全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-12-05
作者简介 : 李丰硕 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 微生物发酵及其应用 ; E-mail: lifengshuo2009@163.com
通讯作者 : 薛永常 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 分子生物学 ; E-mail: xueych@dlpu.edu.cn
枯草芽孢杆菌 FM208849产果胶酶的固定化及
酶学性质研究
李丰硕1 张灿1 薛永常1 郑来久2
（1 大连工业大学生物工程学院，大连 116034; 2 大连工业大学纺织与材料工程学院，大连 116034）
摘 要： 为了提高游离果胶酶的稳定性，对罗布麻脱胶具有特异性的枯草芽孢杆菌（FM208849）进行产果胶酶发酵时，采
用交联酶聚集体（CLEAs）技术制备固定化果胶酶，并对交联果胶酶聚集体的制备条件、酶学性质进行研究。结果表明，游离果
胶酶经 80%饱和硫酸铵沉淀后，在 30℃，经 4%的戊二醛溶液交联 135 min，所形成的交联果胶酶聚集体的活回收率为 61.5%，其
最适反应温度 45℃和最适 pH10，在对交联果胶酶聚集体的热稳定性和有机溶剂稳定性分析中，均显示了比游离酶更高的稳定性。
关键词： 果胶酶 固定化 交联酶聚集体
Immobilized and Enzymatic Properties of Pectinase by
Bacillus subtilis FM208849
Li Fengshuo1 Zhang Can1 Xue Yongchang1 Zheng Laijiu2
（1School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034；2School of Textile and Materials Engineering，Dalian
Polytechnic University，Dalian 116034）
Abstract: For the degumming of apocynum specificity of Bacillus subtilis FM208849, the strain was used in the production of pectinase.
In order to improve the stability of pectinase, cross-linked enzyme aggregates （CLEAs） technic was used in preparing immobilized pectinase.
The condition of the preparation and the enzymatic properties of pectinase CLEAs were studied. The results showed that, after free pectinase
was precipitated with 80% saturated ammonium sulfate and cross-linked by 4%glutaraldehyde at 30℃ for 135 minutes, 61.5% of the activity
of pectinase CLEAs could be recovered. The optimum reaction temperature and pH were 45℃ and 10, respectively. The thermal stability and
organic solvents stability for pectinase CLEAs, were shown better than thoese of the free enzyme.
Key words: Pecttinase Immobilized CLEAs
天然来源的果胶酶广泛存在于动、植物和微生
物中，广泛应用在食品、纺织、医药、造纸、环境、
生物技术、饲料等领域［1］。果胶酶是世界四大酶制
剂之一，在全世界食品酶的销售额中约占到了 1/4。
但动植物来源的果胶酶产量低，难于大规模提取制
备，而微生物因其生长速度快、条件简单、代谢过
程特殊和分布广等特点而成为果胶酶的重要来源。
酶的固定化可分为有载体固定和无载体固定两类，
而载体固定使用的试剂和载体成本高昂、固定效率
偏低，真正投入工业化应用的固定化酶不多。当
今，酶应用领域缺少对温度、pH 和有机溶剂具有高
度耐受性的固定化酶，这对酶固定化提出了更高的
要求［2］。
交联酶聚集体（CLEAs）技术是一种用盐、有
机溶剂或非离子聚合物等沉淀剂沉淀酶蛋白，得到
酶聚集体，再用戊二醛交联的无载体固定化方法［3］。
该法制备过程简单、对酶蛋白的纯度要求不高、成
本低、稳定性好、酶活性保持率高，近年受到人们
关注，已成功用于青霉素 G 酰化酶、脲酶、β- 葡
萄糖苷酶、木聚糖酶、壳聚糖酶、氧化还原酶，以
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期142
及 7 种不同微生物来源的脂肪酶的固定化［4-7］，取
得了一定的进展。薛卫巍等［8］从罗布麻皮表面筛选
出筛选出 2 株优良的脱胶菌株 FM208849（Bacillus
subtilis，S-1）和 FM208850 （Acinetobacter junii，S-3）
并对 2 菌株的生长条件和果胶酶发酵条件进行了优
化，取得了良好的效果。本研究在此基础上对菌株S-1
进行产酶发酵后利用 CLEAs 技术制备了交联果胶酶
聚集体，并对其制备条件、酶学性质、耐热性、有
机溶剂耐受性几方面进行初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis FM208-
849，S-1）由辽宁省发酵工程重点实验室与纺织工
程重点实实验室分离保存。
1.1.2 试验药品 牛血清白蛋白 ：分析纯，Roche
公司；果胶、D-半乳糖醛酸：分析纯，Sigma 公司；3，5-
二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、戊二醛、乙醇、叔丁
醇等试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基 种子培养基 ：牛肉膏 3 g/L，蛋白胨
10 g/L，NaCl 5 g/L，pH7.0，1×105 Pa 灭 菌 20 min。
发酵培养基： 果胶 1 g/L，葡萄糖 3 g/L，牛肉膏 15 g/L，
NaCl 2 g/L，1×105 Pa 灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质含量及果胶酶活力的测定 Bradford
法［9］测定溶液中蛋白质含量，DNS 法［10］测定果胶
酶活力。为便于研究，以相对酶活力为考察对象，
即为在各自处理条件下的各酶活与其最大酶活的比
值 ；交联聚集酶的活力回收率为交联聚集酶活力与
交联聚集时所加游离酶总活力的比值。
果胶酶活力定义 ：每分钟转化果胶生成 1 μg 半
乳糖醛酸所需的酶量为一个活力单位，用 U 表示。
蛋白沉降率（%）=（聚集体重溶后蛋白含量 / 样
品溶液蛋白含量）×100%。
1.2.2 游离果胶酶的制备 菌株 S-1 经种子培养基
过夜培养后，接种于发酵培养基中培养 24 h，所得
酶液经离心、硫酸铵沉淀、透析袋透析等初步纯化，
去除菌体等杂质，将其溶解于 Na2CO3-NaHCO3 缓冲
溶液（37℃、pH9.5、 0.2 mol/L）中酶活为 125.6 U/mL，
置于 4℃冰箱保存备用。
1.2.3 果胶酶聚集体的制备 取一定浓度的果胶酶
溶液 10 mL 置于冰水浴中，缓慢滴加沉淀剂，边滴
加边搅拌，每 15 min 取样 10 000 r/min 离心 5 min，
测定上清液中蛋白的含量，直至溶液中约 95% 的果
胶酶被沉淀下来时停止滴加。再将其溶解于 10 mL
的 Na2CO3-NaHCO3 缓冲溶液中，测定酶聚集体活力，
测定方法与游离酶相同，确定其聚集条件。
中性盐、水溶性有机溶剂及高分子化合物等均
可使蛋白质发生沉淀，但这些沉淀剂也会不同程度
地破坏蛋白酶分子，使酶发生失活［11］。分别使用
90% 叔丁醇等 9 种沉淀剂对果胶酶进行聚集，通过
对比聚集体重溶后的相对酶活和蛋白质沉淀率筛选
则最佳的沉淀剂。
考虑到初始果胶酶浓度可能对聚集体的效果有
影响［12］，对所取得的酶液进行 0、2、4、6、8、10
稀释，分别取稀释后的酶液 10 mL，在冰水浴的条
件下，分别向其中加入 80% 饱和硫酸铵溶液 25 mL，
待沉淀 45 min，10 000 r/min 离心 10 min，将聚集体
重溶后测其相对酶活，确定最佳的果胶酶浓度。
1.2.4 交联果胶酶聚集体的制备 在一定的温度下，
取适当浓度的果胶酶聚集体溶液 10 mL，向其中缓
慢滴加一定浓度（体积浓度，V/V）的戊二醛溶液
10 mL，边滴加边缓慢搅拌，交联 3 h，10 000 r/min
离心 10 min，弃上清液，沉底经 Na2CO3-NaHCO3 缓
冲溶液洗涤 2 次，得到交联果胶酶聚集体，测定酶
活力，确定其交联条件。
2 结果
2.1 果胶酶聚集体条件的确定
2.1.1 沉淀剂的选择 沉淀剂的选择结果如表 1 所
示。由表 1 可以看出 90% 叔丁醇和 80% 硫酸铵的聚
集效果较好，90% 乙醇、50% 聚乙二醇 6 000 对酶
蛋白的沉淀率也比较高，但是很难检测出其处理后
的酶聚集体酶活。而且试验过程中发现随着聚乙二
醇分子量的升高其处理后的溶液黏度显著增高，这
为后期交联、回收增加了困难，由于硫酸铵的价格
比较低廉所以本试验选取 80% 硫酸铵为沉淀剂。
2.1.2 游离果胶酶浓度的确定 果胶酶浓度的确定
结果如表 2 所示，可以看出当稀释倍数达到 4 时，
聚集体的相对酶活达到最大，因此后续试验选用初
2012年第6期 143李丰硕等 ：枯草芽孢杆菌 FM208849 产果胶酶的固定化及酶学性质研究
始浓度为 31.4 U/mL 的酶液制备聚集体。
2.2 交联果胶酶聚集体条件的确定
交联剂戊二醛溶液浓度的选取 戊二醛是最常
用的一种交联剂，本试验选取浓度 0.5%-8% 的戊
二醛溶液各 10 mL，添加到在最佳条件下所制备的
10 mL 的果胶酶聚集体中，在冰水浴条件下缓缓搅
拌，交联 120 min 测其酶活。
由图 1 所示，当戊二醛浓度较低时，酶聚集体
相对酶活较低，是由于其不能充分交联，部分聚集
体出现溶解现象导致 ；当浓度达到 4% 时相对酶活
达到最大值 ；由于高浓度的戊二醛溶液能使蛋白质
变性，随着其浓度的再次升高聚集体酶活迅速下降，
因此在试验过程中既要考虑到对其酶活损失小，又
要保证其交联充分，选取戊二醛溶液浓度为 4% 较
为合适。这里本试验主要讨论戊二醛浓度的选取，
在后续的系列试验以统计出其最佳交联温度 30℃、
最佳交联时间 135 min。
2.3 交联果胶酶聚集体酶学性质分析
2.3.1 果胶酶聚集体交联前后的形态学变化 在光
学显微镜下可以看到游离果胶酶，经硫酸铵沉淀后
所形成的聚集体是果胶酶单体的多聚形式，形状不
规则，结构松散的较小颗粒，如图 2 所示 ；再经戊
二醛交联后，结构变紧密，颗粒较大，如图 3 所示。
2.3.2 最适反应温度 分别测定游离果胶酶和交
联果胶酶聚集体在不同温度下的活性，结果如图 4
表 1 沉淀剂对果胶酶聚集体制备的影响
沉淀剂种类 沉淀剂加入量 （mL） 蛋白沉淀率 （%） 聚集体酶活 （U/mL） 相对酶活 （%）
原酶液 — 100 125.65 100
90% 叔丁醇 23.8 92.8 63.14 50.2
90% 乙醇 20.5 89.6 46.13 36.7
70% 硫酸铵 30.2 75.4 55.56 44.2
80% 硫酸铵 25.0 92.4 68.62 54.6
60% 聚乙二醇 2000 35.8 66.3 40.93 32.6
60% 聚乙二醇 4000 30.3 80.3 38.78 30.8
50% 聚乙二醇 6000 28.4 87.6 — —
40% 丙酮 40.5 85.3 56.02 44.6
90% 异戊醇 25.2 83.6 — —
表 2 游离果胶酶液浓度对聚集体制备的影响
酶液稀释倍数 聚集体酶活（U/mL） 相对酶活（%）
0 56.77 45.2
2 31.73 50.5
4 17.81 56.7
6 10.81 51.6
8 6.68 42.5
10 4.56 36.3
图 1 戊二醛浓度对交联果胶酶聚集体酶活力的影响 图 2 果胶酶聚集体（×40）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期144
所示。CLEAs 最适作用温度略高于游离酶，而且
CLEAs 的较适的作用温度范围曲线，比游离酶的变
化较为平缓，其最适反应温度范围相对较宽。
迅速冷却至 20℃，测定其活性，以剩余果胶酶活
力对应其最大值为参考，以下同理。结果如图 6 所
示。在低于 50℃时，两者酶活力都有少量损失，但
幅度很小，当温度高于 50℃时，游离果胶酶酶活损
失明显，而 CLEAs 变化幅度较为缓慢，二者在相同
的温度下，CLEAs 热稳定性均表现出高于游离酶。
在 60℃处理 60 min 后，游离酶酶活仅存 32.6%，
而 CLEAs 仍保留 76.8% 的酶活。但是，温度过高
CLEAs 的活性开始明显的下降，故其不适合在高温
下连续反应，而应控制反应在稍低的温度下进行。图 3 交联果胶酶聚集体（×40）
图 4 交联果胶酶聚集体和游离果胶酶的最适反应温度
2.3.3 最适反应 pH 在最适参数条件下，分别测
定游离果胶酶和 CLEAs 在不同 pH 体系下的活性，
结果如图 5 所示。可以看出游离酶的最适 pH 约为
9.5，而 CLEAs 的最适 pH 约为 10.0，较游离酶向碱
性偏移了 0.5 个单位。这是由于在交联过程中戊二
醛分子上的羧基与酶分子上的氨基反应生成 -C=N-
基团，此基团的氮原子存在孤对电子，可吸引溶液
中的阳离 H+ 而形成氢键，大量 H+ 附着于 CLEAs 表
面，形成一个致密的 H+ 边界层。边界层中 H+ 浓度
高于外部溶液，呈酸性，这样外部溶液中的 pH 必
须向碱性偏移才能中和边界层中的酸性作用，以至
于CLEAs的最适pH增大，其表现出了更强的耐碱性，
这有利于其在高 pH 环境下的应用。
2.3.4 热稳定性 分别取游离果胶酶和 CLEAs，在
各自最适 pH 条件下，置于不同的温度 60 min 后，
图 6 交联果胶酶聚集体和游离果胶酶的热稳定性
图 5 交联果胶酶聚集体和游离果胶酶的最适反应 pH
2.3.5 有机溶剂中活性比较 在 30℃条件下，将游
离果胶酶和 CLEAs 分别置于无水乙醇中，每隔 30
min 测定其剩余酶活，结果如图 7 所示。试验过程
中发现游离酶在无水乙醇中出现沉淀，将沉淀再次
溶于等量的 Na2CO3-NaHCO3 缓冲溶液中测其酶活，
将其与无水乙醇中游离酶的活力总和，作为游离果
胶酶的剩余酶活力。由图 7 可以看出，随着时间的
增长，两者酶活都有损失，而游离酶的损失更大，
下降的更快。这说明游离酶在有机溶剂中易变性酶
2012年第6期 145李丰硕等 ：枯草芽孢杆菌 FM208849 产果胶酶的固定化及酶学性质研究
活力易损失，而 CLEAs 可以克服这一缺点，提高酶
在有机溶剂中的稳定性。
能是由于溶液中戊二醛可形成长度和结构不同的寡
聚体的混合物，其醛基可以与果胶酶分子的氨基间
形成席夫碱，这种共价键形式的结构保证了 CLEAs
抗机械强度的稳定性。在试验过程中发现 CLEAs
使用超过 5 次后，其酶活力开始出现下降，同时
CLEAs 的“集簇”状结构也变得较为松散。如何保
证 CLEAs 在使用多次后还能保持很高的酶活力，提
高其机械强度，这是进一步研究交联酶聚集体技术
的一个方向。
4 结论
（1） 以 80% 饱和硫酸铵为沉淀剂，4%（体积
浓度，V/V）戊二醛作为交联剂，在 30℃下交联
135 min，可以制备出性能优异的交联果胶酶聚集体。
（2）CLEAs 的最适反应温度范围较游离酶
（40℃）得到了提升，可以达到 35-50℃；同时 CLEAs
的最适反应 pH10.0 较游离果胶酶 pH9.0 向右偏移了
0.5 个单位，并且在 pH9.0-11.0 范围内 CLEAs 都变
现出了良好的活性，这有利于果胶酶在强碱的环境
体系下的应用。
（3） 果胶酶 CLEAs 在热稳定性、有机溶剂耐受
性都比游离果胶酶有了明显的改善，说明其在提高
果胶酶稳定性上能发挥重要的作用。
参 考 文 献
［1］ 李祖明 , 何立千 , 李鸿玉 , 等 . 碱性果胶酶的应用进展 . 食品科
技 , 2007, 8: 1-4.
［2］ Kashyap DR, Vohra K, Chopra S. Applications of pectinase in the
commercial sector: a review. Bioresource Technology, 2001, 77:
215-227.
［3］ 武仙山 , 何立千 , 叶磊 . 交联酶聚集体—种无载体酶固定化方
法 . 生物技术 , 2005, 15（2）: 91-92.
［4］ Wilso L, Betancor L, Fernandez-Lorente G. Cross-linked aggregates
of multimeric enzymes: a simple and efficient methodology to
stabilize their quaternary strueture. Biomacromolecules, 2004, 5（3）:
814-817.
［5］ Schoevaat R, Wolbers MW, Golubovic M. Preparation optimization
and structures of cross-linked enzyme aggregates（CLEAs）.
Biotechnology and Bioengineering, 2004, 87（6）: 754-762.
［6］ 罗建平 , 欧杰 , 潘利华 . 交联 β- 葡萄糖苷酶聚集体的制备及其
图 7 交联果胶酶聚集体和游离果胶酶的有机溶剂稳定性
3 讨论
近年来，交联酶聚集体技术在酶固定化方面取
得了一定进展，其是一种简单有效的无载体酶固定
化方法。其制备工艺条件简单，沉淀和交联发生在
一个反应体系中，产生不溶于水的固定化酶。Gupta
等［13］使用 CLEAs 技术分别对果胶酶、木聚糖酶和
纤维素酶进行了酶固定化，再对固定后的交联酶聚
集体性质分析中，发现其体系 Km 和酶活半衰期等
都得到了提高，固定化后的 CLEAs 可重复利用 3 次
而酶活无损失 ；Cao 等［14］选用 3 种沉淀剂，如硫酸
铵、叔丁醇、非离子多聚体 PEG 沉淀青霉素 G 酰化
酶，而后通过戊二醛进行交联，结果发现在沉淀剂
浓度分别为硫酸铵30%、叔丁醇20%和PEG 20%时，
CLEAs 的活力几乎达到原溶液酶活的 100%。
本试验在对交联果胶酶聚集体的酶学性质的分
析中发现，其最适反应温度稍高于游离酶，通常固
定化后酶的最适催化温度较游离态酶将向高温［15］
平移，本试验结果与其较为相符。同时，CLEAs 的
pH 最适作用范围较游离酶也有小幅度增大，这与
Dalal 等［16］运用 CLEAs 方法固定后果胶酶的聚集体
pH 变化相一致。在光学显微镜下的形态结构的研究
中发现，CLEAs 以“集簇”状结构的形式分散于体
系中，这与董晓毅等［17］和王梦凡等［18］制备的交联
脲酶聚集体、交联木瓜蛋白酶聚集体的存在形式较
为类似，这种结构的机械强度不高，在剧烈的机械
搅拌下可以打散这种大“集簇”，形成小“簇”单
体，但是被打散后 CLEAs 还保持较高的活性。这可
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期146
性质 . 食品科学 , 2007, 28（12）: 254-257.
［7］ Cao LQ, van Rantwijk F, Roger A. Cross-linked enzyme aggregates:
A simple and effective method for the immobilization of penicillin
acylase. Org Lett, 2000, 2（10）: 1361-1364.
［8］ 薛卫巍 , 薛永常 , 翟秋梅 , 等 . 适于罗布麻生物脱胶的果胶酶产
生菌分离筛选与表征 . 工业微生物 , 2009, 39（2）: 55-58.
［9］ 袁道强 , 黄建华 . 生物化学实验和技术［M］. 北京 : 中国轻工
业出版社 , 2005: 184-185.
［10］ 张飞 , 岳田利 , 费坚 , 等 . 果胶酶活力的测定方法研究 . 西北
农业学报 , 2004, 13（4）: 134-137.
［11］ Figueiredo K, Ferraz H, Borges C, et al. Structural stability of
myoglobin in organic media. Chemistry and Materials Science, 2009,
28（5）: 224-232.
［12］ Mateo C, Palomo JM, Van Langen LM, et al. A new, mild cross-
linking methodology to prepare cross-linked enzyme aggregates.
Biotechnology and Bioengineering, 2004, 86（3）: 273-276.
［13］ Gupta MN, Raqhava S. Enzyme stabilization via cross-linked
enzyme aggregates. Methods in Molecular Biology, 2011, 679:
133-145.
［14］ Cao LQ, van Langen LM, van Rantwijk F, et al. Cross-linked
aggregates of penicillin acylase: robust catalysts for the synthesis of
β-lactam antibiotics. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,
2001, 11: 665-670.
［15］ Arica MY, Yavuz H, Patir S, et al. Immobilization of glucoamylase
onto spacerarm attached magnetic poly（methylmethacrylate） mic-
rospheres: characterization and application to a continuous flow rea-
ctor. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2000, 11（2/3）:
127-138.
［16］ Dalal S, Sharma A, Gupta MN. A multipurpose immobilized bioca-
talyst with pectinase, xylanase and cellulase activities. Chemistry
Central Journal, 2007, 1（16）: 1-5.
［17］ 董晓毅 , 夏仕文 . 交联尿酶聚集体的制备和初步应用 . 生物工
程学报 , 2003, 19（3）: 332-336.
［18］ 王梦凡 , 齐崴 , 苏荣欣 , 等 . 木瓜蛋白酶交联聚体的制备及性
质 . 高等学校化学学报 , 2010, 31（9）: 1774-1779.
（责任编辑 李楠）