全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-06-09
基金项目 : 国际先进农业科学与技术项目（农业部“948”项目）（2011-Z09）, 农业部农村能源综合建设项目（2130138-018）, 中国农业科
学院作物科学研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资助项目（2060302-13）
作者简介 : 王智 , 男 , 博士研究生 , 研究方向 : 生物质能源 ; E-mail:wz116280@sina.com
通讯作者 : 顿宝庆 , 男 , 博士 , 副研究员 , 研究方向 : 生物质能源 ; E-mail:baoqingdun9@hotmail.com
糖化酶、木聚糖酶融合蛋白在毕赤酵母中的高效表达
王智1 顿宝庆1 顾金刚3 赵萱1,2 田谷1,2 路明1 李桂英1
（1中国农业科学院作物科学研究所 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程 中国农业科学院生物质能源研究中心，北京 100081 ；
2东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030 ；3中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
中国农业微生物菌种保藏管理中心，北京 100081）
摘 要： 通过 RT-PCR 方法，以埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）总 RNA 为模板，克隆出糖化酶（glucoamylase，amyA）
基因的成熟肽编码序列（1 857 bp），编码 618 个氨基酸；以类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）H10-3 基因组 DNA 为模板，克隆出木聚糖酶
（xylanase A，xynA）基因的成熟肽编码序列（636 bp），编码 211 个氨基酸。通过重叠延伸 PCR（SOE-PCR）得到拼接片段 amyA-l-
xynA，并将其克隆到毕赤酵母表达载体 pPIC9 中，得到重组质粒 pPIC9-amyA-l-xynA，重组质粒线性化后经电击转化到毕赤酵母（Pichia
pastoris）GS115 中，得到了表达成功的工程菌 ALX2。在 ALX2 发酵上清液中同时检测到糖化酶活性（10.7 U/mL）和木聚糖酶活性
（51.8 U/mL）。
关键词： 糖化酶 木聚糖酶 融合表达 毕赤酵母
Fusion Expression of Glucoamylase and Xylanase in Pichia pastoris
Wang Zhi1 Dun Baoqing1 Gu Jingang3 Zhao Xuan1,2 Tian Gu1,2 Lu Ming1 Li Guiying1
（1The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement of Institute of Crop Sciences，Chinese Academy of Agricultural
Sciences，Beijing 100081 ；2College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030 ；3Agricultural Culture Collection of
China，Institute of Agricultural Resources and Agricultural Divisions，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: The mature peptide coding sequence of glucoamylase (amyA) gene was amplified by RT-PCR from Talaromyces emersonii
total RNA extracts. The result showed that the mature peptide sequence of amyA was consisted of 1 857 bp, and encoded 618 amino acids. The
xylanase (xynA) gene was amplified from Paenibacillus sp. H10-3 total DNA extracts. The result showed that the mature peptide sequence of
xynA was consisted of 636 bp, and encoded 211 amino acids. Then the mature peptide sequence of amyA gene, sequence of linker and sequence
of xynA gene were spliced by overlap extension PCR (SOE-PCR), by which amyA-l-xynA was obtained. The fusion gene was then inserted into a
Pichia pastoris expression vector pPIC9 to produce the recombinant expression plasmid pPIC9-amyA-l-xynA. By electric shocks, we successfully
transformed the recombinant pPIC9-amyA-l-xynA into Pichia pastoris GS115, and ALX2 was obtained. The maximum yield of the recombinant
glucoamylase and xylanase in ALX2 culture medium were 10.7 U/mL and 51.8 U/mL, respectively.
Key words: Glucoamylase Xylanase Fusion expression Pichia pastoris
在酿酒行业中，作为原料的粮食的淀粉层外围
有纤维素和木聚糖等半纤维素的包围，从而影响到
对淀粉的利用率。目前，对纤维素酶的利用研究较多，
而半纤维素酶的应用尚处于初级阶段。利用木聚糖
酶作用于半纤维素层，降低物料黏度，可以有利于
淀粉酶作用于淀粉层，提高淀粉利用率，增加乙醇
的产率。
糖 化 酶， 又 称 葡 萄 糖 淀 粉 酶（glucoamylase，
EC3.2.1.3），能水解淀粉的非还原性末端，水解 α-1,4-
葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解 α-1,6- 葡萄
糖 苷 键， 转 化 为 葡 萄 糖［1］。 木 聚 糖 酶（xylanase，
EC3.2.1.8）通过水解木糖分子 β-1,4- 糖苷键，将木
聚糖水解为木寡糖等低木聚糖，及少量木糖和阿拉
伯糖，在能源、生物转化、造纸纺织、食品、饲料、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期84
医药等行业中有着广泛的应用［2,3］。
蛋白质融合技术在现代生命科学中扮演越来越
重要的角色，对于普通蛋白间的融合，SOE 最为简
便、经济且高效。大量研究表明，在蛋白质头尾相
连融合时，在融合蛋白之间添加适当的连接肽可保
证两融合单位相对独立的折叠，使各单位相对独立
地发挥功能［4］。迄今，最常用的柔性连接肽序列
为［GGGGS］n（n ≤ 6），其广泛应用于多功能融合
蛋白的构建［5］。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是
20 世纪 80 年代初被开发和研制的一种新型酵母表
达系统。近年来，由于具有高表达、高稳定、生长
繁殖迅速、工艺简单、生产成本低等优点，越来越
受到人们的重视并被广泛应用［6］。
本研究从埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）
克隆到糖化酶（glucoamylase, amyA）基因的成熟肽
编码序列，从类芽孢杆菌克隆到木聚糖酶（xylanase
A，xynA）基因全长编码序列，通过重叠 PCR 方法
以连接肽将两个基因进行拼接，将得到的融合基因
片段插入到毕赤酵母表达载体 pPIC9 中，电击转化
成功将带有融合基因的表达质粒转入毕赤巴斯德酵
母（Pichia pastoris）GS115，在细胞培养液上清中同
时检测糖化酶和木聚糖酶活性，并实现糖化酶 - 木
聚糖酶双功能融合酶分泌表达。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 和 载 体 类 芽 孢 杆 菌（Paenibacillus
sp.）H10-3 购自中国农业微生物菌种保藏管理中心
（ACCC）。 埃 默 森 篮 状 菌（Talaromyces emersonii）、
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、毕赤酵母（Pichia
pastoris）GS115，表达载体 pPIC9，为实验室保藏。
载体 pGEM-T easy，购自 Promega 公司。
1.1.2 培养基 大肠杆菌 LB 培养基，参照分子克
隆实验指南配制。酵母生长培养基 YPD，选择培
养基 MD 和 MM，诱导表达培养基 BMGY 和 BMMY
均根据 Invitrogen 公司毕赤酵母表达系统操作手册
配制。
1.1.3 主要酶和试剂 试验所用的各种限制性核酸
内 切 酶 购 买 自 NEB 公 司。DNA 回 收 试 剂 盒、RT-
PCR 试剂盒和 Ex Taq DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司。
T4 DNA 连接酶购自 Promega 公司。细菌基因组 DNA
试剂盒为天根公司产品。
1.2 方法
1.2.1 糖化酶基因的克隆 参照 GenBank 中已经发
表的糖化酶基因 amyA（AJ304803.1）的全基因编码
序列设计上游引物 A1：5-ATGGCGTCCCTCGTTG-3；
下 游 引 物 A2 ：5-TCACTGCCAACTATCGTCAA-3。
PCR 扩增引物由上海生工生物技术有限公司合成，
此对引物理论扩增 1 857 bp 的序列。
以抽提出的 Talaromyces emersonii 总 RNA 为模
板，用 oligo-dT 引物进行反转录，并用 A1、A2 为引
物进行特异性扩增，获得 amyA 基因的成熟肽序列。
PCR 反应程序为 ：94℃ 5 min ；94℃ 50 s，56℃ 45 s，
72℃ 2 min，25 个循环 ；72℃延伸 10 min。取 PCR
产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，用 DNA 回收试
剂盒纯化回收 PCR 产物。
1.2.2 木聚糖酶基因的克隆 参照 GenBank 中已经
发表的木聚糖酶基因 xynA（DQ869568.1）的全基因序
列 设 计 上 游 引 物 X1 ：5-ATGATTAAGTCTAAAAA
G-3 ；下 游 引 物 X2 ：5-TTACCACACCGTTACGTTA
G-3。此对引物理论扩增 636 bp 的序列。
以抽提出的类芽孢杆菌基因组 DNA 为模板，并
用 X1、X2 为引物进行特异性扩增，获得 xynA 基因
的全长序列。PCR 扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 40 s，
56℃ 45 s，72℃ 40 s，扩增 25 个循环 ；72℃延伸 10
min。取 PCR 产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，用
DNA 回收试剂盒纯化回收 PCR 产物。
1.2.3 amyA 和 xynA 基因鉴定 将 amyA 电泳回收
产物分别与 pGEM-T easy 载体进行连接反应，22℃
反应 2 h 后，再将连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感
受态细胞，在含有氨苄青霉素的 LB 琼脂糖平板培
养基上培养 16 h，挑取白斑菌落进行 PCR 扩增，将
PCR 产物进行电泳检测，将正确的阳性克隆接种于
含有氨苄青霉素的 LB 培养基，37℃振荡培养 12 h，
按天根质粒提取试剂盒说明提取质粒，送上海生工
生物工程技术服务有限公司进行双向测序，对测序
结果进行 BLAST 比较。xynA 采用同样方法鉴定。
1.2.4 融合基因 amyA-l-xynA 的重叠延伸 PCR 设
2012年第1期 85王智等 ：糖化酶、木聚糖酶融合蛋白在毕赤酵母中的高效表达
计加入的 linker 序列为（GGGGS）3，G ：甘氨酸 ；S ：
丝氨酸。加入的氨基酸序列 GGGGSGGGGSGGGGS，
翻译成酵母偏爱的密码子的核苷酸序列为 ：GGTGG
CGGAGGGTCTGGTGGCGGAGGGTCCGGTGGCGGAG
GGTCA。设计重叠延伸 PCR 引物，并且在 F1 和 F4
分 别 加 入 酶 切 位 点 SnaB Ⅰ 和 Avr Ⅱ。 引 物 ：F1 ：
5-TTTTACGTAATGGCGTCCCTCGTTG-3，下划线部
分为 SnaB Ⅰ酶切位点；F2：5-TGACCCTCCGCCACCG
GACCCTCCGCCACCAGACCCTCCGCCACCCTGCCAA
CTA- 3，下划线部分为 linker 的互补序列；F3：5-GGT
GGCGGAGGGTCTGGTGGCGGAGGGTCCGGTGGCGG
AGGGTCAATGATTAAGT-3，下划线部分为 linker 序
列 ；F4 ：5-TTCCTAGGTTACCACACCGTTACG-3，
下划线部分为 Avr Ⅱ酶切位点。
引物设计原理如图 1 所示。将第 2 次得到的
PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后用 DNA 回
收试剂盒进行回收纯化。
1.2.7 毕赤酵母的转化与筛选 参照 Invitrogen 公司
毕赤酵母表达系统操作手册。
1.2.8 重组毕赤酵母的诱导表达 参照 Invitrogen 公
司毕赤酵母表达系统操作手册。
1.2.9 糖化酶、木聚糖酶酶活的测定 采用葡萄
糖氧化酶 - 过氧化物酶法测定重组菌株的糖化酶活
力［7］。定义 40℃作用于 2％可溶性淀粉 1 h，生成
1 mg 葡萄糖的酶量为一个糖化酶活力单位（U）。
采用 DNS 定糖法测定木聚糖酶的活力［8］。木聚
糖酶的活力定义为 ：每分钟产生 1 μmol 木糖所需的
酶量为一个酶活力单位，以 U 表示。
2 结果
2.1 amyA基因的克隆及测序鉴定
提取 Talaromyces emersonii 总 RNA，通过 RT-
PCR 扩增，取 PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，
可 见 在 2 000 bp 附 近 有 一 条 特 异 带， 与 预 期 的
1 857 bp 相符（图 2）。将糖化酶基因的 PCR 产物
经 纯 化 回 收 后， 与 克 隆 载 体 pGEM-T easy 连 接，
转化大肠杆菌 DH5α 后进行菌落 PCR，选择 PCR
检测为阳性的菌液进行双向测序，得到 1 857 bp
的核苷酸序列，含有一个完整的阅读框，编码 618
个氨基酸，读码框完整。与 GenBank 中注册的糖
化 酶 基 因 进 行 比 较 发 现， 该 序 列 与 Talaromyces
emersonii 糖 化 酶 amyA 基 因 序 列 相 似 性 为 100%
（AJ304803.1）。
图 1 重叠延伸 PCR 引物设计原理
1.2.5 融合基因 amyA-l-xynA 的克隆及鉴定 参照
1.2.3 的方法进行克隆及鉴定，挑取阳性克隆进行双
向测序，并对测序结果和目的序列进行比较。
1.2.6 amyA-l-xynA 毕赤酵母表达载体的构建 amy
A-l-xynA 和表达载体 pPIC9 分别用 SnaB Ⅰ和 Avr Ⅱ
进行双酶切，酶切产物经电泳分离和凝胶回收后，
用 T4 DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌 DH5α 感受态
细胞中 , 涂布含氨苄青霉素抗性的 LB 平板培养过夜，
用 PCR 方法鉴定阳性重组子，抽提质粒，酶切、测
序验证，得到正确的重组质粒命名为 pPIC9-amyA-l-
xynA。
M.DL2000 Marker ；1.amyA 基因的 PCR 扩增产物
图 2 amyA 基因的 PCR 扩增结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期86
2.2 xynA基因的克隆及测序鉴定
提取类芽孢杆菌基因组 DNA，通过 PCR 扩增，
取 PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，可见在 500-
750 bp 有一条特异带，与预期的 636 bp 相符（图 3）。
将木聚糖酶基因的 PCR 产物经纯化回收后，与 pGEM-
T easy 连接，转化大肠杆菌 DH5α 后进行菌落 PCR，
选择 PCR 检测为阳性的菌液进行双向测序，得到
636 bp 的核苷酸序列，含有一个完整的阅读框，编码
211 个氨基酸，读码框完整。与 GenBank 中注册的
木聚糖酶基因进行比较发现该序列与类芽孢杆菌木
聚糖酶基因序列相似性分别为 100%（DQ869568.1）、
82%（DQ100299.1）、82%（DQ100298.1），与枯草芽
孢杆菌木聚糖酶基因序列相似性分别为 80%（AL009
126.3）、80%（DQ100307.1）。
2.3 融合基因amyA-l-xynA的克隆及测序鉴定
所用方法同 2.2。菌落 PCR 检测，琼脂糖凝胶
2.5 毕赤酵母的转化与筛选
将 重 组 质 粒 pPIC9-amyA-l-xynA 用 Bgl Ⅱ 酶 切
线性化后回收，电转化至毕赤酵母 GS115 感受态细
胞中［9］。利用 MD 培养基和 MM 培养基对重组子进
行初筛，将初筛得到的重组子进行诱导表达，采用
测定木聚糖酶活性的方法进行复筛，得到目标重组
子 ALX2。
2.6 重组菌株分泌表达蛋白酶活的测定
挑取筛选到的重组子 ALX2 的单菌落，接种于
20 mL 的 BMGY 培养基中，于 30℃、300 r/min 条件
M.DL2000 Marker ；1.xynA 基因的
PCR 扩增产物
图 3 xynA 基因的 PCR 扩增结果
电泳出现一条约 2 500 bp 条带，与预期的片段大小
相符（图 4），选取 PCR 检测为阳性的菌液进行双向
测序，得到 2 535 bp 的核苷酸序列，含有 amyA 基
因序列（去除了终止密码子）、linker 序列以及 xynA
基因的成熟肽编码序列。测序结果与目的序列进行
比较，相似性为 100%，证明重叠延伸片段正确。
2.4 pPIC9-amyA-l-xynA重组表达载体的构建
将 amyA-l-xynA 的 PCR 产物与毕赤酵母表达载
体 pPIC9 同时进行 SnaB Ⅰ和 Avr Ⅱ双酶切，纯化回
收后构建重组质粒 pPIC9-amyA-l-xynA（图 5），转化
大肠杆菌 DH5α，PCR 筛选结果显示，以 AOX 引物
能扩增出相应序列。重组质粒经 SnaB Ⅰ和 Avr Ⅱ双
酶切，电泳出现两条带 ：其中一条为载体质粒，约
8 000 bp，另一条为 amyA-l-xynA 片段，约 2 500 bp（图
5）。测序结果表明重组质粒含有目的基因片段，且
读码框正确。
M.DL2000 Marker ；1.amyA-l-xynA 的
PCR 扩增产物
图 4 amyA-l-xynA 的 PCR 扩增结果
M.DL15000 Marker ；1.pPIC9-amyA-l-xynA ；
2.SnaB Ⅰ和 Avr Ⅱ双酶切 pPIC9-amyA-l-xynA
图 5 重组质粒 pPIC9-amyA-l-xynA 酶切鉴定
下培养至 OD600=2.0-6.0 ；室温下离心收集菌体，用
50 mL BMMY 培养基重悬菌体，30℃、300 r/min 继
续培养，每 24 h 向培养基中添加 100% 甲醇至终浓
度为 0.5%-1.0% 诱导表达。
收集 ALX2 培养液，离心取上清，采用葡萄糖
氧化酶 - 过氧化物酶法测定糖化酶活，检测到糖化
酶活力最高为 10.7 U/mL。
收集 ALX2 培养液，离心取上清，以 1% 的木
聚 糖 为 底 物， 采 用 DNS 法 在 40 ℃、pH5.0、 波 长
550 nm 的条件下测定木聚糖酶活，检测到木聚糖酶
活力最高为 51.8 U/mL。
2012年第1期 87王智等 ：糖化酶、木聚糖酶融合蛋白在毕赤酵母中的高效表达
3 讨论
近年来，蛋白质融合技术在生物领域中的应用
愈来愈广泛，主要体现在以下 3 个方面。一是构建
重组融合蛋白，提高目标蛋白的表达量及其可溶性，
融合纯化标签有利于蛋白的快速纯化 ；二是通过不
同蛋白（或蛋白结构域）间的融合，获得双（或多）
功能蛋白、功能特异的抗体、双价抗体或多价抗体；
三是通过目的蛋白与细胞表面蛋白的融合表达而发
展成为表面展示技术。蛋白质的融合技术有两种 ：
基于基因融合的蛋白质间接融合和蛋白质直接融合。
蛋白质间接融合是基于基因融合的技术体系，即先
融合各单位编码基因而获得融合基因，再选择合适
的宿主表达相应融合蛋白，其中的关键为基因融合
技术。当前主要有两种基因融合技术 ：一是基于连
接酶的基因融合，二是基因重叠延伸技术（splicing
by overlap extension，SOE）。基因重叠延伸技术 SOE
是运用最广泛的基因融合技术，由 Horton 等［10］发明。
相比基于连接酶的融合方法，SOE 的突出优点是不
会在融合基因中引入任何额外氨基酸残基，也不需
要对基因的连接方向进行鉴定。
迄今有许多融合蛋白由头尾相连技术构建得
到［11,12］。以此方式融合的蛋白需要在两者之间插入合
适的连接肽，以保证各融合单位能相对独立的折叠，
获得较好的双功能融合蛋白［4］。柔性肽［GGGGS］ n
（n ≤ 6）和刚性 α- 螺旋肽［EAAAK］n（n ≤ 6）是
最常用的两类连接肽，两者广泛应用于多功能融合
蛋白和抗体工程的构建。连接肽氨基酸残基组成和
长度对融合蛋白的功能有明显的影响［4］。相对较长
并具较好柔性的连接肽，更能使融合蛋白的两部分
结构域保持结构上的独立，从而保证融合蛋白具有
较好的双功能特性。但是，连接肽过长会增加连接
肽部分对蛋白酶的敏感性，导致融合蛋白不稳定 ；
过短则往往使融合蛋白的亲本结构域之间过于接近，
从而影响各自的功能［13］。当然，连接肽的长短主要
取决于融合蛋白空间结构等特性［14］。
毕赤酵母表达系统是目前生产重组基因工程产
品中最常用的表达系统之一，其所得产物可以完全
分泌到培养基中，从而简化分离纯化步骤，节约成
本［6］。研究发现，糖化酶和木聚糖酶单独在乙醇
发酵试验中均能有效提高淀粉利用率，提高乙醇产
量［15］；而且 Monfort 等［16］的研究表明，糖化酶和
木聚糖酶的协同作用，优于单酶作用的相加效果。
本试验利用基因重组技术，将糖化酶、木聚糖酶融
合基因 amyA-l-xynA 整合至毕赤酵母基因组，并成
功实现了糖化酶 - 木聚糖酶双功能融合酶在毕赤酵
母中的分泌表达，为提高淀粉利用率进而降低生产
成本奠定基础。
4 结论
本试验分别克隆获取埃默森篮状菌（Talaromyces
emersonii）糖化酶基因序列和类芽孢杆菌（Paeniba
cillus sp.）H10-3 木聚糖酶基因序列，通过重叠延伸
PCR 得到糖化酶 - 木聚糖酶融合基因，并成功实现
了糖化酶 - 木聚糖酶双功能融合酶在毕赤酵母中的
分泌表达，发酵上清液糖化酶和木聚糖活性分别达
到 10.7 U/mL 和 51.8 U/mL。
参 考 文 献
［1］ Eksteen J, Van Rensburg P, Cordero Otero R, Pretorius IS. Starch
fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae strains
expressing the alpha-amylase and glucoamylase genes from Lipomyces
kononenkoae and Saccharomycopsis fibuligera. Biotechnology and
Bioengineering,2003,84（6）:639-646.
［2］ Bajpai P. Application of enzymes in the pulp and paper industry.
Biotechnology Progress,1999,15（2）:147-157.
［3］ Luttig M, Pretorius I, Zyl WH. Cloning of two beta-xylanase-encoding
genes from Aspergillus niger and their expression in Saccharomyces
cerevisiae. Biotechnology Letters,1997,19（5）:411-415.
［4］ Crasto CJ, Feng J. LINKER: a program to generate linker sequences
for fusion proteins. Protein Engineering,2000,13（5）:309-312.
［5］ Wang WWS, Das D, McQuarrie SA, Suresh MR. Design of a
bifunctional fusion protein for ovarian cancer drug delivery: single-
chain anti-CA125 core-streptavidin fusion protein. European Journal
of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,2007,65（3）:398-405.
［6］ Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR. Recombinant protein
expression in Pichia pastoris. Molecular Biotechnology,2000,16
（1）:23-52.
［7］ 李海燕 , 毛爱军 , 何永志 , 董志扬 . 黑曲霉糖化酶和木聚糖酶基
因在工业用酿酒酵母中的共表达 . 菌物学报 ,2004（4）:494-501.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期88
［8］ Bailey MJ, Biely P, Poutanen K. Interlaboratory testing of methods
for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology,1992,23
（3）:257-270.
［9］ Becker DM, Guarente L. High-efficiency transformation of yeast by
electroporation. Methods in Enzymology,1991,194:182-187.
［10］ Horton RM, Hunt HD, Ho SN, et al. Engineering hybrid genes
without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap
extension. Gene,1989,77（1）:61-68.
［11］ Hong SY, Lee JS, Cho KM, et al. Assembling a novel bifunctional
cellulase-xylanase from Thermotoga maritima by end-to-end fusion.
Biotechnology Letters,2006,28（22）:1857-1862.
［12］ Trujillo M, Duncan R, Santi D. Construction of a homodimeric
dihydrofolate reductase-thymidylate synthase bifunctional enzyme.
Protein Engineering,1997,10（5）:567-573.
［13］ Gustavsson M, Lehti J, Denman S, et al. Stable linker peptides for a
cellulose-binding domain-lipase fusion protein expressed in Pichia
pastoris. Protein Engineering,2001,14（9）:711-715.
［14］ Remy I, Wilson IA, Michnick SW. Erythropoietin receptor activation
by a ligand-induced conformation change. Science,1999,283
（5404）:990-993.
［15］ James J, Simpson BK, Marshall MR. Application of enzymes in food
processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,1996,36
（5）:437-463.
［16］ Monfort A, Blasco A, Prieto JA, Sanz P. Combined expression of
Aspergillus nidulans endoxylanase X24 and Aspergillus oryzae
（alpha）-amylase in industrial Bakers yeasts and their use in
bread making. Applied and Environmental Microbiology,1996,62
（10）:3712-3715.
（责任编辑 马鑫）