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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
β-1，3-1，4-葡聚糖是一种结构性非淀粉多糖，
是谷物类细胞壁的主要成分之一，是由 β-1，3 和 β-1，
4 糖苷键连接形成的 D 型葡聚糖聚合物［1］。β-1，3-1，4-
葡聚糖酶（简称 β-葡聚糖酶或地衣多糖酶）专一性
催化 β-1，3-1，4-葡聚糖混合糖苷键中 β-1，4 键的
水解，而对仅含 β-1，4-糖苷键的多糖不起作用。β-
葡聚糖酶在酿造、饲料和制糖工业中都有广泛的应
用。啤酒制作过程中高浓度的 β-葡聚糖能造成啤酒
收稿日期 ： 2013-07-26
基金项目 ：贵州省科技厅基金项目（黔科合 J 字 LKZ［2010］42 号）
作者简介 ：邵敏，女，硕士，副教授，研究方向 ：生物技术 ；E-mail ：sm780909@163.com
通讯作者 ：周鹤峰，男，副教授，硕士生导师，研究方向 ：医药生物技术 ；E-mail ：hfztim@163.com
基于易错 PCR 技术定向进化枯草芽孢杆菌 β-葡聚糖酶
邵敏1  李长福2  葛正龙2  周鹤峰1
（1. 遵义医学院珠海校区生物工程系，珠海 519041 ；2. 遵义医学院生物化学教研室，遵义 563003）
摘 要 ： 利用易错 PCR 技术对来自枯草芽孢杆菌的 β- 葡聚糖酶基因（bgls）进行改造，并对野生酶和突变酶的酶学性质进
行研究。以枯草芽孢杆菌基因组 DNA 为模板，通过易错 PCR 技术得到突变基因产物，将其重组于表达载体 pET32a（+），构建 β-
葡聚糖酶基因的突变体文库，通过刚果红平板染色法进行高通量筛选，最终获得两株突变酶，其最适作用温度比野生酶都提高了
15℃，最适 pH 与野生酶基本相同，野生酶酶活力为 84.2 U/mL，突变酶酶活力分别为 247.3 U/mL 和 125.1 U/mL，是野生酶酶活的 2.9
倍和 1.5 倍。试验获得了具有耐高温高酶活的 β- 葡聚糖酶，为 β-葡聚糖酶的工业化应用奠定基础。
关键词 ： 枯草芽孢杆菌 β-葡聚糖酶 易错 PCR 定向进化
Directed evolution of β-glucanase from Bacillus subtilis by
Error-prone PCR
Shao Min1 Li Changfu2 Ge Zhenglong2 Zhou Hefeng1
（1. Department of Bioengineering，Zunyi Medical College Zhuhai Campus，Zhuhai 519041 ；2. Department of Biochemistry，Zunyi Medical
College，Zunyi 563003）
Abstract:  In order to obtain β-glucanase with higher thermostability，error-prone PCR was used to evolve the β-glucanase from Bacillus
subtilis，and properties of intact and mutant enzymes were analysed .Using the total DNA of Bacillus subtilis as template，the gene of β-glucanase
（bgls）was amplified by error-prone PCR，the gene was cloned into pET32a（+）expression vector，and a mutant library was constructed，
and positive clones were screened by Congo red staining，two mutant enzymes were obtained .Comparing to intact enzyme，the optimal
temperature of two mutant enzymes were both increased by 15℃，while the optimal pH of mutant enzymes were nearly unchanged.The catalytic
activity of intact enzyme was 84.2 U/mL，the catalytic activities of mutant enzyme were 247.3 U/mL and 125.1U/mL respectively，the catalytic
activities of two mutants were 2.9 and 1.5 fold higher than that of the intact enzyme respectively.These results have provided a base for further
industrialized application of β-glucanase.
Key words:  Bacillus subtilis β-glucanase Error-prone PCR Directed evolution
混浊，同时会影响麦汁的过滤速度和发酵等各个环
节 ；β-葡聚糖作为饲料中的抗营养因子，添加有 β-
葡聚糖酶的饲料利用率增加，有效提高了饲粮的营
养价值。
微生物来源的 β-葡聚糖酶目前国内外研究主要
是从芽孢杆菌属中获得，早在 1983 年 Cantwell 等首
次从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中克隆得到 β-
葡聚糖酶基因，但枯草芽孢杆菌在分泌 β-葡聚糖酶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期142
时也会分泌其它酶类，同时，在工业生产中需要高
活性的酶，国内外虽然对 β-葡聚糖酶研究较多，但
国内对其需求较大。
酶的定向进化是蛋白质工程的新策略，属于蛋
白质的“非理性设计”方法，不需要事先了解蛋白
质的结构信息，在实验室中人为模拟突变、重组和
筛选等步骤，在较短时间内完成在自然条件下需要
漫长年代完成的进化过程，最终选择出所需性质的
进化酶［2］。易错 PCR 因其操作简便、快速、价格低
廉等特点，是目前常用的定向进化技术之一［3］，用
该方法已经实现对多种酶的进化，极大丰富和发展
了酶类资源［4-6］。因此，本研究对来自枯草芽孢杆
菌中的β-葡聚糖酶基因应用易错 PCR 技术进行改造，
并以基因工程手段用大肠杆菌作为宿主生产出高活
性且耐热的 β-葡聚糖酶，为 β-葡聚糖酶的工业化应
用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
购自广东环凯微生物科技有限公司 ；pET32a（+）质
粒及大肠杆菌 DH5a、BL21（DE3）菌株均由本实验
室保存。
1.1.2 试 剂 限 制 性 核 酸 内 切 酶 EcoR I、Kpn I、
T4DNA 连 接 酶 为 TaKaRa 公 司 产 品，Trans2K Plus
DNA Marker 为北京全式金生物技术有限公司产品，
高保真即用 PCR 扩增试剂盒，UNTQ-10 柱式 DNA
胶回收试剂盒为上海生工生物工程公司产品，镍离
子亲和层析柱（Ni-NTA）购自 Qiagen 公司，刚果红
为 Amresco 公司产品，IPTG 为 Sigma 公司产品，其
余化学试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 枯草芽孢杆菌基因组 DNA 的提取 将枯草芽
孢杆菌在 LB 平板上划线培养，挑取单菌落接种于
液体培养基中，37℃培养过夜，收集菌体，采用改
良 CTAB 法提取基因组 DNA，经 0.8% 琼脂糖凝胶
电泳观察基因组 DNA 的完整性，分光光度法测定浓
度及纯度，-20℃保存备用。
1.2.2 易 错 PCR 法 扩 增 bgls 基 因 根 据 GenBank
中（登录号 ：Z46862.1）β －葡聚糖酶基因（bgls）
ORF 序列设计引物，为便于表达载体的构建，在上
下游引物的 5 端分别引入了 Kpn I 和 EcoR I 酶切为
点，并添加适当保护碱基。bgls F5-ggGGTACCATG
CCTTATCTGAAACGAGTGTTGCTGC-3（ 划 线 部 分
为 Kpn I 酶切位点），bgls R 5-cgGAATTCTTATTTTT
TTGTATAGCGCACCCAGTC-3（ 划 线 部 分 为 EcoR I
酶切位点）。以枯草芽孢杆菌总 DNA 为模板，进行
易错 PCR 扩增 β-葡聚糖酶基因。每 50 μL 反应体系
为：10×Taq PCR buffer 5 μL，4 μL dNTPs（2.5 mmol/L
dGTP 和 dATP，10 mmol/L dCTP 和 dTTP）；bgls F
和 bgls R 各 50 pmol ；基因组 DNA 模板 50 ng，0.5
mmol/L 的 Mn2+，0.5 U/μL 的 Taq DNA 聚 合 酶 2.5
μL，3-7 mmol/L 的 Mg2+，补充超纯水至总体积为 50
μL。易错 PCR 反应条件 ：94℃预变性 5 min ；94℃
变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30 个循
环 ；72℃延伸 10 min，4℃保温。
1.2.3 突变文库的构建 易错 PCR 产物经琼脂糖凝
胶电泳后回收，用限制性内切酶 EcoR I、Kpn I 分别
对 pET32a（+）载体和纯化后的易错 PCR 产物进行
酶切，电泳，回收纯化后，将载体和目的片段连接，
将重组载体转化大肠杆菌 BL21（DE3），构建突变
体库。
1.2.4 重组载体的鉴定 随机挑取在 AMP 平板上生
长的单菌落进行培养，提取质粒 DNA，进行 PCR 扩
增和酶切鉴定后送交公司测序，鉴定含有突变基因
的重组载体是否构建成功。用未添加锰离子及镁离
子的扩增体系得到的 bgls 基因与 PET32a（+）连接
构建成未突变的对照体。
1.2.5 SDS-PAGE 电泳分析 随机挑取库中三克隆
以 1 mmol/L IPTG 诱导蛋白表达 3 h，收集其中一个
克隆上清液，3 个克隆收集菌体进行超声裂解，用
SDS-PAGE 电泳分析 β-葡聚糖酶在 E.coli BL21 中的
表达情况。
1.2.6 突变文库的筛选 对所构建的突变体库进行
高通量筛选参考吴华伟等的刚果红平板筛选法［7］，
细菌在含有 1 mmol/L IPTG 和 AMP 的平板诱导培养
12 h，待菌落密度达到 50 个左右，通过定位膜转印
技术进行转移，并使用裂解液将菌体裂解，使 β-葡
聚糖酶释放，将膜片 80℃处理 30 mim，原平板继续
37℃培养，膜的菌落面朝下作用于含有 30ug/mL 大
2013年第12期 143邵敏等 ：基于易错 PCR 技术定向进化枯草芽孢杆菌 β-葡聚糖酶
麦 β-葡聚糖的筛选平板，55℃，1.5 h，并用刚果红
染色观察筛选平板上透明圈的情况。
1.2.7 酶学性质分析 酶活测定采用 DNS 法，具体
方法参照文献进行［8，9］，选取透明圈与菌落直径比
值较大的菌株进行 IPTG 诱导表达，将诱导后的菌体
收集，超声裂解菌体，用 Ni-NAT 柱纯化目标蛋白。
酶活定义 ：在 55℃，pH6.5 条件下，每毫升酶液每
分钟水解 β-葡聚糖产生相当于 1 μmol 的葡萄糖还原
物质的量为 1 个酶活力单位（U/mL）。
1.2.7.1 β-葡聚糖酶最适反应温度及其热稳定性 将
野生菌和突变菌分别诱导表达后的酶液在 40℃、
45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃
等一系列温度下，测定酶活，以温度为横轴，相对
酶活力为纵轴作图，以最大酶活力为 100%，每个菌
株每种温度下进行 3 个平行。
将酶液分别在 40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、
65℃、70℃、75℃、80℃下热处理 30 min，立即冰浴，
加入底物测定剩余酶活，未经处理的酶液的酶活定
为 100%。
1.2.7.2 β-葡聚糖酶最适反应 pH 及酶活对比 pH
对酶活性有重要调节作用，将野生菌和突变菌分别
诱导表达后的酶液在 pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、
pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0 等 一 系 列 pH
的缓冲体系下，测定酶活，以 pH 为横轴，相对酶
活力为纵轴作图，以最大酶活力为 100%，每个菌株
每种 pH 下进行 3 个平行。
采用 DNS 法，分别在最适温度和 pH 条件下测
定野生酶和突变酶酶活力。
2 结果
2.1 枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取
采用改良 CTAB 法提取枯草芽孢杆菌基因组基
因组 DNA，电泳结果如图 1 所示，DNA 的完整性良
好，分光光度法检测其纯度与浓度符合要求。
2.2 bgls基因的易错PCR扩增
Mn2+ 浓度为 0.5 mmol/L，通过目的基因扩增的
特异性等情况，最终确定 Mg2+ 浓度为 6.0 mmol/L，
在此条件下进行易错 PCR 扩增，bgls 基因 ORF 全长
为 729 bp，扩增得到的目的片段与其大小相符，电
泳结果见图 2。
bp
M 1
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
M ：DNA 标准 ；1 ：基因组 DNA
图 1 枯草芽孢杆菌基因组 DNA 电泳鉴定
bp
M 1 2 3 4
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
M ：DNA 标准 ；1-4 ：PCR 扩增产物
图 2 易错 PCR 产物电泳鉴定
2.3 重组载体的鉴定
试验中通过易错 PCR 扩增得到转化子约 3 000
株，构成 bgls 基因的突变体文库。分别从 10 块平
板上各随机挑选一个转化子，经 PCR 扩增得到与目
的基因片段一致，提取质粒酶切得到约 5 900 bp 的
大片段和 700 bp 左右的小片段（图 3），测序结果与
GenBank 序列比对分析表明载体成功构建，通过易
错 PCR 方法已引入突变，且 10 个克隆引入的突变
不一，所得库可用于下一步筛选。
M ：DNA 标准 ；1-3 ：PCR 扩增产物 ；4-6 ：双酶切产物
图 3 重组载体电泳鉴定
bp
M M1 2 3 4 5 6
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期144
2.4 融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析
随机挑取库中 3 克隆进行 IPTG 诱导蛋白表达
试验，pET32a（+）载体上的标签蛋白和 bgls 基因
阅读框总共编码 392 个氨基酸，蛋白量分子大小估
算为 43 kD 左右，图 4 结果表明，与预期分子量大
小一致，3 个克隆在菌体内都有高表达，而收集 1
号菌体的培养上清，可见表达不明显，表明工程菌
产生的酶为胞内酶，该酶不属于分泌性表达，所构
建载体库可用于后续高酶活克隆的筛选。
的对照载体作为野生型进行对照，将诱导后的菌体
收集，超声裂解菌体，用 Ni-NAT 柱纯化目标蛋白
进行酶活测定。图 6 所示，野生酶的最适温度约为
55℃，两株突变酶的最适温度为 70℃，通过热稳定
性分析（图 7），野生酶在温度低于 55℃时，可以保
持较高酶活力，超过此温度，酶活迅速下降，70℃
时相对酶活仅为 18%，两株突变酶的酶活都有提高，
其中一株能在 75℃保持 70％以上的相对酶活力。
M 1 2 3 4
85
kD
75
60
50
40
25
M ：蛋白质分子量标准 ；1-3 ：随机 3 个克隆的菌体裂解产物 ；
4 ：1 号菌体培养上清
图 4 融合蛋白的 SDS-PAGE
2.5 突变文库的筛选
通过尼龙膜原位转印的方法，将经过细胞破碎
液处理的尼龙膜贴在含有底物大麦 β-葡聚糖的筛选
平板上，通过刚果红染色和脱色处理后观察透明圈，
结果如图 5 所示，其中有 2 株突变体产生的透明圈
比对照株大且明显。
ሩ➗Ṛ ケਈṚ1
ケਈṚ2
图 5 β-葡聚糖酶菌株刚果红平板筛选
0
20
40
60
80
100
40 50 60 70 80
⑙ᓖć
⴨ሩ
䞦⍫
%
䟾⭏䞦ケਈ䞦1ケਈ䞦2
0
20
40
60
80
100
40 50 60 70 80
⑙ᓖć
⴨ሩ
䞦⍫
%
䟾⭏䞦ケਈ䞦1ケਈ䞦2
图 6 温度对野生酶和突变酶的酶活力影响
图 7 野生酶和突变酶的热稳定性
2.6.2 β-葡聚糖酶最适反应 pH 及酶活对比 野生
酶和突变酶的最适 pH 均为 6.5，突变酶最适 pH 无
明显改变，在 6.0-7.5 范围内酶活较稳定。分别在
最适温度和 pH 条件下测定野生酶和突变酶酶活力，
野生酶酶活力为 84.2 U/mL，突变酶酶活力分别为
247.3 U/mL 和 125.1 U/mL，是野生酶酶活的 2.9 倍和
1.5 倍，说明经过定向进化改造后，酶活力有了很大
提高。
3 讨论
易错 PCR 主要通过调整 Mn2+ 和 Mg2+ 浓度，并
2.6 酶学性质分析
2.6.1 β-葡聚糖酶最适反应温度及其热稳定性 将
筛选得到的 2 株突变体进行 IPTG 诱导表达，未突变
2013年第12期 145邵敏等 ：基于易错 PCR 技术定向进化枯草芽孢杆菌 β-葡聚糖酶
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）
0
20
40
60
80
100
4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
pH٬
⴨ሩ
䞦⍫
%
䟾⭏䞦ケਈ䞦1ケਈ䞦2
图 8 pH 对野生酶和突变酶的酶活力影响
使用不平衡的 4 种碱基浓度来控制突变频率［10］。
Mn2+ 的作用是降低聚合酶对模板的特异性，由于
Taq DNA 聚合酶的保真性大大降低，延伸过程中，
一些碱基被错误地引入到基因中，从而使基因发生
突变，试验中固定 Mn2+ 的浓度 0.5 mmol /L，最终选
择 6.0 mmol/L Mg2+ 浓度，有效控制突变的频率，成
功构建了突变体文库。针对突变体文库进行有效筛
选也是一项繁琐工作，是定向进化试验成功的关键，
本试验采用刚果红平板染色法，该方法不需要昂贵
的仪器设备，方法简单，易于操作，IPTG 用量及加
入方式，细菌培养时间、菌落密度等都是影响筛选
的因素。本试验为获得耐高温且具有较高酶活性的β-
葡聚糖酶，除参考文献外，先将原位膜转印所获得
的菌体通过裂解处理释放酶，后又将膜进行 80℃处
理 30 mim，使不耐热的酶完全失活，耐热的酶酶活
相对降低，一方面适宜筛选耐高温突变体，减轻后
续试验工作量，另一方面可消除假阳性的突变体。
试验选择表达载体为 pET32a（+），该载体上的
His-tag 为纯化标签，能与镍柱亲和层析，便于蛋白
纯化，同时 N 端还有一个 Trx-tag 融合标签，有利于
提高目的蛋白的可溶性表达。
4 结论
突变酶的最适温度为 70℃，比野生酶的最适温
度为 55℃有大幅度提高，具有较好的耐高温特性，
野生酶酶活力为 84.2 U/mL，突变酶酶活力分别为
247.3 U/mL 和 125.1 U/mL，是野生酶酶活的 2.9 倍和
1.5 倍，说明经过易错 PCR 技术定向进化改造后，β-
葡聚糖酶酶活力有了较大提高。