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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
天然木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木
质素组成，大量的秸秆等农业废弃物或被粗放式地
当作燃料毫无意义的焚烧，或被弃置在公路旁河沟
内，既造成了严重的大气污染，破坏了生态环境，
又浪费了宝贵的资源，因此纤维质原料的应用研究
一直倍受关注。木质纤维素类原料的酶解糖化主要
需要两大类酶的参与 ：纤维素酶和半纤维素酶。纤
维素酶通常分为葡聚糖内切酶（EC3.2.1.4，Cx 酶、
CMC 酶）、葡聚糖外切酶（EC3.2.1.91，CBH、C 1 酶、
收稿日期 ：2012-10-24
基金项目 ：国家“863”计划项目（2012AA101807，2012AA023202）
作者简介 ：于俊杰，女，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：yjj5127@163.com
通讯作者 ：武改红，女，博士，助理研究员，研究方向 ：木质纤维素降解酶系的开发 ；E-mail ：wgh822@126.com
复合木质纤维素酶菌株筛选及其培养条件优化
于俊杰1，2  赫荣琳2  武改红2  张粲1，2  陈树林2  张同存1
（1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457 ；2. 天津工业生物技术研究所 天津市工业生物系统与
过程工程重点实验室，天津 300308）
摘 要 ： 通过富集培养、平板初筛、平板点接，从土壤中筛选得到一批产木质纤维素酶系较全的菌株，经摇瓶复筛验证确
定 26-6 为出发菌株。该菌经 PDA 平板菌落形态观察、孢子扫描电镜观察以及 ITS 序列片段分析，初步鉴定该菌为草酸青霉组菌株，
并命名为 Penicillium oxalicum EH26-6。随后对菌株的摇瓶发酵条件进行研究，最终确定了最佳产酶条件 ：玉米芯为碳源，玉米浆
干粉为有机氮源，初始 pH5.0，温度 30℃，接种量 10%。本研究为低成本生产复合纤维素酶系的生产提供一个备选菌株。
关键词 ： 筛选 木质纤维素酶 培养条件 优化
Isolation of Strain Producing Complex Lignocellulase and the
Optimization of Culture Conditions
Yu Junjie1，2 He Ronglin2 Wu Gaihong2 Zhang Can1，2 Chen Shulin2 Zhang Tongcun1
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457 ；2. Tianjin Key Laboratory for Industrial
Biological Systems and Bioprocess Engineering，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，
Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）
Abstract:  Based on enrichment culture, initial screening, and further screening by spotting vaccination, a group of degradation
lignocelluloses strains were isolated from soil. Then strains were cultured in the flask to develop the repeated screening, and enzymes activity was
tested, finally a filamentous fungus 26-6 was screened. Then colonial morphology of the strain on PDA plate was observed, spore morphology was
also observed by scanning electron microscope. According to the ITS rDNA sequence analysis, the fungi was initially identified as a Penicillium
oxalicum strain and named Penicillium oxalicum EH26-6. Culture optimization was then carried out in flask scale and finally the optimal culture
condition was determined as corn cob for carbon source, corn steep powder for organic nitrogen source, pH5.0, temperature 30℃ , inoculation
10%. The research provided an alternative strain for the low cost production of composite cellulose enzyme.
Key words:  Isolation Lignocelluloses Culture condition Optimization
微晶纤维素酶）和 β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21，BG）
3 种组分。天然纤维素的生物降解必须依靠上述 3
种组分的协同作用才能完成［1，2］。半纤维素酶包括
木聚糖酶（xylanase）、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、
阿拉伯半乳糖酶和木葡聚糖酶等多组酶。天然木质
纤维素中存在的半纤维素对于纤维素的降解效率也
有着重要的影响。有文献报道在纤维素酶水解过程
中，半纤维素的降解能够暴露出更多的纤维素与纤
维素酶结合，从而加快纤维素的水解过程。这些结
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期102
果表明在天然木质纤维素的降解过程中，半纤维素
酶和纤维素酶之间发生了协同效应，促进了纤维素
和半纤维素的转化率。
自然界中广泛存在着能降解纤维素的微生物，
它们种类繁多，包括细菌、真菌和放线菌等。现有
的纤维素酶生产方法主要是采用产纤维素酶的微生
物进行液体发酵制备，其中以里氏木霉（Trichoderma
reesei）及其近缘的菌株应用最为广泛。目前所选育
出来的优良纤维素分解菌几乎都是木霉属菌株，而
木霉菌普遍存在 β-葡萄糖苷酶活力偏低的问题，使
得纤维素降解过程中外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶
产生的纤维二糖积聚，从而反馈抑制外切和内切葡
聚糖酶活力，降低酶解效率，这也是一直以来阻碍
其广泛应用的瓶颈问题［3］。黑曲霉等产 β-葡萄糖
苷酶活力较高而滤纸酶活力较低，纤维素酶系比较
单一。因此，筛选一株既含有内切葡聚糖酶、外切
葡聚糖酶又含有 β-葡萄糖苷酶的菌株将具有十分重
要的现实意义，文献报道以及我们前期研究工作中
发现，天然纤维素玉米芯既能诱导木聚糖酶，也能
够诱导一定活力的 β-葡萄糖苷酶的菌株产酶，因
此，开发一株能够利用廉价玉米芯生产不同复合酶
系的菌株对今后利用木质纤维素低成本生产燃料乙
醇或者其他生物基化学具有极其重要的应用意义。
目前国内外的研究［4，5］重点主要是从土壤中分离
得到高产纤维素酶的细菌、真菌或对试验室已有的
菌株进行基因改造及产酶条件的优化，以寻找产纤
维素酶的高效菌株［6］。Malabadi 等［7］从腐烂的木
材中得到的一株新型的酵母菌 Pichia pinus，在最
适温度 55℃、pH4.5 的条件下，木聚糖酶活、β-葡
萄糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶酶活力分别达到 545、
0.1 和 0.05 IU/mL。Gigi 等［8］通过以麸皮为唯一碳
源培养的方法得到了一株产木聚糖酶的链霉菌属
菌 株 Streptomyces sp. P12-137， 在 28℃，150 r/min
1% 麦麸诱导条件下，120 h 木聚糖酶活力达到 9.27
IU/mL。但能够利用廉价原料玉米芯生产分泌多种酶
的高效菌株的筛选报道较少。
本试验从野外采集农业废弃物的枯枝败叶以及
其地表下的土样作为试验样品，通过富集培养、平
板初筛、以及摇瓶复筛验证，旨在筛选到一株能够
利用廉价玉米芯分泌木质纤维素酶系较全的生产菌
株，并针对该菌株进行培养条件的优化以确定其最
佳产酶条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土样采集 从山东、河南、河北、山西等地
采集样品，主要选取腐烂的枯枝败叶、秸秆及地表
以下 5-10 cm 的土壤。
1.1.2 培养基 斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养
基（potato dextrose agar，PDA）斜面。β-葡萄糖苷酶
初筛培养基 ：根据文献［9］修饰，添加 0.1% Triton。
木聚糖酶初筛培养基：木聚糖 0.4%，（NH4）2SO4
0.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.2%，KH2PO4 0.1%，
琼脂 1.8%-2.0%，0.1% Triton。
CMC 培养基［10］：Mandels 营养盐 ：（NH4）2SO4
0.14%，KH2PO4 0.2%，尿素 0.03%，蛋白胨 0.075%，
MgSO4·7H2O 0.03%，pH5.5。微量元素 ：FeSO4·7H2O
0.005‰，MnSO4·H2O 0.0016‰，ZnSO4·7H2O 0.0014‰，
CoCl2 0.002‰。其他 ：CMC-Na 1%，Triton 0.2%，山
梨醇 0.4%，刚果红 0.02%，琼脂 1.8%。注 ：CMC-
Na（sodium carboxymethyl cellulose，CMC）很难溶于
冷水，应加热搅拌使之溶解混匀再灭菌。
Avicel 培养基 ：微晶纤维素（Avicel）0.8%，蛋
白胨 0.3%，KH2PO4 0.1%，酵母粉 0.05%，Triton 0.1%，
琼脂 2.0%，用麸皮汁配制。
麸皮产酶培养基 ：麦麸 4%，微晶纤维素 1%，
木聚糖 1%，酵母浸粉 0.1%，蛋白胨 0.075%，尿素
0.03%，（NH4）2SO4 0.14%，MgSO4·7H2O 0.03%，
CaCl2 0.03%，KH2PO4 0.2%，甘油 0.05%，Tween-80
2 mL/L，微量元素同 CMC 培养基，pH5.5。
发酵培养基 ：参考文献［11］进行培养条件优
化的研究。
1.2 方法
1.2.1 菌株筛选 称取 1 g 土样于 20 mL 无菌水中，
震荡混匀。取 1 mL 土样上清液于 20 mL 富集培养基
中进行富集培养。2-3 d 后将富集培养液稀释 10-106
倍，吸取 0.1-0.4 mL 涂布于初筛平板，30℃恒温培
养约 3 d。七叶灵初筛平板或木聚糖初筛平板上的特
征菌点样在另外 3 种初筛平板（Avicel、CMC、木聚
糖或七叶灵平板）上，通过透明圈或显色圈菌落直
2013年第4期 103于俊杰等 ：复合木质纤维素酶菌株筛选及其培养条件优化
径比比较从中选出产酶系较全且活力相对较高的菌
株。将点样平板上进一步筛选到的菌株接发酵产酶
培养基（麸皮培养基）进行摇瓶复筛，测 FPA、葡
萄糖苷酶及木聚糖酶活力并进行验证。
1.2.2 粗 酶 液 制 备 及 酶 活 测 定 将 发 酵 液 4 500
r/min 低 温（4 ℃） 离 心 10 min， 上 清 液 即 为 粗 酶
液，酶活测定方法参照文献［12，13］。FPA（Filter
Paper Activity）酶活力单位定义为在 pH4.8，温度为
50℃的条件下，1 mL 酶液 1 min 水解滤纸条产生 1
μmol 葡萄糖当量的还原糖的酶用量为一个酶活力单
位， 用 IU/mL 表 示 ；β-葡 萄 糖 苷 酶（β-glucosidase）
活力单位定义为在 pH4.8，温度为 50℃的条件下，1
mL 酶液 1 min 水解 1 μmol 纤维二糖产生 2 μmol 葡
萄糖当量的还原糖的酶用量为一个酶活力单位，用
IU/mL 表示 ；木聚糖酶（xylanase）活力单位定义为
在 0.05 mol/L pH5.3 柠檬酸钠缓冲液，温度为 50℃
的条件下，1 mL 酶液 1 min 水解木聚糖产生 1 μmol
葡萄糖当量的还原糖的酶用量为一个酶活力单位，
用 IU/mL 表示。
1.2.3 可溶性蛋白测定（Bradford 检测法） 试验用
缓冲液将上清液稀释至合适的浓度 ；取稀释后的样
液 200 μL 于 5 mL 离心管中 ；加入 2 mL Bradford 工
作液并震荡混匀 ；5-10 min 内测 A595 值
［14］。
1.2.4 菌落及孢子形态特征观察 将 26-6 孢子点接
至 PDA 平板，置于 30℃恒温培养箱培养 2-3 d 后进
行菌落形态观察，同时取在 PDA 平板上培养 3 d 的
孢子，在扫描电镜（FEI Quanta 200）下进行孢子形
态观察。
1.2.5 分子鉴定 （1）用试剂盒法提取基因组，将
孢子悬液接种于葡萄糖土豆汁培养基（30 mL）180
r/min，28-30℃培养，2-3 d 后过滤收集菌丝，用吸
水纸将菌体水分吸干，-20℃冻 1 h，液氮研磨后得
到的粉末用于试剂盒提基因组。（2）采用 ITS 序列
进行鉴定 ：引物对 YCITS4 ：5-TCCTCCGCTTATTG-
ATATGC-3，YCITS5 ：5-GGAAGTAAAAGTCGTAA-
CAAGG-3 由华大基因合成，PCR 反应体系组成为 ：
10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，dNTP
Mixture 1 μL，引物各 1 μL，Taq 酶 1 μL，Cruds DNA
1 μL，超纯水 37 μL。PCR 反应条件为 ：94℃预变性
5 min；94℃变性 30 s，55℃退火 1 min，72℃延伸 10 s，
35 个循环 ；72℃延伸 10 min，4℃保存。通过 PCR
扩增获得 ITS rDNA 部分序列，扩增片段经天一辉远
公司测序后，与 GenBank 数据库中序列进行 BLAST
比对。
1.2.6 培养基条件优化 （1）碳源优化 ：选取玉米
芯粉、麸皮、微晶纤维素、葡萄糖、甘油、CMC 为
单一碳源（添加量为 2%），探讨碳源对该菌的产酶
的底物诱导作用。（2）氮源优化 ：根据已有的研究，
硫酸铵作为无机氮源时发酵产酶效果较好，因此在
以硫酸铵为无机氮源的基础上，进行有机氮源的优
化。本试验选用的有机氮源为 ：玉米浆干粉、蛋白
胨、酵母膏、胰蛋白胨，以有机氮源中总氮量相等
的原则进行添加。（3）温度、pH 及接种量条件优化：
在碳氮源优化的基础上将温度设为 5 个梯度 ：26℃、
28℃、30℃、32℃和 34℃；pH 设为 5 个梯度：4.0、4.5、
5.0、5.5 和 6.0 ；每个三角瓶接种子液设置 5 个水平 ：
3.33%、6.67%、10%、13.3% 和 16.7%。摇瓶培养条件：
转速 180 r/min，28℃，250 mL 三角瓶装液量 30 mL。
2 结果
2.1 菌株筛选
通过透明圈或显色圈菌落直径比挑选出产酶系
较全且活力相对较高的菌株，其中含有七叶灵、木
聚糖、Avicel、CMC 平板特征分别表征出相应的降
解能力 ：β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、葡聚糖外切酶
和内切葡聚糖酶。根据七叶灵、木聚糖、Avicel、
CMC 平板特征分析，在七叶灵平板上菌株 36-6、
26-1、26-6 表现有较高的葡萄糖苷酶、木聚糖酶、
葡聚糖外切酶酶活力，其中菌株 26-6 木聚糖酶和葡
聚糖外切酶表现尤为明显（图 1）；菌株 26-2、26-3、
29-1 木聚糖酶、葡聚糖外切酶、葡萄糖苷酶较为明
显。将筛选菌株接种于麸皮产酶培养基进行摇瓶发
酵复筛，测定酶活进行验证。摇瓶发酵 6 d 结束发
酵并测定粗酶液酶活力，结果显示菌株 26-6 酶活酶
系最全，酶活力最高，各组分酶活分别是 ：FPA 0.90
IU/mL，葡萄糖苷酶活力 1.41 IU/mL，木聚糖酶活力
159.3 IU/mL。
2.2 菌种鉴定
图 2、图 3 为 26-6 在 PDA 平板上的菌落形态，
白色絮状菌丝，且在后期菌落中心有白色气生菌丝
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期104
结成绳索状。边缘不整齐，菌落背部无色或浅黄色。
菌丝体末端产生帚状分生孢子梗，最末级的小枝上
长出成串的分生孢子。电镜扫描结果（图 4、图 5）
显示，帚状枝分散，间枝下部分枝 1-2 次。小梗近
于平行排列，分生孢子链之间不纠接，分生孢子长
椭圆形接近于圆柱形，表面光滑。根据《真菌鉴定
手册》［15］的描述，该菌形态特征与草酸青霉组菌
株（Penicillium oxalicum strain）相似。为了进一步
鉴定该菌株的种名，本研究将菌株 26-6 进行 ITS 菌
种鉴定，图 6 为菌株 26-6 ITS rDNA 的 PCR 扩增结
果，扩增片段大约 500-600 bp。将扩增后的 PCR 产
物进行测序，得到序列（图 7），与 GenBank 数据
库中已知的序列进行比对，与草酸青霉组菌株 ITS
rDNA 序列同源性达 100%。根据对该菌株形态结构
ᵘ㚊㌆ ᗞᲦAvicel гਦ⚥ CMC
26-1
26-6
图 1 菌株 26-6 和 26-1 在不同平板上的降解能力
图 2 26-6 PDA 平板菌落形态 图 3 26-6 PDA 平板菌落背面
图 4 26-6 帚状枝（扫描电镜） 图 5 26-6 分生孢子（扫描电镜）
2013年第4期 105于俊杰等 ：复合木质纤维素酶菌株筛选及其培养条件优化
特征和 ITS rDNA 序列分析的结果，将该菌株最终鉴
定为草酸青霉组菌株，并命名为 Penicillium oxalicum
EH26-6。
2.3 发酵培养条件
2.3.1 碳源优化 本试验研究了不同碳源对草酸青
霉 EH26-6 分泌木质纤维素酶系的影响，结果见表 1。
其中以 2% 玉米芯为原料的效果最佳，木聚糖酶活
力达 142.81 IU/mL，与麸皮产酶培养基（4% 麸皮，1%
微晶纤维素，1% 木聚糖）摇瓶发酵产酶结果相当，β-
葡萄糖苷酶活力达 0.77 IU/mL，FPA 0.47 IU/mL。
M 1 2 3 4
AGGGATCCATACCTGATCCGAGGTCAACCTGGTTAAGATTGATGGTGTTCGCCGG
CGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCG
GACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGGAAGCGGGGGGCGAGAGCC
CAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGG
AATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAAT
TCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCG
TTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGTCAAGTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAG
TTCGTTTGTGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCGT
GAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCC
AGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAC
GATTTTTTACTT
M ：Marker DL2000 ；1-4 ：ITS rDNA 的 PCR 扩增产物
图 6 EH26-6 ITS rDNA 片段电泳分析
图 7 26-6 ITS rDNA 测序结果
表 1 培养基碳源优化发酵产酶及菌体生长情况
碳源 FPA（IU/mL） 木聚糖酶（IU/mL） β-葡萄糖苷酶（IU/mL） 可溶性蛋白（mg/mL） 菌体生长情况
玉米芯 2% 0.47 142.81 0.77 0.41 浓厚
麸皮 2% - 38.88 0.69 0.28 浓厚
微晶 2% 0.36 51.40 - 0.20 较浓厚
葡萄糖 2% - 7.83 - 0.09 较稀薄
CMC 2% - 7.56 - 0.07 稀薄
甘油 2% - 5.01 - 0.05 较稀薄
“-”表示未列出的数据（测得值偏小不在酶活准确计算范围）
2.3.2 氮源对发酵产酶的影响 本试验以无机氮硫
酸铵为速效氮源以满足发酵初期菌体的快速生长，
而有机氮源含有利于菌体生长的生长因子，因此在
此基础上选取玉米浆干粉等有机氮源进行发酵产酶
的影响研究。结果（图 8）显示，酵母膏为有机氮
源时有利于可溶性蛋白的表达分泌而其产木质纤维
素酶的效果最差，因此不利于酶的诱导合成 ；蛋白
胨与胰蛋白胨作用效果相当，但均低于玉米浆干粉
为有机氮源时的酶活力 ；以玉米浆干粉为有机氮源
时菌体产酶效果最佳，FPA、木聚糖酶活力、β-葡
萄糖苷酶活力分别达到 1.16、204.10 和 1.14 IU/mL。
这可能是由于玉米浆干粉含有微生物生长繁殖必须
具备的氨基酸成分，可以促进菌丝体的生长，同时
还含有促进菌丝体产酶的成分。
2.3.3 温度对发酵产酶的影响 分别于不同温度下
培养 EH26-6 后测定其酶活，结果（图 9）显示，随
温度的升高滤纸酶活（FPA）、木聚糖酶活逐增加，
30℃时 FPA 达到 0.55 IU/mL，32℃木聚糖酶活达到
最大值（214.03 IU/mL），随后由于温度过高菌体过
早老化，酶活力下降。而 β-葡萄糖苷酶活力随温度
的升高逐渐降低，26℃时最高（1.42 IU/mL），因此
低温有利于该菌株 β-葡萄糖苷酶的产生。参照总酶
活 FPA 及木聚糖酶活力最终确定 30℃为最适发酵
温度。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期106
Corn steep powder
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
FP
A
(I
U
/m
L)
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
xy
la
na
se
(I
U
/m
L)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
β-
gl
uc
os
id
as
eIU
/m
L
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
So
lu
bl
e
pr
ot
ei
ns
mg
/m
L
Peptone Yeast Extract Tryptone Corn steep powder Peptone Yeast Extract Tryptone
Corn steep powder Peptone Yeast Extract Tryptone Corn steep powder Peptone Yeast Extract Tryptone
图 8 不同有机氮源对发酵产酶的影响
0.55
0.50
0.45
0.35
FP
A
IU
/m
L
Tć26 28 30 32 34
0.40
220
200
180
160
140
120
100
40
X
yl
an
as
eIU
/m
L
Tć26 28 30 32 34
80
60
1.4
1.2
1.0β-
gl
uc
os
id
as
eIU
/m
L
Tć26 28 30 32 34
0.8
0.95
0.90
0.85
0.75
0.65
So
lu
bl
e
pr
ot
ei
ns
IU
/m
L
Tć26 28 30 32 34
0.80
0.70
0.60
图 9 温度对发酵产酶的影响
2013年第4期 107于俊杰等 ：复合木质纤维素酶菌株筛选及其培养条件优化
2.3.4 pH 对发酵产酶影响 本试验考察了不同的发
酵培养基初始 pH 对发酵产酶的影响，以确定发酵
产酶的最佳初始 pH 条件。结果（图 10）显示，pH
为 5.0 时更有利于各组分酶的合成分泌，FPA、木
聚糖酶、β-葡萄糖苷酶达到最高值，分别为 0.51、
169.58 和 0.97 IU/mL。当 pH 为 4.0、4.5 时，因前期
pH 偏低抑制菌体生长从而延长了发酵周期，进而影
响发酵产酶。当 pH 高于 5.0 时，随着 pH 值的升高，
酶活开始下降，这与霉菌在酸性条件下有利于产生
纤维素酶是一致的。
0.7
0.6
0.4
0.5
0.2
0.1
0.0
FP
A
IU
/m
L
pH
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
0.3
200
180
160
140
120
100
40
20
X
yl
an
as
eIU
/m
L
pH
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
80
60
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
β-
gl
uc
os
id
as
eIU
/m
L
pH
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
0.2
0.0
1.2
1.0
0.6
0.2
So
lu
bl
e
pr
ot
ei
ns
IU
/m
L
pH
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
0.8
0.4
0.0
图 10 初始 pH 对发酵产酶影响
2.3.5 接种量 接种量过小，菌体适应期长，进而
使产酶周期延长，酶活偏低 ；但接种量过大，菌体
生长过快，发酵液中的营养物消耗过快且溶氧量减
少，使得后期菌丝体营养不足，生长受到抑制，进
而导致纤维素酶活降低［16］，据此考察了接种量对发
酵产酶的影响。结果（图 11）表明，随着接种量的
增加滤纸酶和木聚糖酶活力呈增加趋势，达到 10%
时开始趋于平稳，此时 FPA 为 0.67 IU/mL、木聚糖
酶活力为 259.76 IU/mL。且接种量过大还会增加生
产成本，因此接种量 10% 为最佳接种量。
3 讨论
EH26-6 培养条件优化的结果表明，玉米芯为唯
一碳源时有利于菌体生长及各组分酶的分泌表达，
2 4 6 8 10 12 14 16 18
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
FPA Xylanase
Inoculation volume%
FP
A
IU
/m
L
0
50
100
150
200
250
300
350
X
yl
an
as
e
IU
/m
L
图 11 接种量对发酵产酶的影响（装液量 30 mL）
尤其是木聚糖酶的合成分泌 ；微晶为碳源时 FPA 比
酶活最高 ；据文献报道，玉米芯有利于 β-葡萄糖苷
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期108
酶的生产［17］，同时玉米芯中某些成分对木聚糖酶也
有一定的促进作用［18］。王晓芳等［19］的研究表明，
结构较为完整的微晶纤维素对酶的诱导活性优于其
它碳源类物质。但微晶纤维素作为一种具有纤维素
结晶区的纤维质原料还有一定的局限性，生产成本
高于玉米芯等原料。麸皮含有蛋白质、木聚糖、淀
粉等多种营养成分，为菌株培养提供生长因子，并
诱导菌体产生木聚糖酶［20］和 β-葡萄糖苷酶。在纤
维素酶发酵生产时，易于利用的降解代谢产物能引
起降解物阻遏效应，阻遏纤维素酶的生物合成。据
文献［21］报道，在纤维素筛选平板中加入甘油等易
代谢碳源，可使原本能产生透明圈的菌株丧失产圈
能力。葡萄糖和甘油以及麸皮中的淀粉为易于利用
的降解代谢产物，因此它们对纤维素酶诱导合成可
能有一定的抑制作用。由菌体生长情况，玉米芯和
麸皮为碳源时菌体生长良好，这可能与玉米芯和麸
皮除了具有一定的诱导作用外还含有相对较多的可
以供菌体生长所利用的营养成分有关。微晶、葡萄
糖、CMC 及甘油因成分单一不能提供足够的利于菌
体生长的生长因子。因此以玉米芯为碳源时更有利
于 EH26-6 菌株在该条件下发酵生产复合木质纤维
素酶，而且这种廉价碳源也有利于工业化生产。
Li 等［22］通过响应面优化法确定了菌株 Penicill-
ium oxalicum ZH-30 高效产木聚糖酶的最优条件 ：
麸皮 35.6 g/L，pH7.72，培养时间为 142.3 h。在最
适条件下最高木聚糖酶活力达到 14.50 IU/mL。Liao
等［23］研究表明，麦秸秆为 Penicillium oxalicum GZ-2
最佳诱导碳源，30℃发酵培养 7 d 得到最高木聚糖
酶 活 力（115.2 IU/mL） 和 β-葡 萄 糖 苷 酶 活 力（89
mU/mL）。由试验结果，EH26-6 能够生产较高的木
聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和 FPA，同时根据筛选平板
结果判定 EH26-6 还具有一定的葡聚糖外切酶和内
切酶生产能力，因此该菌株能够生产复合木质纤维
素酶并具有一定的优势。Pallavi 等［24］认为木聚糖
酶的生产过程中其单糖的诱导作用较双糖和寡糖相
对较低，木聚糖是木聚糖酶生物合成的诱导剂，因
为它能够在酶解过程中释放出单糖、双糖和大部分
的低聚寡糖，其他研究也有相似的报道［25-27］。在
Pallavi 等［24］研究中，以一种碱处理的植物（银胶
菊 属 Parthenium sp.） 为 底 物， 突 变 株 Penicillium
oxalicum SAUE-3.510 在 30℃条件下培养 6 d 时木聚
糖酶活力达到最大值 475.2 IU/mL，与以燕麦木聚糖
为底物时生产木聚糖酶活力相当。本研究以 2% 玉
米芯为底物时得到了相似的结论，因此该菌株能够
利用廉价的农业废弃物生产复合木质纤维酶，能够
降低酶液的生产成本，具有一定的应用潜力。
4 结论
从土壤样品中筛选到一批降解木质纤维素菌株。
通过玉米芯富集培养基富集培养初筛平板初筛、筛
选平板点样进一步筛选、摇瓶复筛验证筛选得到一
株产木质纤维素酶系较全的真菌 26-6。该菌经过在
PDA 平板上的菌落形态观察、孢子扫描电镜（FEI
Quanta 200）观察以及 ITS 序列基因片段分析，初步
鉴定为草酸青霉组菌株，命名为 Penicillium oxalicum
EH26-6。随后对菌株的摇瓶发酵条件进行研究，当
碳源为玉米芯，有机氮源为玉米浆干粉，pH5.0，温
度 30℃，接种量为 10% 时更有利于木质纤维素酶的
合成分泌。
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（责任编辑 马鑫）