全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(4)：521— 526 2008年 7月
拟南芥植物硫肽激素基因在玫瑰茄细胞中的表达
谢秀祯1，3，林俏慧2，3，郭 勇3
(1．海南师范大学 生物系 ，海 口 571158；2．Department ofBiochemistry，BiophysicsandMolecularBiology，
Iowa State University，Ames，Iowa 5OO11；3．华南理工大学 生物科学与工程学院，广州 510640)
摘 要：利 目j致瑰茄愈伤组织遗传转化体系，通过根癌农杆菌将AtPSK2基因导入玫瑰茄细胞，并获得了功
能性表达。研究结果表明，所获得的转基因玫瑰茄细胞系的临界植板细胞密度和临界起始细胞密度分别降低
了6o 和5o ，悬浮细胞培养周期由16 d缩短到 12 d，转化愈伤组织的比生长速率比对照提高了 75 ，转基
因玫瑰茄细胞和愈伤组织中的花黄素含量与对照相比没有发生明显变化。本研究所获得的转基因玫瑰茄细
胞系不仅为花青苷和花黄素等次生代谢产物高产细胞株的选育提供出发材料，而且为 PSK—a作用机理的深
入研究提供一个有用的模型。
关键词：拟南芥植物硫肽激素基因；玫瑰茄；根癌农杆菌介导的遗传转化系统；转基因细胞 植物细胞增殖
中图分类号 ：Q812，Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2008)04—0521—06
Expression of AtPSK2 gene in roselle cells
XIE Xiu-ZhenI，3，LIN Qiao-Hui2，3，GU0 Yonga
(1．Department of Biology，Hai~n Normal University，Haikou 571158，ChinaI 2．Department of Biochemistry，
Biophysics and Molecular Biology，Iowa State University，Iowa 50011，USA；3．College of Bioscience
and Biotechnology，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)
Abstract：By using A．tumefaciens-mediated genetic transformation system of Roselle calus，AfPSK2 gene was intro—
duced into and expressed functionaly in Roselle cells．The results demonstrated that，by comparison with un-trans—
gemc Roselle cel or calus，the critical plating cel density and critical initiating cell density of transgenic cell line were
cut down 6O and 5O ，respectively，the growth cycle of transgenic cell in suspension culture was shortened from 16
days tO 12 days，and the specific growth rate of transgenic Roselle callus was raised 75％，the content of flavonoid
compounds in transgenic Roselle cel line or callus was hardly altered．The obtained transgenic Roselle cell line in this
study not only provides an intial material for selection and breeding of Rosele cel line with high-yield anthocyanin，
but also gives a useful research model for further investigation in the mechanism of PSK-a action
．
Key words：AtPSK；Rosele(Hibiscus sabdaiffa)；Agrobacterium tumefaciens—mediated genetic transformation
system；transgenic cell；plant cel proliferation
玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)是锦葵科木槿属
一 年生草本植物，原产非洲苏丹，广泛分布于全世界
各热带、亚热带地 区。玫瑰茄是一种具有多种经济
用途的作物，在我国广东、广西、云南、浙江、江西、福
建、台湾等地均有栽培。玫瑰茄的花萼不仅是食品
和时兴饮料的原料，所含的花青苷色素是一种天然
红色食用色素，在国内外已广泛应用于食品及饮料
工业(李玉萍，2003)；而且也是常用的中草药，在临
床上用于治疗高血压、心脏病、发烧、发炎、肝脏机能
障碍和免疫系统紊乱等(Pi—Jen等，2002；Dafalah
& al—Mustafa，1996)疾病。玫瑰茄细胞产生的花青
苷具有抗氧化、抗突变作用(Haji FM & Haji TA，
收稿日期 ：2007—04—08 修回日期 ：2007—08—11
基金项目：广东省重点科技攻关项目(A3OlO20201)[Supported by Key Technologies Research and Development Program of GuaI1gdong Province
(A301020201)
作者简介；谢秀祯(1960一)，男，海南儋州市人，博士，教授，主要从事基因工程的研究，(E—mail)xiexiuzhen@sina．c0m。
通讯作者(Author for correspondence，E—mail：htyguo@SCUt．edu．cn)
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522 广 西 植 物 28卷
1999)，其抗氧化性能已受到医学界的普遍重视。据
Chen等(2003)报道，玫瑰茄的提取物具抗肿瘤、抗
白血病和抑制由胆固醇引起的动脉粥样硬化的效
果。Chang等(2005)及 Lin等(2005)通过研究初步
揭示了玫瑰茄提取物诱导人前髓白血病细胞、胃癌
细胞发生细胞凋亡的机理，从而为将玫瑰茄提取物
开发成肿瘤预防和治疗药物奠定了理论基础。2O
世纪 9O年代以来，国内外学者对利用玫瑰茄细胞培
养技术生产花青苷进行了广泛研究，并取得可喜的
成果 (阮茜等，1999；朱新贵等，1998；郑穗平等，
1998)，但从 目前研究结果看，生产周期长(约 16 d)
已成为制约这一技术走向产业化的瓶颈之一。因
此，如何获得快速增殖的玫瑰茄细胞系已成为一个
急需研究的课题。
植物硫肽激素一a(phytosulfokine-a，PSK-a)是
在植物中鉴定到的第一个肽类生长因子，是一种硫
酸酯化的五肽分子，它以很低的浓度就能强烈刺激
低密度培养的植物细胞的增殖 (Yang等，2000a~
Matsubayashi等，1997)。Yang等(2000b)用带肌
动蛋白启动子的 PSK基因转化水稻细胞的结果
表明，转化子细胞的分裂速度比野生型细胞(对照)
快 1倍左右。Yang等 (2001)用拟南芥 AtPSK2
cDNA转化拟南芥，得到的转化愈伤组织比对照大
1倍。Yang等(1999)研究结果还表明，PSK基因
是通过它的产物 PSK—a促进植物细胞分裂的。本
研究通过将拟南芥 PSK—a的基因导人玫瑰茄细胞，
以期获得快速增殖的细胞系，在此基础上筛选花青
苷高产细胞株。
1 材料与方法
1．1材 料
1．1．1植物材料 玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)种
子来源于华南植物园引种部，消毒后播于不加激素
的 B。固体培养基(附加 3 蔗糖)上，于 25±1℃培
养箱中萌发，取 10--12 d龄幼苗为实验材料。
1．1．2农杆茵茵株和质粒 试验所用的根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens)菌 株 为 LBA4404
(str )，植物表达载体为 pBI121。重组质粒 pUC-
PSK2由作者构建(谢秀祯等，2005a)。
1．1．3酶和试剂 TaqDNA聚合酶购自大连宝生物
公司；PCR引物由上海 Bioasia生物技术有限公司
合成；卡那霉素(Km，Sigma公 司)、硫酸链霉素
(Str，Amresco公司)、乙酰丁香酮(AS，Aldrich公
司)、X-Gluc(Genview公司)、质粒快速提取试剂盒
和核酸纯化／回收试剂盒购 自北京鼎国生物技术有
限责任公司；槲皮素购 自百灵威化学技术有限公司；
头孢霉素(Cefo)、氯霉素(Cm)及其他试剂为国产或
进口分装分析纯。
1．1．4培养基 愈伤组织继代培养基的组成为 B5
培养基附加 2 mg／L 2，4-D、0．1 mg／L KT、3 蔗糖
和0．8 琼脂，pH5．8。细胞悬浮培养基组成为 B5
培养基附加 1 mg／L 2，4-D，0．1 mg／L KT和 2 蔗
糖，pH5．8。条件培养基：取培养 8 d的悬浮细胞培
养液，于 5 000 r／min离心 10 rain，取上清于灭菌的
带盖离心管中，封口膜密封后置 4℃冰箱保存备用。
1．2方法
1．2．1重组植物表达载体的构建及检测 用 X6n I
和 Sac 1分别对 pBI121、pUC-PSK2进行双酶切，然
后用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收并纯化目标酶切片
段。体外重组及大肠杆菌转化的操作按常规方法进
行，农杆菌感受态细胞的转化采用王关林等(2002)
的冻融法，阳性重组质粒采用 X6n I、Sac I双酶切
和 PCR检测。
1．2．2转基因玫瑰茄细胞系的获得及检测 (1)农
杆菌介导的玫瑰茄愈伤组织的遗传转化：按谢秀祯
(2oo5b)的方法进行。(2)转基因玫瑰茄细胞系的
获得：将经2次继代培养的适量抗性愈伤组织转接
到含 100 mg／L Kan和 300 mg／L Cefo的悬浮细胞
培养基中，25℃，100 r／min，微光照培养，2-3周继
代 1次。(3)转基因玫瑰茄细胞系的检测：玫瑰茄细
胞总 DNA的小量提取参照王关林等(2002)的方法
进行。PCR检测所用的三对引物分别是：根据 At—
PSK2基 因 序 列 设 计 合 成 的 引 物：P1：5 一
TATCTCTAGAATGGCAAACGTCTCCGCT一3 ；
P2：5-GTATGAGCTCTCAAGGATGCTTCTT(’_
TTCTGG-3 。根据 pBI121质粒上 CaMV35S启动
子和Nos终止子序列设计合成的引物：P3：5 一AT—
GACGCACAATCCCACTATCCTTCG一3 ；P4：5 一
GATAATCATCGCAAGACCGGCAACAG一3 ；根
据 nptlI基 因设 计 合 成 的 引物：P5：5-GACT—
GGGCACAACAGACAATCGG一3 ；P6：5 一AGCA—
ATATCACGGGTAGCCAACG一3 。三对引物预期
扩增片段大小分别为 432bp、585bp和 621bp。
1．2．3最低有效植板细胞密度和最低有效起始细胞
密度的测定 取悬浮培养至对数生长期(约 8 d)的
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4期 谢秀祯等：拟南芥植物硫肽激素基因在玫瑰茄细胞中的表达 525
因得到了表达，细胞培养到第 1O天时，培养液中积
累的 PSK—a的浓度可能接近了添加 3O 9／6条件培养
基的培养液中PSK—a的浓度，从而能有效地启动细
胞分裂和增殖 。
2．3．2细胞生长曲线的比较 通过对生长 曲线的比
较，还可以看到，转化细胞的延滞期从 8 d缩短到了
4 d，达到稳定期的时间也相应地从 16 d缩短到 12
d。这也说明在转化细胞中由于 AtPSK2基因的表
达，使悬浮培养所需要的延滞时间缩短，从而使整个
培养周期也相应地缩短(图 7)。在本试验中，转化
表 1 低密度条件下培养细胞的生物量增长倍数
Table 1 Increasing multiples of cell biomass cultured at a low density
～
：牧有 试 验 non—test； M ：conditioned medium．
细胞的临界植板细胞密度和临界起始细胞密度比非
转化细胞明显降低，并且延滞期也显著缩短，这就反
映出在转化细胞内 PSK-~合成能力 比非转化细胞
有了较大的提高。也就是说，外源 AtPSK2基因在
玫瑰茄转化细胞内得到了较好的表达。
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图 7 转化细胞和非转化细胞生长曲线的比较
Fig．7 Comparison of growth curve of transformed
cell with non-transform ed cell
2．4 AtPSK2基因促愈伤组织生长活性的检测
将来自转化细胞和非转化细胞、大小相近的愈
伤组织接种于固体培养基上，培养 14 d后，观察两
者的大小差别，结果显示，转基因愈伤组织的大小是
对照的 1．77倍。另外，还测得转基因愈伤组织的比
生长速率为 o，186 g／g·d，而对照为 0．106 g／g·
d，前者是后者的 1．75倍，说明外源 PSK基因已经
在玫瑰茄细胞中得到表达，并表现出其促进愈伤组
织生长的活性 。
2．5转基因玫瑰茄细胞中花黄素含量的测定
在玫瑰茄细胞中槲皮素是花青素合成途径的中
间产物，在它们之前的苯丙氨酸解氨酶和查尔酮合
成酶是整条合成途径的关键酶。农杆菌介导的植物
细胞的遗传转化，是以 T-DNA左右边界序列引导
目的基因整合到染色体而告终。由于这种整合是随
机的，因此所获得的转基因细胞系有可能出现诸如基
因沉默、生长速度下降或目标代谢产物产量降低甚至
消失等负效应。测定结果表明，转基因玫瑰茄细胞
(转化细胞 101．8／zg／g)或愈伤组织的花黄素含量(转
化愈伤组织 162．0／zg／g)与对照(未转化细胞 102．9
／~g／g，未转化愈伤组织 160．0 g)没有明显差别，因
此，可用于花青素、花黄素高产细胞株的筛选。
3 讨论与结论
在构建重组表达载体的过程中，我们采用定向
克隆策略，即在设计 AtPSK2基因的特异引物时，
根据表达载体和中间克隆载体上都可供利用的酶切
位点，人为地在引物的 5 端引入两个非同裂酶或同
尾酶的酶切位点，这样不仅能避免载体的自身环化，
便于进行连接操作，提高重组率，而且确保插入方向
正确。用牙签法对蓝一白筛选到的转化子进行检
测，没有发现假阳性菌落，也说明了定向克隆策略的
可靠性和有效性。
利用我们建立的玫瑰茄愈伤组织遗传转化体
系，通过根癌农杆菌介导将体外构建的、含 AtPSK2
基因的重组植物表达载体导入玫瑰茄细胞，所获得
的转基因玫瑰茄细胞系的临界植板细胞密度由5×
lO。细胞／mL降低到 2×lO 细胞／mL；临界起始细
胞密度由 4×lO 细胞／mL降低到 2×lO 细胞／
mL，分别降低了 6o 和 5o 。在起始密度为 3×
1O。细胞／mL时，转化细胞培养到第 10 d时，就能有
效地启动细胞分裂和增殖。在悬浮培养中，转化细
胞的延滞期从 8 d缩短到了4 d，达到稳定期的时间
也相应地从 16 d缩短到 12 d。平板培养的转基因
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愈伤组织的大小是对照的 1．77倍，比生长速率是对
照的 1．75倍。所 有这些 结果都 说 明了外源 PSK
基因已经在玫瑰茄细胞中得到表达，并表现出其促
细胞 生长的活性。
根据现有研 究 结果 (Matsubayashi等 ，1999)，
人们推测，在细胞脱分化和促进细胞分裂的过程中，
PSK—a可能介导了与生长素和细胞分裂素密切相关
的信号转导途径，而 PSK与 PSK受体的结合是一
个涉及到植物细胞脱分化以及保持细胞脱分化状态
的级联信号调节机制(Matsubayashi等，2002)。因
此，本试验结果间接证明，玫瑰茄细胞能够识别和正
确加工拟南芥 PSK2基因的内含子序列、信号肽和
PSK—a前体；另一方面说明了在玫瑰茄细胞中表达
的拟南芥 PSK2基因产物——PSK—a能与玫瑰茄
细胞的PSK受体特异性结合，并按细胞中特定的级
联信号调节机制发挥作用。在这之前还没有相关的
报道。这将为 PSK—a的生物合成和作用机理的深
入研究提供一个新的模型。
由于转基因玫瑰茄细胞和愈伤组织中的花黄素
含量没有受转基因的影响，故可用作花青苷和花黄素
等次生代谢产物高产细胞株选育的出发材料。本研
究结果对于单细胞的培养和细胞株的筛选，特别是对
利用原生质体融合进行细胞育种将产生积极的促进
作用。
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