全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
荧光定量 RT-PCR（real-time quantitative reverse
transcriptase polymerase chain reaction，qRT-PCR）是
一种在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信
收稿日期 : 2012-04-14
基金项目 : 国家重大专项高产转基因肉牛新品种培育项目（2011ZX08007-002）
作者简介 : 王子东 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 动物学 ; E-mail: wang_zidong@yahoo.com
通讯作者 : 李光鹏 , 男 , 教授 , 研究方向 : 动物学 ; E-mail: guangpengli@yahoo.com
苏建国 , 男 , 教授 , 研究方向 : 动物生物技术 ; E-mail: su.jianguo@gmail.com
牛转 FAD3B 基因胎儿成纤维细胞中内参基因的
稳定性评估
王子东1  苏建国2  段彪1  杨春荣2  高广琦1  康峰1  张荣芳2   
胡晓明1  扈廷茂1  李光鹏1
（1 内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室，呼和浩特 010021 ；
2 西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100）
摘 要 ： 采用 RT-PCR 扩增亚麻种子（Linum usitatissimum Linn）FAD3B 基因，构建不同启动子的两种重组真核表达载
体 pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B 和 pIRES-AcGFP-CAG-FAD3B，通过 qRT-PCR 检测转基因细胞中 FAD3B 基因的表达水平。以不同
过表达水平的转基因细胞为试验对象，评价 9 种候选内参基因 ACTB、GAPDH、18S rRNA、UXT、PPP1R11、RPS15A、SF3A1、
EEF1A2 和 HMBS 的稳定性。根据 GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper 3 种统计学算法得到的稳定性值对基因进行排序。结果显
示，内参基因稳定性的综合排序为 PPP1R11>EEF1A2>18S rRNA>RPS15A>GAPDH>HMBS>UXT>ACTB>SF3A1，其中 PPP1R11 和
EEF1A2 是最稳定的内参基因。稳定内参的选择可以更加准确地校正基因的表达水平，从而为阐述基因的功能奠定了坚实的基础。
关键词 ： 实时荧光定量 RT-PCR 转基因细胞 内参基因 GeNorm NormFinder Bestkeeper
Evaluations of Reference Genes in Bovine Transfected FAD3B Gene
Fetal Fibroblasts
Wang Zidong1 Su Jianguo2 Duan Biao1 Yang Chunrong2 Gao Guangqi1 Kang Feng1
Zhang Rongfang2 Hu Xiaoming1 Hu Tingmao1 Li Guangpeng1
（1The Key Laboratory for Mammalian Reproductive Biology and Biotechnology of Ministry of Education of P.R.China，Inner Mongolia
University，Hohht 010021 ；2College of Animal Science and Technology，Northwest A&F University，Yangling 712100）
Abstract:  The FAD3B was cloned from the seed of flax（Linum usitatissimum Linn）using RT-PCR. The gene was constructed as
the recombinant eukaryotic expression vectors pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B and pIRES-AcGFP-CAG-FAD3B with different promoters. The
expression level of FAD3B was detected by qRT-PCR in transfected cells. Different over-expression levels of transfected cells were used as the
experimental subjects. Nine candidate reference genes were evaluated, including ACTB, GAPDH, 18S rRNA, UXT, PPP1R11, RPS15A, SF3A1,
EEF1A2 and HMBS. Three statistical algorithms（geNorm, NormFinder and BestKeeper）were used to rank genes by their stability values. The
overall rank ordering of candidate internal control genes was PPP1R11>EEF1A2>18S rRNA>RPS15A>GAPDH>HMBS>UXT>ACTB>SF3A1,
PPP1R11 and EEF1A2 can be considered as the most stable reference genes. Selection of stable control genes can normalize the expression level
of gene, laid a solid foundation so as to elaborate the function of genes.
Key words:  qRT-PCR Transfected cells Reference gene GeNorm NormFinder Bestkeeper
号积累监测整个 PCR 进程，确定基因表达转录水平
的方法，是一个高度敏感的检测体系。它分为绝对
定量和相对定量，相对定量需要选择表达稳定的内
2012年第11期 119王子东等 ：牛转 FAD3B 基因胎儿成纤维细胞中内参基因的稳定性评估
参基因，才能准确分析基因的表达差异［1］。
内参基因通常是各种看家基因，是保持细胞一
般生命活动的基因。稳定的内参基因在不同类型的
组织和细胞中，其表达量无显著性差别。由于试验
材料、处理方法，以及研究者各自试验系统不同，
没有一种适用于所有情况的内参基因可以作为稳定
表达的内参基因［2］。
尽管如此，还是有 3 种基因经常作为内参基因
使用，它们是 ACTB、GAPDH 和 18S rRNA 3 种管家
基因，大多数研究直接选择其中的一种基因作为内
参基因［3］。有研究表明，这 3 种内参基因在某些试
验系统中表达稳定性较低［4］，这样的选择会导致试
验结果出现相当大的误差［5］，甚至相反的结论［6］。
有研究表明 ACTB 表达量在某些不同的试验处理中
有上百倍的差距［7］。GAPDH 的表达量会随能量的
需求而改变［8］。在很多情况下，18S rRNA 也不适合
作为内参基因［9，10］，其合成调控独立于 mRNA，不
能代表 mRNA 的表达水平［11］，所以使用错误的内
参基因进行校正的定量结果也是错误的［12，13］。
在转基因研究中，为了检测转基因后基因调
控网络中不同基因表达水平的变化，选择合适的内
参基因是很有必要的。ω-3 多不饱和脂肪酸（ω-3
polyunsaturated fatty acids，PUFA）是组成人体必需
的物质，对健康非常重要，ω-6 与 ω-3 PUFA 比值过
高可导致心血管疾病、癌症、炎症以及自身免疫反
应等疑难病。但由于哺乳动物体内缺乏 ω-3 脂肪酸
去饱和酶，自身不能催化合成 ω-3 PUFA，通过转基
因技术，将动物或植物的脂肪酸去饱和酶基因转入
哺乳动物体内，成为合成 ω-3 PUFA 的有效研究方
向之一。
很 多 研 究 报 道 了 利 用 线 虫（Caenorhabditis
elegans）fat-1 基因制作的转基因小鼠［14］和猪［15， 16］，
另一类线虫（C. briggsae）fat-1 基因制作的转基因小
鼠［17］，以及猩红麻（L. grandiflorum）hFAD3 基 因
制备的转基因牛肌肉卫星细胞经过酯化后［18］，其 ω-6
与 ω-3 PUFA 比值会显著降低。我们使用将含有亚
麻（L. usitatissimum）FAD3B 基因的 2 种过表达载体
转入牛细胞后，研究牛转基因细胞中内参基因的稳
定性，旨在为转基因牛的研制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
亚麻种子采自呼市农科院。M-MVL Reverse Tra-
nscriptase 购 自 Promega。RNAiso plus、RNAiso-mate
for Plant Tissue、MiniBEST Plasmid Purification Kit、
PrimeScriptTM RT-PCR 试剂盒、DNase I，DL2000 DNA
Marker、pMD19-T Simple Vector，SYBR® Premix Ex
TaqTM II 购 自 TaKaRa。TIANgel Midi Purification Kit
购 自 Tiangen。 真 核 表 达 载 体 pIRES-AcGFP-CMV、
pCAGEN、DH5α 感受态大肠杆菌均为实验室保存。
限制性内切酶 Afl II、ApaL I、BamH I、Bgl II、Cpo I、
EcoR I、Nhe I、Not I、Sac I、Sal I、Xmal I、DNA 聚
合酶购自 Fermentas。用于细胞培养和转染的 DMEM
（高糖培养基，Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）
和 G418 购自 Gibco。胰蛋白酶购自 Sigma。FBS（胎
牛血清，Fetal Bovine Serum）和 DPBS（杜氏磷酸缓冲
液，DULBECCO’S PHOSPHATE Buffered Saline） 购
自 Hyclone。Lipofectamine LTX and PLUS Reagents 和
TRIZOL 购自 Invitrogen。用于定量试验的八连管和
枪头购自 Axygen。引物由南京金斯瑞生物公司合成。
基因测序由 Invitrogen 和南京金斯瑞生物公司完成。
1.2 方法
1.2.1 克隆 FAD3B 基因以及构建不同启动子的表达
载体 采集 7 月的未成熟亚麻种子，液氮速冻后，
-80℃保存。使用 RNAiso plus 配合 RNAiso-mate for
Plant Tissue 提取未成熟亚麻种子的总 RNA。M-MLV
Reverse Transcriptase 反转录合成 cDNA，用引物 F1
和 R1（表 1）进行 PCR 扩增 FAD3B 基因（登录号
DQ116425），扩增片段 1 244 bp，使用 TIANgel Midi
Purification Kit 回收，连接到 pMD19-T Simple Vector
上，转化 DH5α 感受态大肠杆菌，涂布于 LB 平板
37℃过夜培养，挑单克隆菌落，PCR 检测 4 个阳性
菌落进行测序。选择正确的序列，亚克隆入 pIRES-
AcGFP-CMV 空载体的 EcoR I 和 Xma I 酶切位点之间，
得到 pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B 表达载体。
pCAGEN 载体上的 CAG 启动子两边有 Sal I 和
EcoR I 两个位点，通过 PCR 扩增获得一个上游加入
Sac I、Sal I，下游加入 Sac II、EcoR I 酶切位点的
T 片段（引物 ：F2-R2，表 1）。将 pIRES2-AcGFP1-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期120
CMV 载体中的多克隆位点改造成为 Sal I 和 EcoR I
两个酶切位点，然后插入 CAG 启动子。选择 CMV
上 游 的 pUC 元 件 中 的 ApaL I 位 点， 及 CMV 后 边
Nhe I 位点，通过补齐 pUC 后半部分（引物 ：F3-R3，
表 1）的方法切掉 CMV 启动子。扩增 pCAGEN 载
体上 Rabbit globin polyA（引物 ：F4-R4，表 1），经
Not I 和 Afl II 共酶切替换 SV40-polyA，最后用 EcoR
I 和 BamH I 将 FAD3B 基因从 pIRES2-AcGFP1-CMV-
FAD3B 载 体 中 切 下 来 连 入 载 体 中， 得 到 pIRES-
AcGFP-CAG-FAD3B 表达载体。
对 pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B 和 pIRES-AcGFP-
CAG-FAD3B 两个载体进行 PCR 和酶切鉴定。PCR
检测使用两对引物（图 1），分别检测 FAD3B 基因
（F5-R5，表 1），以及启动子到 poly A 整个载体的表
达 盒（CMV-SV40 polyA ：F6-R6 ；CAG-Rabbit globin
polyA ：F7-R7， 表 1）。 酶 切 鉴 定 选 择 3 个 酶 切 位
点，包括 FAD3B 基因两边的 EcoR I 和 BamH I 位点，
poly A 后的 Afl II 位点。进行 EcoR I-BamH I 和 EcoR
I-Afl II 两种共酶切鉴定（图 1）。
1.2.2 制备转基因细胞以及 RT-PCR 合成 cDNA 使
用MiniBEST Plasmid Purification Kit提取pIRES-AcGF-
P-CAG、pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B 和 pIRES-AcGFP-
表 1 FAD3B 基因克隆、载体构建与检测引物
基因 编号 引物序列（5-3） 片段长度（bp） 引物功能
FAD3B F1 gaattcAAAACTGTGGCTCTGCAG 1244 克隆基因
R1 cccgggCAGCCTGCATATATCAGAGC
T 片段 F2 gagctcAATCGgtcgacTATCCGCCTCCATCCAGTCT 666 载体构建
R2 ccgcggAATCGgaattcTTCCGTGTCGCCCTTATTCC
pUC F3 gtgcacACAGCCCAGCTTGGAGCG 379 载体构建
R3 gctagcATGCATGGCGGTAATACGG
Rabbit globin polyA F4 gcggccgcACTCCTCAGGTGCAGGCT 549 载体构建
R4 cttaagCTGCAGGTCGAGGGATCT
Part of FAD3B F5 CAGTCTTTGTTCTTGGA 665 载体检测
R5 ATAGTGTGGCATTTGAG
CMV-SV40 polyA F6 ATGTCGTAACAACTCCG 3079 载体检测
R6 GAACAACACTCAACCCT
CAG-Rabbit globin polyA F7 CCCCTTCTCCATCTCCA 3430 载体检测
R7 CCCTATCTCGGTCTATT
小写字母表示酶切位点
图 1 载体 PCR 与酶切鉴定
AcGFP1IRESFAD3BCMV
F6 F5
R5 R6
SV40 polyA
Rabbit globin polyA
F7 F5
R5
EcoR I BamH I Afl II
EcoR I BamH I Afl II
R7
CAG FAD3B IRES AcGFP1
CAG-FAD3B 三种质粒用于转染。将原代牛胎儿成纤
维细胞解冻后，使用完全培养液 DMEM 加 10% FBS
培养在 10 cm2 培养皿中。待长满后，每 1.5×105 个
细胞传入 6 孔板中的一个孔中，孵育过夜，待细胞
汇合度达到 80%，使用 Lipofectamine LTX And PLUS
Reagents 脂质体转染试剂转染细胞。转染后 48 h 更
换 800 ng/μL G418 的培养液，培养 8 d 左右，形成
绿色荧光抗性集落细胞群，期间每隔 2-3 d 换一
次培养液。得到 pIRES-AcGFP-CAG（ 阴性对照）、
pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B 和 pIRES-AcGFP-CAG-
FAD3B 转基因细胞。
TRIZOL 试剂提取未转基因的细胞和 3 种转基因
细胞的总RNA，DNase I去除基因组污染。总RNA进行
凝胶电泳检测完整性，使用分光光度计检测 RNA 的
浓度。依据 PrimeScriptTM RT-PCR 试剂盒说明书，使
用随机引物将每 1 μg RNA 反转录合成 cDNA。使用
2012年第11期 121王子东等 ：牛转 FAD3B 基因胎儿成纤维细胞中内参基因的稳定性评估
牛（Bos taurus）ACTB 内参基因引物（5-TCCGCAA-
GGACCTCTAC-3 和 5-CTTCACCGTTCCAGTTTT-3，
登录号 AY141970.1）检测 cDNA 的可靠性。引物 F1
和 R1 检测转基因细胞中 FAD3B 基因的表达。
1.2.3 内参基因的选择与定量引物设计 9 种内参基
因进行检测，ACTB、GAPDH、18S rRNA 是 3 种常用
的 内 参 基 因，UXT（ubiquitously expressed transcript
isoform 2）［19］，PPP1R11［protein phosphatase 1 regul-
atory（inhibitor）subunit 11］和 RPS15A（ribosomal p-
rotein S15a）［20］在牛乳腺中表达比较稳定，SF3A1
（splicing factor 3 subunit 1）、EEF1A2（eukaryotic tra-
nslation elongation factor 1 alpha 2）、HMBS（hydroxym-
ethylbilane synthase）［21］在牛肌肉组织中表达最稳定。
在 GenBank 中检索基因序列信息，使用 Primer
Premier 5 软件设计定量引物，要求 Tm 在 58-60℃
之间，扩增片段在 90-250 bp 之间。通过 NCBI 中
Primer BLAST 工具检查引物是否可能扩增出除了目
标基因之外的其他基因。预 PCR 检测定量引物是否
扩增出单一条带，确定特异性的定量引物。定量引
物合成于南京金斯瑞生物公司，引物信息见表 2。
表 2 定量基因的引物序列信息
基因 引物序列（5-3） 片段长度（bp） 序列号
ACTB CTGTTAGCTGCGTTACACCCTT TGCTGTCACCTTCACCGTTC 165 AY141970.1
GAPDH GGTCACCAGGGCTGCTTTT GACTGTGCCGTTGAACTTGC 130 NM_001034034.1
18S rRNA TTCGATGGTAGTCGCTGTGC TTGGATGTGGTAGCCGTTTCT 99 NR_036642
UXT CAGGTGGATTTGGGCTGTAA TCCTTGGTGAGGTTGTCGC 173 NM_001037471.1
PPP1R11 CAGAAAAGACAGAAGGGTGCC CGTTTCCGAAGTTTGATGGTTA 167 NM_001100295.1
RPS15A AACCTCACAGGCAGGCTAAAT ATGAAACCAAACTGACGGGAT 116 NM_001037443.1
SF3A1 GTGGTGGTGGAAACAGTGGA CCCCAAACTTCTCGTAGCG 118 XM_878187.1
EEF1A2 GCGTGAAGCAGCTCATCGT TTTCCAGCCCTTGAACCAG 215 BC108110.1
HMBS TGAACAAAGGAGCCAAGAACA AGCAGAGGGCTGGGATGTAG 124 BC112573.1
FAD3B GTTGATCGAGATTACGGGGTC TGATAGTGTGGCATTTGAGGG 92 DQ116425
1.2.4 定量引物的扩增效率和特异性 以 10 倍的倍
比梯度稀释得到梯度模板，内参基因的模板为 3-4
个 10 倍梯度稀释的 cDNA（1 μg-1 ng）。FAD3B 基
因以 pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B 表达载体作为质粒
标准品（碱基数为 6 518 bp），标准品拷贝数的稀释
梯度依次为 107、106、105 和 104。用这些浓度梯度
的模板进行 qRT-PCR，每组 2 个重复，设阴性和空白
对照组。利用7000 System SDS Software 绘制标准曲线，
分析定量引物的扩增效率和特异性。
1.2.5 SYBR 荧光实时定量 PCR 定量 PCR 设备是
PRISM 7300 Real-Time PCR System（ABI），每个单独
的 qPCR 混合液体系 ：cDNA 样品 100 ng，2×SYBR
Green PCR master mix 10 μL，每个特异性引物（10
μmol/L）0.8 μL 以 及 ROX Reference Dye（50×）0.4
μL，灭菌水补充至 20 μL。PCR 反应程序为：95℃ 30 s；
95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 个循环 ；95℃ 15 s，60℃ 30
s，95℃ 15 s ；在 60-95℃之间，每增加 0.5℃读一次
板。设置 4 个平行的样本，每组试验重复 3 次。阈
值手动调节，试验数据以 Excel 形式输出。
1.2.6 数据分析 利用平均 CT 值得到标准曲线线性
方程，将 CT 值代入线性方程，计算得到 FAD3B 基
因的 mRNA 拷贝数。用 GeNorm（version 3.5）、Nor-
mFinder［22］（version 0953）和 BestKeeper［23］（version
1）3 种统计学算法评价这 9 种候选内参基因的稳定
性。GeNorm 将每个内参基因的 CT 值列为一列，找
到每个基因中最小的 CT 值，通过 2-ΔCT 方法计算出
每个基因中其他数据的相对表达量，通过运算这些
相对表达量的数据，得到代表基因间表达量比值的
对数转换值的平均变异度 M 值。程序先根据 9 个内
参基因的数据，计算得到各个基因的 M 值 ；然后去
除上一步得到的 M 值最大的内参基因，对剩下的 8
个基因进行第二次分析 ；以此类推重复的计算，最
后得到两种 M 值最小的内参基因，并且依据 M 值
对基因的稳定性进行排序。NormFinder 程序不同于
GeNorm，它可以综合计算内参基因在同一组内和不
同组间表达的稳定性，产生每种基因的稳定性值，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期122
筛选最佳的内参基因。BestKeeper 程序将所有内参
基因循环阈值的几何平均数作为索引，生成各基因
与索引之间的相关系数，筛选最稳定的内参基因。
每种算法的稳定性排序后，分别由稳定到不稳定计
分，最稳定的计 1 分、次之 2 分、依次类推。综合
排序是将每个基因的这 3 种排序所得分数相加，根
据分数排序，分数最低的最稳定。
2.2 转基因细胞与cDNA检测
转基因细胞在荧光激发下可以观察到绿色荧
光（图 3）。RNA 电泳后有清晰的 28S 和 18S 亚基条
带，5S 亚基条带较模糊，但仍可见（图 4）。RNA
样品的 OD260/OD280 值在 2.0 左右，浓度大约为 300
ng/μL。cDNA 经过内参基因和 FAD3B 基因检测得到
预期大小的条带（图 4）。
a: M. DL10000 DNA Marker，c. 以水为模板，1. 检测 FAD3B 基因，2. 检测启动子到 poly A 表达盒 ； b: M. DL10000 DNA Marker，3. 空质粒，4. FAD3B
质粒，5. 空质粒 EcoR I 单酶切，6. FAD3B 质粒 EcoR I 单酶切，7. FAD3B 质粒 EcoR I、BamH I 双酶切，8. FAD3B 质粒 EcoR I、Afl II 双酶切
图 2 pIRES-AcGFP-CMV-FAD 和 pIRES-AcGFP-CAG-FAD 表达载体的 PCR 检测（a）及酶切鉴定（b）
665 3430
665 3079
7000
bp
4000
2000
1000
500
M c 1 2
a
M 3 4 5 6 7 8
5307 6518 1242 2795
5276 3723
6727 7947 1242 3098
6705 4849
pIRES-AcGFP-
CMV-FAD3b
pIRES-AcGFP-
CMV-FAD3b
b
ਟ㿱
ݹ
㔯㢢
㦗ݹ
1 2 3 4
1. 非转基因细胞（空白对照）；2. pIRES-AcGFP-CAG 转基因细胞
（阴性对照）；3. pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B 转基因细胞 ；4. pIRES-
AcGFP-CAG-FAD3B 转基因
图 3 转基因细胞中表达绿色荧光蛋白（200×）
M. DL2000 ；c. 以 水 为 模 板 PCR ；1. 非 转 基 因 细 胞（ 空 白 对 照 ）；2.
pIRES-AcGFP-CAG 转 基 因 细 胞（ 阴 性 对 照 ）；3. pIRES-AcGFP-CMV-
FAD3B 转基因细胞 ；4. pIRES-AcGFP-CAG-FAD3B 转基因
图 4 转基因细胞 RNA、RT-PCR 检测 ACTB（425 bp）及
RT-PCR 检测 FAD3B（1244 bp）
ACTB
RNA
FAD3B1000
bp
bp
500
M c 1 2 3 4
2.3 标准曲线及熔解曲线验证引物扩增效率和特
异性
经过 7000 System SDS software 分析，所有引物
的扩增效率在 80%-120% 之间，其线性相关系数
（correlation coefficients）R2 的变化范围在 1.000-0.990
2 结果
2.1 不同启动子的重组载体鉴定
pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B 和 pIRES-AcGFP-
CAG-FAD3B 两 个 重 组 载 体 分 别 具 有 CMV 和 CAG
启动子，FAD3B 基因的下游含有核糖体结合位点
（IRES） 连 接 的 绿 色 荧 光 蛋 白 基 因（GFP）。 通 过
PCR 和酶切鉴定两个表达载体（图 2）。
2012年第11期 123王子东等 ：牛转 FAD3B 基因胎儿成纤维细胞中内参基因的稳定性评估
CT 值接近于 ACTB 基因。说明转基因细胞中 FAD3B
的表达水平很高，接近 ACTB 基因的表达水平。此
外，GFP 和 FAD3B 处于两个独立的表达框中共表
达，GFP 的表达水平同样很高。每个独立的试验经
过 3 次重复，试验数据经过 SPSS 软件单因素方差分
析（one-way ANOVA），P<0.05 表示差异显著。
2.5 评价候选内参基因的稳定性
使用 GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper 三种运
算方法评价 9 种内参基因的表达稳定性。经过 GeNo-
rm 软件分析表明，内参基因的稳定性排序依次为
EEF1A2>GAPDH>PPP1R11>RPS15A>18S rRNA>
ACTB>HMBS>UXT>SF3A1。NormFinder 程序得到的
稳 定 性 排 序 为 PPP1R11>EEF1A2>18S rRNA>UXT>
RPS15A>HMBS>GAPDH>ACTB>SF3A1（表 4）。Best-
Keeper 运算表明，稳定性排序为 18S rRNA>RPS15A>
PPP1R11>GAPDH>EEF1A2>HMBS>UXT>ACTB>SF3
A1（表 4）。依据上述 3 个软件的排序，内参基因的
综合排序为 PPP1R11>EEF1A2>18S rRNA>RPS15A>
GAPDH>HMBS>UXT>ACTB>SF3A1（表 4）。 PPP1R-
11、EEF1A2 和 18S rRNA 是转基因细胞中表达最稳
定的内参基因。
3 讨论
转基因技术是现代生物遗传育种的可行手段，
对转基因细胞中内参基因的稳定性进行评价，才能
得到合适的内参基因校正转基因调控网络中相关基
因的表达水平。CMV 和 CAG 两个启动子在多种细
胞中都有较高的表达活性。CMV 启动子具有一段至
今为止发现的最强的增强子序列，构建具有 CMV 启
动子的过表达载体 pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B。CAG
启动子是商品化的启动子，长约 1.7 kb，由 CMV 启
动子的前期增强子和鸡 β 肌动蛋白启动子嵌合而成。
由于 CAG 启动子无法通过普通 PCR 亚克隆的方法
得到，通过设计一个带有酶切位点的 T 片段改造
pIRES2-AcGFP1-CMV 载体的多克隆位点，构建具
有 CAG 启动子的过表达载体 pIRES2-AcGFP1-CAG-
FAD3B，使亚麻 FAD3B 基因在转基因牛细胞中高表
达。为了选择稳定的内参基因更加准确地校正相关
基因的表达水平，评价了 9 种候选内参基因（ACTB、
GAPDH、18S rRNA、UXT、PPP1R11、RPS15A、
表 3 定量引物扩增参数
基因 斜率 相关系数 扩增效率（%）
ACTB -3.53 0.994 92.0
GAPDH -3.15 0.995 107.5
18S rRNA -3.44 0.993 95.3
UXT -3.75 0.991 84.8
PPP1R11 -2.93 0.997 119.3
RPS15A -3.37 0.996 98.0
SF3A1 -3.68 0.996 87.0
EEF1A2 -3.39 0.993 97.2
HMBS -3.23 0.991 104.0
FAD3B -3.00 0.999 115.4
250
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
100
M. DL2000 DNA Marker ；1. FAD3B ；2. ACTB ；3. GAPDH ；4.18S rRNA ；
5. UXT ；6. PPP1R11 ；7. RPS15A ；8. SF3A1 ；9. EEF1A2 ；10. HMBS ；
11. 以水为模板进行 PCR
图 5 定量引物预 PCR 琼脂糖凝胶电泳检测
之间（表 3）。使用 Fermentas DNA 聚合酶对定量引
物进行热启动 PCR，扩增片段经过 2.5% 的琼脂糖
凝胶电泳得到单一条带（图 5）。基因的熔解曲线都
是单峰（图 6）。 说明扩增没有产生引物二聚体或非
特异性扩增，符合 qRT-PCR 的要求。
2.4 转基因细胞中外源基因的表达
转基因细胞中外源基因的过表达对生命活动产
生很大的影响，本研究以不同过表达水平的转基因
细胞为试验对象，评价内参基因的稳定性。使用绝
对定量 PCR 分析不同启动子（CMV 与 CAG）的转
基因细胞中 FAD3B 基因的表达水平。利用平均 CT
值 作 图 得 到 标 准 曲 线 ：Y=-3.00X+36.31。 将 CT 值
代入线性方程，计算得到 FAD3B 基因的 mRNA 拷
贝 数。pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B 和 pIRES-AcGFP-
CAG-FAD3B 转基因细胞中 mRNA 的拷贝数分别是
1.53×105 和 1.36×105，而且前者的表达水平明显
高于后者（图 7）。两种转基因细胞 FAD3B 的平均
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期124
SF3A1、EEF1A2 和 HMBS）在转基因细胞中的稳定性。
GeNorm 程序通过 M 值对内参基因的稳定性进行
评价，逐步排除 M 值高的内参基因，表明 EEF1A2
和 GAPDH 基因表达最稳定。并且 GeNorm 运算得
到配对差异值 Vn/n+1，在我们的研究中，V2/3=0.139
小于选择阈值 0.15，表示两个基因对于相对定量体
系已经非常稳定（图 8），没必要使用更多的内参基
因。 NormFinder 程序确定最稳定的一个内参基因为
PPP1R11。ACTB 的稳定性在 3 个经典内参基因中最
差，在 9 个内参基因中排第 8。
BestKeeper 程序确定最稳定的一个内参基因为
18S rRNA，但由于其在 GeNorm 分析中排序较后，
60 ⑙ᓖ℃
-0.02
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
70 80 9065 75 85 95
ACTB
60 ⑙ᓖ℃
-0.02
0.60
0.40
0.20
0.00
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
70 80 9065 75 85 95
18S rRNA
60 ⑙ᓖ℃
-0.20
0.60
0.40
0.20
0.00
0.80
1.00
1.20
1.40
70 80 9065 75 85 95
SF3A1
60 ⑙ᓖ℃
-0.20
0.60
0.40
0.20
0.00
0.80
1.00
1.20
1.40
70 80 9065 75 85 95
HMBS
60 ⑙ᓖ℃
-0.40
1.20
0.80
0.40
0.00
1.60
2.00
2.40
2.80
70 80 9065 75 85 95
UXT
60 ⑙ᓖ℃
-0.10
0.30
0.20
0.10
0.00
0.40
0.50
0.60
0.70
70 80 9065 75 85 95
GAPDH
60 ⑙ᓖ℃
-0.00
0.20
0.15
0.10
0.05
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
70 80 9065 75 85 95
FAD3B
60 ⑙ᓖ℃
-0.10
0.20
0.10
0.00
0.30
0.40
0.50
0.60
70 80 9065 75 85 95
EEF1A2
60 ⑙ᓖ℃
-0.40
0.80
0.40
0.00
1.20
1.60
2.00
2.40
70 80 9065 75 85 95
RPS15A
60 ⑙ᓖ℃
-0.42
0.00
0.40
0.80
1.20
1.60
2.00
70 80 9065 75 85 95
PPP1R11
图 6 基因的熔解曲线
2012年第11期 125王子东等 ：牛转 FAD3B 基因胎儿成纤维细胞中内参基因的稳定性评估
并且有研究认为 rRNA 不适合作为稳定的内参基因，
其合成调控独立于 mRNA，不能代表 mRNA 的表达
水平［11］，并且 rRNA 表达丰度高，定量 PCR 数据难
以准确减去基线值，所以不推荐使用 18S rRNA 作为
稳定的内参基因。因此，我们建议使用 PPP1R11 和
EEF1A2 两个基因作为稳定的内参校正基因的表达
水平。
在牛转基因细胞的研究中，PPP1R11 和 EEF1A2
可以作为稳定的内参基因校正相对定量数据。也有
许多研究表明，PPP1R11 和 EEF1A2 基因比其他基
因更适合作为稳定的内参基因，如 EEF1A2 在大西洋
鲑鱼（Salmo salar L.）［24］、感染病毒的草鱼（Ctenop-
haryngodon idella）［25］、鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）［26］
和明亮熊蜂（Bombus lucorum）［27］中表达稳定。在
牛的研究中发现，肌肉组织中的 EEF1A2，青春期
前的乳腺组织中 PPP1R11 基因表达稳定［20］。
4 结论
本试验成功克隆得到亚麻 FAD3B 基因，构建了
具有 CMV 和 CAG 两种不同启动子的过表达 pIRES2-
AcGFP1-CMV-FAD3B 和 pIRES2-AcGFP1-CAG-
FAD3B。通过脂质体法转染牛胎儿成纤维细胞并对其
进行抗性筛选得到转基因细胞，pIRES-AcGFP-CMV-
FAD3B 和 pIRES-AcGFP-CAG-FAD3B 转基因细胞中
高表达 FAD3B 基因，每 100 ng cDNA 样品中 mRNA
拷贝数分别是 1.53×105 和 1.36×105 拷贝。基于 Ge-
Norm、NormFinder 和 BestKeeper 三种统计学算法，建
议在牛转 FAD3B 基因胎儿成纤维细胞的研究中，使
用 PPP1R11 和 EEF1A2 两个基因作为稳定的内参校
正基因的表达水平。
参 考 文 献
［1］ Huggett J, Dheda K, Bustin S, et al. Real-time RT-PCR normalisation;
strategies and considerations. Genes Immun, 2005, 6（4）: 279-
284.
［2］ Hoque T, Bhogal M, Webb RA. Validation of internal controls
for gene expression analysis in the intestine of rats infected with
Hymenolepis diminuta. Parasitol Int, 2007, 56（4）: 325-329.
［3］ de Jonge HJ, Fehrmann RS, de Bont ES, et al. Evidence based
selection of housekeeping genes. PLoS One, 2007, 2（9）: e898.
［4］ Long XY, Wang JR, Ouellet T, et al. Genome-wide identification and
evaluation of novel internal control genes for Q-PCR based transcript
normalization in wheat. Plant Mol Biol, 2010, 74（3）: 307-311.
［5］ Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. Accurate normalization
of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging
of multiple internal control genes. Genome Biol, 2002, 3（7）:
RESEARCH0034.
*
*
1.53
1.36
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B
FA
D
3B
基
因
m
R
N
A
拷
贝
数
1×
10
5 c
op
ie
s
纵坐标表示 mRNA 的拷贝数，* 表示显著性差异（P<0.05），误
差线表示标准偏差
图 7 pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B 和 pIRES-AcGFP-CAG-
FAD3B 转基因细胞中 FAD3B 基因的表达量水平
基因名称 M 值 稳定性 标准差值 综合排序
ACTB 0.501（6） 0.046（8） 0.496（8） 8
GAPDH 0.321（2） 0.043（7） 0.380（4） 5
18S rRNA 0.459（5） 0.033（3） 0.205（1） 3
UXT 0.550（8） 0.035（4） 0.489（7） 7
PPP1R11 0.404（3） 0.026（1） 0.373（3） 1
RPS15A 0.482（4） 0.035（5） 0.251（2） 4
SF3A1 0.613（9） 0.069（9） 0.509（9） 9
EEF1A2 0.321（1） 0.032（2） 0.403（5） 2
HMBS 0.524（7） 0.038（6） 0.453（6） 6
表 4 通过 GeNorm、NormFinder 和 Bestkeeper 等算法计
算得到内参基因表达的稳定性值（括号中为排序）
0.085
0.0660.0690.074
0.088
0.114
0.139
0.200
Determination of the optimal number of control genes for normalization
0.100
0.000
0.050
0.150
V2/3 V3/4 V4/5 V5/6 V6/7 V7/8 V8/9
Pairwise Variations
图 8 内参基因选择数量的优化
纵坐标表示 Vn/n+1 值，如果低于选择阈值 0.15，就不需要其他基因作
为内参基因校正系统偏差
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期126
［6］ Jemiolo B, Trappe S. Single muscle fiber gene expression in human
skeletal muscle: validation of internal control with exercise. Biochem
Biophys Res Commun, 2004, 320（3）: 1043-1050.
［7］ Selvey S, Thompson EW, Matthaei K, et al. Beta-actin--an unsuitable
internal control for RT-PCR. Mol Cell Probes, 2001, 15（5）:
307-311.
［8］ Barber RD, Harmer DW, Coleman RA, et al. GAPDH as a housekee-
ping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72
human tissues. Physiol Genomics, 2005, 21（3）: 389-395.
［9］ Solanas M, Moral R, Escrich E. Unsuitability of using ribosomal
RNA as loading control for Northern blot analyses related to the
imbalance between messenger and ribosomal RNA content in rat
mammary tumors. Anal Biochem, 2001, 288（1）: 99-102.
［10］ Tricarico C, Pinzani P, Bianchi S, et al. Quantitative real-time
reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to
rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human
tissue biopsies. Anal Biochem, 2002, 309（2）: 293-300.
［11］ Radonić A, Thulke S, Mackay IM, et al. Guideline to reference gene
selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res
Commun, 2004, 313（4）: 856-862.
［12］ Schmittgen TD, Zakrajsek BA. Effect of experimental treatment on
housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative
RT-PCR. J Biochem Biophys Methods, 2000, 46（1-2）: 69-81.
［13］ Tricarico C, Pinzani P, Bianchi S, et al. Quantitative real-time
reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to
rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human
tissue biopsies. Anal Biochem, 2002, 309（2）: 293-300.
［14］ Kang JX, Wang J, Wu L, et al. Transgenic mice: fat-1 mice convert
n-6 to n-3 fatty acids. Nature, 2004, 427（6974）: 504.
［15］ Lai L, Kang JX, Li R, et al. Generation of cloned transgenic pigs
rich in omega-3 fatty acids. Nat Biotechnol, 2006, 24（4）:
435-436.
［16］ Pan D, Zhang L, Zhou Y, et al. Efficient production of omega-3 fatty
acid desaturase（sFat-1）-transgenic pigs by somatic cell nuclear
transfer. Sci China Life Sci, 2010, 53（4）: 517-523.
［17］ Zhu G, Chen H, Wu X, et al. A modified n-3 fatty acid desaturase
gene from Caenorhabditis briggsae produced high proportion of
DHA and DPA in transgenic mice. Transgenic Res, 2008, 17（4）:
717-725.
［18］ Indo Y, Tatemizo A, Abe Y, et al. Functional expression of a
humanized gene for ane omega-3 fatty acid desaturase from scarlet
flax in transfected bovine adipocytes and bovine embryos cloned
from the cells. Biochim Biophys Acta, 2009, 1791（3）: 183-190.
［19］ Bionaz M, Loor JJ. Identification of reference genes for quantitative
real-time PCR in the bovine mammary gland during the lactation
cycle. Physiol Genomics, 2007, 29（3）: 312-319.
［20］ Piantoni P, Bionaz M, Graugnard DE, et al. Gene expression ratio
stability evaluation in prepubertal bovine mammary tissue from cal-
ves fed different milk replacers reveals novel internal controls for
quantitative polymerase chain reaction. J Nutr, 2008, 138（6）:
1158-1164.
［21］ Pérez R, Tupac-Yupanqui I, Dunner S. Evaluation of suitable
reference genes for gene expression studies in bovine muscular
tissue. BMC Mol Biol, 2008, 9: 79.
［22］ Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF. Normalization of real-time
quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance
estimation approach to identify genes suited for normalization,
applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res, 2004,
64（15）: 5245-5250.
［23］ Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, et al. Determination of stable
housekeeping genes, differentially regulated target genes and
sample integrity: BestKeeper-Excel-based tool using pair-wise
correlations. Biotechnol Lett, 2004, 26（6）: 509-515.
［24］ Ingerslev HC, Pettersen EF, Jakobsen RA, et al. Expression profiling
and validation of reference gene candidates in immune relevant tiss-
ues and cells from Atlantic salmon（Salmo salar L.）. Mol Immunol,
2006, 43（8）: 1194-1201.
［25］ Su J, Zhang R, Dong J, et al. Evaluation of internal control genes
for qRT-PCR normalization in tissues and cell culture for antiviral
studies of grass carp（Ctenopharyngodon idella）. Fish Shellfish
Immunol, 2011, 30（3）: 830-835.
［26］ Garg R, Sahoo A, Tyagi AK, et al. Validation of internal control
genes for quantitative gene expression studies in chickpea（Cicer
arietinum L.）. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 396（2）:
283-288.
［27］ Hornáková D, Matousková P, Kindl J, et al. Selection of reference
genes for real-time polymerase chain reaction analysis in tissues
from Bombus terrestris and Bombus lucorum of different ages. Anal
Biochem, 2010, 397（1）: 118-120.
（责任编辑 李楠）