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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(2):173-178
磷（P）是植物生长必需的矿物质元素之一，在
植物体内以多种方式参与植物体内的光合作用和生
理生化过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢具
有重要作用［1］。在我国，有 74% 的耕地土壤缺磷，
土壤中 95% 以上的磷为无效形式，植物很难直接
吸收利用［2］，且施入的磷肥当季作物利用率为 5%-
25%，大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+ 和Al3+ 结合，
形成难溶性磷酸盐［3］。
土壤微生物是土壤有机质转化的执行者，又是
植物营养元素的活性库［4］。土壤中能解磷的微生物
种类比较多，主要包括细菌、真菌和放线菌等［5］。
目前报道的具有溶解 Ca3（PO4）2 的菌株主要包括
芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、
克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）
和伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）等［6］。不同
的微生物解磷能力有较大的差异［7］，其溶磷量可达
142.1-643.2 μg/mL［3，7，9］。其作用途径大多是依靠
自身的代谢产物或与其他生物协同溶解土壤中的难
溶性磷素，提高土壤中磷素的利用效率，减少化学
肥料的施用量，对环境进行微生物修复，提高作物
产量。微生物的解磷机制复杂多样，因菌株的不同
而有所不同［8］。解磷细菌能够增加土壤有效磷含量，
有三种观点 ：第一种观点是产酸机制，目前被人们
广泛接受 ；第二种观点认为微生物的解磷作用主要
是由于在其代谢过程中分泌质子的缘故，使介质的
pH 值降低 ；第三种观点认为微生物的解磷过程是一
收稿日期 ：2014-06-10
作者简介 ：黄达明，男，教授，研究方向 ：农产品生物转化及综合利用 ；E-mail ：damingh@163.com
一株解磷细菌的筛选、鉴定及其溶磷培养条件的优化
黄达明 李倩 管国强 张志才 钱静亚 宋庆春
（江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013）
摘 要 ： 从土壤作物根际筛选分离出的一株解磷能力较强的溶磷菌 P0417，对其进行 16S rDNA 基因水平上的初步鉴定，测
定其溶解磷的能力，并对该菌的溶磷培养基条件进行优化。结果表明，经序列分析，确定该菌株 P0417 为洋葱伯克霍尔德氏菌。且
其溶磷能力与培养液 pH 呈显著相关性，当培养基条件为葡萄糖 10 g/L、草酸铵 0.5 g/L、NaCl 1.0 g/L 时，菌株 P0417 对 Ca3（PO4）2
盐培养基具有较好的解磷能力，其解磷能力可达 791.84 μg/mL。
关键词 ： 溶磷细菌 ；筛选 ；鉴定 ；条件优化 ；解磷能力
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.026
Selection，Identification and Medium Optimization of a Phosphate-
solubilizing Bacterium
Huang Daming Li Qian Guan Guoqiang Zhang Zhicai Qian Jingya Song Qingchun
（College of Food and Biology Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）
Abstract ： A phosphorus-dissolving bacterial strain P0417 was isolated from crop rhizosphere soil and identified by the genetic
identification of 16S rDNA, measuring capability of phosphate-solubilization and optimization of medium components here. The result
demonstrated that the bacterium was identified as Burkholderia cepacia. And the capacity of dissolving the phosphate was closely correlated with
the pH of its culture medium, the strain showed high phosphate-dissolving ability of 791.84 μg/mL in Ca3（PO4）2 culture medium at glucose, 10
g/L ；Ammonium oxalate, 0.5 g/L ；NaCl, 1.0 g/L.
Key words ： phosphorus-dissolving bacterial strains ；selection ；identification ；medium optimization ；phosphate-dissolving ability
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2174
个动态的分段过程［9］。
目前，有关溶磷微生物的分离，筛选和应用的
研究大都局限于农作物，在林木根际筛选和应用溶
磷微生物的报道极少。许多科学家分别从不同的方
面对微生物菌肥进行研究［10，11］，如进行高效解磷能
力菌株的分离、将不同种类微生物混合而研究其组
合效应等，所以筛选出具有高效溶磷能力的菌株显
得尤为重要。本研究对筛选自桂树根际土壤的溶磷
菌鉴定并进行溶解磷酸钙能力的测定，并对溶磷菌
的培养条件进行优化，旨在为开发利用林木根际溶
磷微生物资源及绿色无公害微生物肥料的生产提供
高效稳定的菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试土壤 供试土壤为黑色土壤，于 2013 年
9 月采样，采用五点采样法采集桂花树下根际粘附
的土壤，充分混合后分成 2 份 ：一份 4℃冷藏保存，
一份土样风干后过 2 mm 筛备用。
1.1.2 培养基 分离培养基（PKO 培养基）：葡萄糖
10 g，Ca3（PO4）2 10 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，
KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，
（NH4）2SO4 0.5 g， 琼 脂 粉 15 g，pH 值 7.0-7.2， 水
1 000 mL［Ca3（PO4）2 单独灭菌后加入］。保存培
养基（LB 培养基）：酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl
10 g，水 1 000 mL，琼脂 15 g。
1.1.3 溶磷菌株的筛选分离 称取 1 g 土样溶于 99
mL 无菌水中，振荡 30 min 后取上清液用 10 倍稀释
法分别配置 10-3、10-4、10-5、10-6 和 10-7 g/mL 的土
壤悬液，各取 0.1 mL 分别涂布到分离培养基上［12］，
28℃培养 10 d，观察出现溶磷圈的菌落，并将出现
溶磷圈的菌株利用平板划线法分离纯化后，4℃下保
存于 LB 斜面培养基中［13］。
1.2 方法
1.2.1 溶磷菌溶磷能力的测定
1.2.1.1 定性测定 溶磷圈法。将保存于 LB 培养
基中的菌株活化后，用无菌牙签接种于含磷酸钙的
PKO 固体培养基上，倒置于 28℃培养箱中培养 10 d，
记录溶磷圈直径（D）、菌落直径（d），并计算 D/d
值大小以初步确定菌株的溶磷能力。
1.2.1.2 定量测定 将菌株用 LB 液体培养基制成菌
悬液（浓度约为 109 cell/mL，即波长 660 nm，OD 值
1.0），按菌悬液与 PKO 液体培养基比例为 1∶100 接
种，即每 100 mL 培养基接菌悬液 1 mL，每菌株 3
次重复，以不接菌空白 PKO 液体培养基为对照。在
28℃，150 r/min 下摇床培养 5 d 后，取 2 mL 发酵液
4 000 r/min 离心 10 min，采用钼蓝比色法［12］测定上
清液有效磷含量，同时根据磷标准曲线［14］计算溶
磷量，并测定上清液 pH 值。
1.2.2 菌株的鉴定
1.2.2.1 菌株菌落特征观察及生理生化性质 将单
菌株接种 LB 培养基中进行活化培养，革兰氏染色观
察细菌形态，培养液经梯度稀释后涂布平板，30℃
倒置培养 24 h，观察菌落形态。采用《常用细菌系
统鉴定手册》进行初步菌株鉴定。
1.2.2.2 菌株的 16S rDNA 序列分析 利用菌体菌悬
液直接 PCR 扩增 16S rDNA，扩增引物采用细菌通
用引物 27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和
1492R（5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3），引物
购买于南京金斯瑞生物科技有限公司。PCR 反应体系
为（25 μL）：Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，10×PCR 缓
冲液 2.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，菌体 0.2 μL，引物
各 0.5 μL，去离子水 17.05 μL。PCR 扩增条件 ：95℃
5 min ；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1.5 min，共 32
个循环 ；72℃ 10 min。用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 扩
增产物进行检测，PCR 产物送至南京金斯瑞生物科
技有限公司测序后，测序结果提交 GenBank 中的
Blast 数据库进行同源性比对，经 Clustal 软件进行多
重序列比较后，利用 MEGA 5.0 软件进行系统发育
树的构建。
1.2.3 培养基的优化试验
1.2.3.1 碳源和氮源的筛选 在原有的 PKO 液体
培养基的基础上首先对碳源（葡萄糖、乳糖、可溶
性淀粉、麦芽糖）和氮源［（NH4）2SO4、草酸铵、
NaNO3、牛肉浸膏］进行筛选。菌株在 LB 斜面上
活化 24 h 后，按 1.2.1 方法制成菌悬液，按 1% 接
种量接种于各碳、氮源培养基，每组 3 次重复，于
28℃、150 r/min 摇床培养 5 d，以原 PKO 培养基不
接菌为对照测溶磷量。
1.2.3.2 培养基组成的优化 确定最好的碳氮源后，
2015,31(2) 175黄达明等：一株解磷细菌的筛选、鉴定及其溶磷培养条件的优化
设计了葡萄糖（5、10 和 15 g/L），草酸铵（0.1、0.5
和 1 g/L），NaCl（0.1、0.5 和 1 g/L） 的 3 因 素 3 水
平的正交试验对培养基进行优化。选用 L9（3
3）正
交组合进行试验，其因素水平见表 5。测定方法同
1.2.3.1。
2 结果
2.1 菌株的筛选
在无机磷固体培养基平板上涂板，结果（图
1）显示，平板上长满各种单菌落，且有的菌落产
生了溶磷圈，产生溶磷圈的大小大致可说明此溶磷
菌分解无机磷能力的强弱，从而可初步判断溶磷菌
溶磷能力［15］。经筛选，得到一株具有明显溶磷圈
（D/d ≥ 2.0）的溶磷菌，标记为 P0417。
酵过程中分泌了有机酸，溶磷量随之逐渐升高，且
在 120 h 时溶磷量达到 503.53 μg/mL，说明该菌在培
养 120 h 时的溶磷效果最佳。随后，pH 值具有升高
的趋势，溶磷量也随之降低。通过 Spss16.0 对数据
进行统计学分析发现，溶磷菌 P0417 的溶磷量与 pH
之间存在显著的负相关关系（r=-0.940，P<0.05），
当培养液酸度降到 pH5.58 时，才有大量磷释放出来。
图 1 菌株 P0417 溶磷圈的观察
2.2 溶磷菌溶磷能力的测定
2.2.1 定性测定 经溶磷圈法测定 D/d 值，在以磷
酸钙为磷源的培养基上出现了明显且较大的透明圈，
在培养第 10 天，菌落直径 d 为 7.0 mm，透明圈直
径 D 为 14.3 mm，D/d 值为 2.04，具有较强溶解难溶
性磷酸钙的能力。菌株特征见表 1。
表 1 菌株 P0417 在 LB 培养基上的菌落特征
菌株 来源 菌落特征 生长速度
P0417 桂花根际
粘附土壤
菌落小，圆形，黄色，不透明，
湿润，稍突起
较快
2.2.2 溶 磷 菌 溶 磷 能 力 的 定 量 测 定 供 试 菌 株
P0417 在接种 24 h 后开始测定菌液中可溶性磷含量
及 pH 值，然后每隔 24 h 测一次。结果（图 2）显
示，随着接种时间的延长，pH 值逐渐降低，可能发
0 24 48 72 96 120 144
0
100
200
300
400
500
600
4
5
6
7
8
9
pHⓦ⼧䟿/ μg·mL-1 ᰦ䰤/h
üƶü
—▼— pH
ⓦ⼧䟿
图 2 溶磷菌培养液中溶磷量与 pH 的关系
2.3 菌株的鉴定
2.3.1 菌株 P0417 的形态特征 菌株 P0417 在 LB
平板上 30℃培养 24 h，菌落呈黄色、圆形、光滑、
不透明，革兰氏染色呈阴性，菌体为短杆状（图 3）。
菌株淀粉水解试验、甲基红试验、V-P 试验、硝酸
盐还原试验及氧化酶试验呈阴性 ；吲哚试验和硫化
氢试验呈阳性 ；能利用乳糖、葡萄糖和麦芽糖 ；石
蕊牛奶试验产酸、胨化（表 2）。
A B
图 3 P0417 菌平板形态（A）及菌株革兰氏
染色（400×）（B）
2.3.2 菌株的 16S rDNA 序列分析 菌株 P0417 经
16S rDNA 扩增，其 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，
获得了约 1 500 bp 大小的片段。将 PCR 产物寄往南
京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果显示，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2176
所得基因片段为 1 377 bp，经 Blast 比对（表 3），并
构建系统发育树（图 4）可知，该菌株为洋葱伯克
霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia），将该序列提交
到 GenBank，登录号为 KJ020934。
表 3 溶磷菌 P0417 的 16S rDNA 及 ITS 基因的鉴定结果
菌株
GenBank 数据库中最接
近的亲缘关系
相似性 /% 登录号
P0417
（登录号 ：
KJ020934）
Burkholderia cepacia 99 KF681774.1
Burkholderia cenocepacia 99 KF826288.1
Burkholderia ambifaria 99 KF733685.1
Burkholderia vietnamiensis 99 KF114029.1
Burkholderia cepacia 99 AB681702.1
Burkholderia sp. 99 KC833503.1
Burkholderia seminalis 99 JN896363.1
综合正交试验（表 6）结果（表 7）的 K 值和
极差 R 大小与方差分析（表 8）可知，影响供试菌
P0417 溶磷量的主次顺序为 B>C>A，即氮源 >NaCl>
碳源，其中草酸铵含量为影响溶磷菌溶磷量的主要
因素，其次是 NaCl 含量，最后是葡萄糖含量。故本
试验对供试菌株的理论最优培养基配方为 A2B2C3，
即葡萄糖 10 g/L、草酸铵 0.5 g/L、NaCl 1.0 g/L。针
对该条件进行了补充试验，对优化培养配方接种活
化第 2 代供试菌株 P0417，同条件下培养，溶磷量
为 765.74 μg/mL，比原优化前培养液溶磷效果高。
证明通过培养基优化及正交试验，调整后的培养配
方更有利于该菌的溶磷效果。
表 4 不同碳源对溶磷菌 P0417 溶磷量的影响
碳源 /（10 g·L-1） 溶磷量 /（μg·mL-1）
葡萄糖 498.98
乳糖 232.65
可溶性淀粉 150.00
麦芽糖 80.61
表 5 不同氮源对溶磷菌 P0417 溶磷量的影响
氮源 /（0.5 g·L-1） 溶磷量 /（μg·mL-1）
（NH4）2SO4 506.12
草酸铵 587.75
NaNO3 25.51
牛肉浸膏 47.96
表 6 正交试验因素水平
水平
因素
A 葡萄糖 /（g·L-1） B 草酸铵 /（g·L-1） C NaCl/（g·L-1）
1 5 0.1 0.1
2 10 0.5 0.5
3 15 1.0 1.0
3 讨论
本试验从桂花树根际粘附土壤中分离筛选出
一 株 高 效 溶 磷 菌 株 P0417， 经 16S rDNA 序 列 分
析，结合生理特征，初步鉴定为洋葱伯克霍尔德
氏菌（Burkholderia cepacia），属于伯克霍尔德氏菌
（Burkholderia）类。该菌群是一种广泛存在于水、土
壤、植物和人体中的革兰氏阴性杆菌，因其可以产
生硝吡咯菌素、吩嗪、苯基吡咯等多种次生代谢产
物而被广泛应用于生物防治、促进植物生长、生物
表 2 菌株 P0417 的生理生化特征
试验项目 菌株 P0417 试验项目 菌株 P0417
乳糖利用 + 淀粉水解试验 -
葡萄糖利用 + 吲哚试验 +
麦芽糖利用 + 硝酸盐试验 -
氧化酶试验 - V-P 试验 -
硫化氢试验 + 石蕊牛奶试验 产酸、胨化
甲基红试验 -
注 ：“+”代表阳性 ；“—”代表阴性。
0.2
99
96
100
99
P0417
Burkholderia cepacia AB681702.1
Burkholderia cepacia AY741349.1
Burkholderia cepacia KF681774.1
Pseudomonas fluorescens KF864552.1
Pseudomonas fluorescens AY254172.1 Pseudomonas anguilliseptica DQ298026.1 Pseudomonadaceae JN571406.1
Burkholderia pseudomallei NZ GG704910.1
Burkholderia mallei DQ061984.1 96
图 4 P0417 的系统进化树
2.4 溶磷菌的优化培养
分别选用 10 g/L 的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉
和麦芽糖作为碳源，以不接菌原 PKO 培养基为空白
对照，培养 120 h 后计算得出溶磷菌发酵液溶磷量，
结果（表 4）表明，葡萄糖是溶磷菌生长最适合的
碳源。以 0.5 g/L 的（NH4）2SO4、草酸铵、NaNO3 和
牛肉浸膏作为氮源供溶磷菌发酵培养，表 5 可知草
酸铵能使溶磷菌达到较好的溶磷效果。
2015,31(2) 177黄达明等：一株解磷细菌的筛选、鉴定及其溶磷培养条件的优化
修复等农业领域［16］，展现了其在农业生产上良好的
应用前景。与此同时该菌又有一些种是人类的条件
致病菌［17］，在医院常污染自来水、体温表、医疗器
械等，造成医院内传播，导致各种疾病传染［18］。故
区分环境菌和人体致病菌以及该菌是否具有致病性，
这对应用于农业上的伯克霍尔德氏菌株进行风险评
估无疑是必要的。但目前为止还没有可行的方法区
分，借助细胞培养模型和动物模型的突变体分析将
是今后可行方法之一［19］。
关于伯克霍尔德氏菌的溶磷效果的研究少有
报道，李纪顺等［20］发现伯克霍尔德氏菌 B418 同
时可以刺激植物生长，固定大气中的氮，释放土壤
中被固定的磷等重要元素，证明其综合效果非常明
显。赵珂［21］分离出一株洋葱伯克霍尔德氏菌 YM3-
2S，在磷矿粉为唯一磷源时速效磷含量最高达 40.96
μg/mL。黄静［22］分离出一株植物内生洋葱伯克霍尔
德氏菌 M2S2，在磷酸钙磷源条件下显著增加了玉米
地上部、根部及总生物量。本试验在以 Ca3（PO4）2
作为唯一的磷源且培养基条件优化后该菌 P0417 溶
磷量最大为 791.84 μg/mL。
溶磷菌种类繁多，溶磷机制复杂［23］，但大多
数研究者认为，微生物的解磷作用主要取决于其分
泌有机酸量和种类，如柠檬酸、草酸、苹果酸、琥
珀酸和乳酸等［24］。如彭帅［25］分离出一株解磷荧光
假单胞菌能够产生葡萄糖酸，解磷量达 24.5 μg/mL。
本试验菌株 P0417 在接种 24 h 后开始测定菌液中可
溶性磷含量及 pH 发现，随着接种时间的延长，pH
值逐渐降低，溶磷量随之逐渐升高，说明发酵过程
中可能分泌了有机酸，菌株分泌有机酸的种类测定
是后续研究的主要内容之一。
4 结论
菌株 P0417 在以 Ca3（PO4）2 作为唯一的磷源
时溶磷量为 503.53 μg/mL，在培养基条件优化后溶
磷 量 最 大 为 791.84 μg/mL， 是 原 有 PKO 培 养 基 溶
磷量的 1.57 倍，推测溶磷机制可能是分泌了有机
酸，初步鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia
cepacia），可能是一株优良的非致病性溶磷菌株。
参 考 文 献
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表 7 L9（3
3）正交试验结果
序号 A 葡萄糖 /（g·L-1） B 草酸铵 /（g·L-1） C NaCl/（g·L-1） 溶磷量 /（μg·mL-1）
1 1 1 1 332.65
2 1 2 2 466.33
3 1 3 3 172.45
4 2 1 2 400.00
5 2 2 3 791.84
6 2 3 1 127.55
7 3 1 3 481.63
8 3 2 1 323.47
9 3 3 2 229.59
K1 323.81 404.76 261.22
K2 439.52 527.21 365.31
K3 344.90 176.53 481.97
R 115.71 350.68 220.75
最优水平 2 2 3
主次顺序 B ＞ C ＞ A
表 8 正交结果方差分析
方差来源 平方和 自由度 方差估计值 F 显著性
A 22903.564 2 11451.782 0.645 *
B 190062.552 2 95031.276 5.349 **
C 73175.014 2 36587.507 2.060 *
注 ：“*”为差异显著 ；“**”为差异极显著
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（责任编辑 马鑫）