
34
.0
33
5.
0
31
8.
0
25
6.
0
25
8.
0
22
0.
0
0
300
A
400 m/2
95
96
97
98
99
100
101
102
103
Max: 2072
33
4.
1
B
334 m/2
（A）：6 N-乙酰神经氨酸标品 ；（B）：发酵液中 N-乙酰神经氨酸
图 6 N-乙酰神经氨酸标品和发酵样品的质谱分析
2014年第10期 205靳文斌等：合成唾液酸乳糖重组大肠杆菌的构建
根据标品的信号大小设置 SIM 碰撞诱导解离参
数为 632，进样量为 10 μL 检测发酵样品，如图 8-B
所示，发酵样品在出现的质谱信号发现在 M/Z ：632
（M-H）- 有离子峰，这与唾液酸乳糖标品离子峰大
小一致，而对照菌在相应的位置却没有离子峰出现，
进一步证明了发酵液中的产物为唾液酸乳糖。
3 讨论
在哺乳动物体内 CMP-乙酰神经氨酸的生物合
成通路受到 N-葡萄糖胺异构酶的调节控制［13］，具
体表现为 CMP-乙酰神经氨酸反馈抑制 N-葡萄糖胺
异构酶的活性。在微生物体内这种反馈抑制途径还
没得到证实，然而细菌来源的 N-葡萄糖胺异构酶与
哺乳动物来源的 N-葡萄糖胺异构酶表现出较高的序
列同源性，因此在微生物体内也可能存在相似的反
馈抑制途径。这就可以解释在串联了 neuA、neuB、
neuC 三个目的基因的重组菌中发酵后在在发酵液中
检测不到 N-乙酰神经氨酸且 CMP-乙酰神经氨酸的
合 成 量 较 少。Fierfort［14］ 在 同 时 引 入 neuA、neuB、
neuC 的工程菌中检测不到 N-乙酰神经氨酸，本研究
结果也证实了这个观点。
以 10 g/L 乳糖为底物，180 r/min 34℃持续发酵
30 h，唾液酸乳糖的合成量为 2.45 g/L，Drouillard
等［15］ 利用重组大肠杆菌采用高密度持续发酵的
方 法， 唾 液 酸 乳 糖 的 合 成 量 为 34 g/L， 与 其 相
0
0
1000
2000
3000
4000
5000
nRU
2 4 6 8 10
0
0
10000
20000
30000
40000
nRU
5 10 15 20
0
0
5000
10000
15000
20000
30000
25000
nRU
A
B
C
5 10 15
Sialyllactose
7.978 min
7.956 min
A ：唾液酸乳糖标品 ；B ：发酵液中唾液酸乳糖 ；C ：对照组
图 7 唾液酸乳糖标品和发酵液液相色谱图
600
63
4.
1
63
3.
1
63
2.
1
Max: 12706
400200
0
20
40
60
80
100
m/2
A
630
Max: 2169
63
2.
0
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
B
632 m/2
A ：唾液酸乳糖标品 ；B ：发酵液中唾液酸乳糖
图 8 唾液酸乳糖标品和发酵样品的质谱分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期206
比 我 们 构 建 的 重 组 菌 由 于 没 有 敲 除 乙 酰 神 经 氨
酸 醛 缩 酶 基 因（nanA）、 乙 酰 神 经 氨 酸 激 酶 基 因
（nanK）等，导致合成的 N-乙酰神经氨酸通过其它
途径进行分解代谢，从而影响终产物唾液酸乳糖的
累积量，此外发酵控制条件和选用的表达载体也会
影响唾液酸乳糖的合成量。尽管如此，本研究仍对
唾液酸乳糖的异源合成做出了有益探索。
4 结论
本试验利用基因工程技术成功地将来源于空肠
弯 曲 杆 菌（Campylobacter jejuni） 的 N-乙 酰 葡 萄 糖
胺异构酶基因（neuC）、乙酰神经氨酸合成酶基因
（neuB）、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA）和
来源于脑膜炎奈瑟氏菌（N. meningitidis）的唾液酸
转移酶基因（nst）克隆到大肠杆菌表达载体 pSTV29
中，在大肠杆菌 JM109 体内构建了合成唾液酸乳糖
的合成途径，从而合成唾液酸乳糖。利用工程菌，
34℃持续发酵 30 h，唾液酸乳糖的合成量为 2.45 g/L。
参 考 文 献
［1］Bertino E, Giuliani F, Occhi L, et al. Benefits of donor human
milk for preterm infants ：current evidence［J］. Early Human
Development, 2009, 85（10）：S9-S10.
［2］Kong F. Recent studies on reaction pathways and applications
of sugar orthoesters in synthesis of oligosaccharides［J］.
Carbohydrate Research, 2007, 342（3）：345-373.
［3］Stahl B, Thurl S, Zeng JR, et al. Oligosaccharides from human milk
as revealed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spec-
trometry［J］. Analytical Biochemistry, 1994, 223（2）：218-226.
［4］Mine T, Katayama S, Kajiwara H, et al. An α2, 6-sialyltransferase
cloned from Photobacterium leiognathi strain JT-SHIZ-119
shows both sialyltransferase and neuraminidase activity［J］.
Glycobiology, 2010, 20（2）：158-165.
［5］Vann WF, Tavarez JJ, Crowley J, et al. Purification and
characterization of the Escherichia coli Kl neuB gene product
N-acetylneuraminic acid synthetase［J］. Glycobiology, 1997, 7（5）：
697-701.
［6］ Vann WF, Daines DA, Murkin AS, et al. The NeuC protein of
Escherichia coli K1 is a UDP N-acetylglucosamine 2-epimerase［J］.
Journal of Bacteriology, 2004, 186（3）：706-712.
［7］ Daines DA, Wright LF, Chaffin DO, et al. NeuD plays a role in
the synthesis of sialic acid in Escherichia coli K1［J］. FEMS
Microbiology Letters, 2000, 189（2）：281-284.
［8］ Zhang X, Kiechle FL. Glycosphingolipids in health and
disease［J］. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2004, 34（1）：
3-13.
［9］ Samain E, Drouillard S, Heyraud A, et al. Gram-scale synthesis
of recombinant chitooligosaccharides in Escherichia coli［J］.
Carbohydrate Research, 1997, 302（1）：35-42.
［10］ Cottaz S, Samain E. Genetic engineering of Escherichia coli for
the production of N I, N II-diacetylchitobiose（chitinbiose）
and its utilization as a primer for the synthesis of complex
carbohydrates［J］. Metabolic Engineering, 2005, 7（4）：311-
317.
［11］ Wada J, Honda Y, Nagae M, et al. 1, 2-α-L-Fucosynthase ：a
glycosynthase derived from an inverting α-glycosidase with an
unusual reaction mechanism［J］. FEBS Letters, 2008, 582（27）：
3739-3743.
［12］ Antoine T, Heyraud A, Bosso C, et al. Highly efficient biosynthesis
of the oligosaccharide moiety of the GD3 ganglioside by using
metabolically engineered Escherichia coli［J］. Angewandte
Chemie, 2005, 117（9）：1374-1376.
［13］ Kornfeld S, Kornfeld R, Neufeld EF, et al. The feedback control
of sugar nucleotide biosynthesis in liver［J］. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America,
1964, 52（2）：371.
［14］ Fierfort N, Samain E. Genetic engineering of Escherichia coli for the
economical production of sialylated oligosaccharides［J］. Journal
of Biotechnology, 2008, 134（3）：261-265.
［15］ Drouillard S, Mine T, Kajiwara H, et al. Efficient synthesis of
6-sialyllactose, 6, 6-disialyllactose, and 6-KDO-lactose by
metabolically engineered E. coli expressing a multifunctional
sialyltransferase from the Photobacterium sp. JT-ISH-224［J］.
Carbohydrate Research, 2010, 345（10）：1394-1399.
（责任编辑 李楠）