全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第3期
收稿日期 ： 2013-09-20
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA06A204）
作者简介 ：罗洋，男，硕士研究生，研究方向 ：重金属污染农田土壤生物修复技术 ；E-mail: yluo@issas.ac.cn
通讯作者 ：滕应，男，博士，研究员，研究方向 ：土壤环境微生物生态与修复工程 ；E-mail: yteng@issas.ac.cn
随着工业化、城市化以及农业集约化的飞速发
展，土壤重金属污染已成为深受全球关注的环境问
题之一［1］。目前有关的治理方法按照工艺原理可归
纳为 3 类 ：物理 / 化学修复、生物修复和农业生态
修复［2］。生物修复尤其是植物 -微生物联合修复技
里氏木霉 FS10-C 固体发酵基质筛选及发酵条件初探
罗洋1，2 滕应2 刘方3 马文亭2 李振高2
（1. 贵州大学农学院，贵阳 550025 ；2. 中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室（南京土壤研究所），南京 210008 ；3. 贵州大学资源与
环境工程学院，贵阳 550025）
摘 要 ： 筛选适宜里氏木霉 FS10-C 菌株固体发酵的基质，并优化其发酵基本条件，以期为将该菌株应用于土壤重金属污染
修复中奠定基础。采用单因素试验对固体发酵基质进行筛选，在筛选结果的基础上，再运用正交试验设计初步确定适宜的发酵条件，
并在 50 L 固体发酵罐中进行放大试验。结果表明，桔皮麦麸混合物为木霉 FS10-C 的最佳发酵基质，优化后的平皿固体发酵条件
为：桔皮、麦麸按 1∶1 比例配伍，固水比为 1∶1.2，接种量为 5%，发酵温度为 28℃，发酵 14 d 后产孢量可高达 2.43×1010 CFU/g，
且应用于固体发酵罐中发酵效果良好，产孢量达到 1.44×1010 CFU/g。通过对固体发酵基质的筛选和发酵条件的优化，可实现木霉
FS10-C 的高密度培养，降低制剂成本，具有规模化生产的潜力。
关键词 ： 里氏木霉 FS10-C 固体发酵 发酵条件 生物修复剂
Screening of Solid Media and Optimization of the Fermentation
Conditions for Trichoderma reesei FS10-C
Luo Yang1，2 Teng Ying2 Liu Fang3 Ma Wenting2 Li Zhengao2
（1. Soil Science Agricultural College，Guizhou University，Guiyang 550025 ；2. Key Laboratory of Soil Environmentand Pollution Remediation
（Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences），Nanjing 210008 ；3. Resources and Environmental Engineering College，Guizhou
University，Guiyang 550025）
Abstract: In order to provide a foundation for the application of the Trichoderma reesei FS10-C on remediation of heavy metals-
contaminated soils, the solid fermentation substrate and the fermentation conditions were studied. The fermentation substrate was screened
through a single factor, then confirmed the appropriate fermentation conditions using a method of orthogonal combination and different factors. In
addition, an enlarge experiment was also carried out in a 50 L solid fermentation tank. The result showed that the mixture of orange peel and wheat
bran were deemed the best fermentation material for Trichoderma ressei FS10-C. The optimal conditions in plate as following ：the proportion
of orange peel to bran and solid material to water were 1∶1 and 1∶1.2 respectively, inoculum 5%, the temperature of fermentation was
28℃ . Under this optimal fermentation conditions, the spore number were up to 2.43×1010 CFU/g after 14 days, and the effect was satisfactory
when it had been applied to solid fermentation tank, the spore number were 1.44×1010 CFU/g. Through the screening of soild media and
optimization of the fermentation conditions, the cost of production was reduced, and FS10-C biomass through the optimization of fermentation
conditions was increased. The solid fermentation of FS10-C had the potential of mass production.
Key words: Trichoderma reesei FS10-C Solid fermentation Fermentation conditions Bioremediating inoculant
术以其良好的修复效果和生态效益逐渐成为国内外
研究的热点，其中用于该项技术的微生物主要包括
植物内生细菌、根际细菌和菌根真菌［3，4］。木霉菌
（Trichoderma spp.）属于半知菌类的丝孢纲，丛梗孢
目，丛梗孢科，广泛存在于土壤、根围、叶围、种
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期112
子和球茎等生态环境中，作为一种应用广泛的拮抗
微生物，在植病生防中具有重要的、不可忽视的作用，
也是公认的最有潜力的生防因子。同时，将木霉拌
种或土施可促进植物生长［5］。另外，有研究发现木
霉在摇瓶条件下对重金属 Cu、Pb 和 Zn 均有较强抗
性［6-8］，而且可以提高超积累植物油菜、芥菜的生
物量及其对重金属镉、镍的富集［9，10］。因此，亦有
学者开始将木霉利用于重金属污染土壤的植物 -微生
物联合修复中，但研究尚处于起步阶段。
本课题组在前期研究中从土壤中筛选得到里氏
木霉 FS10-C，该株木霉具有 ACC 脱氨酶、解磷作用
和产铁载体等促生活性 ；且摇瓶条件下，在 Cu 浓度
≤ 600 mg/L，Cd 浓度≤ 300 mg/L 时均可生长发育，
其中 100 mg/L 浓度下 Cu 积累率达 50.6%，10 mg/L
浓度下 Cd 积累率达 76.9% ；盆栽试验表明，接种木
霉 FS10-C 能提高铜超积累植物海州香薷和镉超积
累植物伴矿景天的生物量而不降低植物地上部 Cu、
Cd 含量，进而能强化植株对铜镉污染土壤的修复效
应［11，12］。同时，菌株本身及其代谢产物均对人畜无
害，具有较高的生物安全性［13］，是一株颇具应用潜
力的土壤修复真菌。为了增加木霉对土壤环境的抗
性和可应用性，本研究试图以廉价的农副产品作为
原料，对木霉 FS10-C 固体发酵培养基配方进行了筛
选，并初步优化了发酵条件，为将其成功开发为土
壤重金属污染修复的生物修复剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 里氏木霉（Trichoderma reesei）FS10-C
（保藏编号 ：CGMCC No.3970），菌丝白色棉絮状，
绿色孢子、产黄色素。
1.1.2 培养基 斜面培养基 ：称 200 g 马铃薯洗净
切块，加适量去离子水煮沸 30 min 后，过滤出上清液，
向其中加 20 g 葡萄糖、18 g 琼脂，用去离子水溶解
至 1 000 mL，1×105 Pa 灭菌 20 min。
液体培养基 ：称 200 g 马铃薯洗净切块，加适
量去离子水煮沸 30 min 后，过滤出上清液，向其中
加 20 g 葡萄糖，用去离子水溶解至 1 000 mL，1×105
Pa 灭菌 20 min。
固体发酵培养基 ：将桔皮、苜蓿、麦麸、玉米
秸秆、水稻秸秆、菇渣等作为固料，烘干粉碎过 20
目筛灭菌后，用去离子水调节其含水量为 50%。分
装到 15 cm 培养皿中，每个培养皿中约 60 g，3 次重
复，1×105 Pa 灭菌 20 min 备用。
1.1.3 仪器 SPX-250C 型恒温恒湿箱，上海博迅
实业有限公司医疗设备厂 ；SF-50A 型转轴式固体发
酵罐，镇江东方生物工程设备技术有限责任公司 ；
DZFZ-12D 型电热蒸汽发生器，无锡市斯利斯达服装
机械有限公司 ；VW-0.22/7-X 型箱式静音全无油润滑
空气压缩机，宁波市鄞州展翅无油空压机有限公司。
1.2 方法
1.2.1 孢子悬液的制备 将里氏木霉 FS10-C 菌种在
PDA 斜面上进行活化，约 7 d 后产孢，用无菌水将
孢子洗下后，制成孢子悬液（1×106 CFU/mL）备用。
1.2.2 种子液的制备 将 150 mL 液体培养基倒入
250 mL 三角瓶中，加硅胶塞后用报纸将瓶口包好，
于 1×105 Pa 灭菌 20 min，取出后冷却至室温，接上
述孢子悬液，于 28℃，150-180 r/min 的恒温摇床上
培养 3 d，即为木霉二级种子液。
1.2.3 固体发酵基质的筛选 单一基质培养基的筛
选 ：在无菌条件下，吸取 6 mL 的孢子悬液加入到上
述 6 种固体培养基中，28℃恒温培养箱中培养，从
第 3 天起每天搅动 1 次，定时取样，用血球计数板
计数孢子浓度。
复合基质培养基的筛选 ：通过单一固体培养基
发酵试验，确定一般组合固体发酵培养基组分，将
木霉 FS10-C 定量接种在复合培养基中，28℃恒温培
养箱中培养，从第 3 天起每天搅动 1 次，发酵 10 d
后取样，用血球计数板计数孢子浓度。
1.2.4 平皿固体发酵条件的优化 按上述筛选结果
选择基质配比、接种量、含水量和培养时间 4 个因
素，分别取 3 个水平，以 L9（3
4）正交表进行正交
试验，重复 3 次，通过级差分析得出较优组合，再
通过方差分析各因素对固体发酵的影响大小，确定
适宜 FS10-C 固体发酵的最佳工艺条件，正交试验设
计见表 2。
1.2.5 固体发酵罐发酵试验 在平皿固体发酵试验
的基础上，于固体发酵罐中进行木霉菌固体发酵的
放大试验。以发酵时间为横坐标，产孢量为纵坐标
2014年第3期 113罗洋等 ：里氏木霉 FS10-C 固体发酵基质筛选及发酵条件初探
绘制产孢曲线，分析 FS10-C 在固体发酵罐中的生长
特性。
1.2.6 产孢量测定 准确称取 1.0 g 固体培养物，定
量稀释，振荡混匀后，用血球计数板计数，3 个重复。
用常压干燥法测定发酵产物的含水量（W），计算孢
子产量［CFU/（g 干培养物）］。
2 结果
2.1 不同基质对里氏木霉生长的影响
由表 1 和图 1 可知，木霉 FS10-C 菌株在 6 种单
一固体基质上都能生长，其中以麦麸和菇渣为基质
的培养基菌丝生长速度最快，培养第 4 天时即已布
满整个平皿。产孢量则以桔皮最高，在第 16 天时达
到 4.55×109 CFU/g，其次是玉米秸秆和菇渣，分别
为 1.25×109 CFU/g 和 1.08×109 CFU/g，水稻秸秆和
苜蓿基质上检测不到木霉菌分生孢子的产生。研究
还发现，单一培养基上存在着菌丝生长与产孢量不
协调的问题，综合考虑，选取麦麸、菇渣和桔皮 3
种基质进行木霉菌固体发酵基质的组合筛选。
表 1 里氏木霉 FS10-C 在不同基质上的长势
培养基种类
生长现象
菌丝 孢子
麦麸 生长旺盛、整齐，
布满平皿
形成早，量少，绿色较浅
桔皮 生长缓慢，致密 形成晚，量大均匀，布满平皿
苜蓿 生长缓慢，稀疏 量极少，绿色肉眼不可见
水稻秸秆 生长较快，稀疏 量极少，绿色肉眼不可见
玉米秸秆 生长较快，稀疏 形成早，绿色较浅
菇渣 生长旺盛、整齐，
布满平皿
形成晚，绿色清晰可见
在总物料装量一定的情况下，将 3 种基质等质
量两两混合，按固水比 1∶1 加入去离子水，调节培
养基初始含水量为 50%。接种培养 10 d 后发现，木
霉 FS10-C 在复合基质上的菌丝生长速度快，菌丝
致密，整齐，第 5 天就有绿色孢子产生，且产孢量
较单一基质均有不同程度的提升，其中以麦麸和桔
皮混合基质上的平均产孢量为最大，达到 9.47×109
CFU/g，是单一桔皮的 2.08 倍（图 2），同时考虑到
两种材料来源广且廉价，因此，确定其作为固体发
酵基质开展进一步研究。
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
5 9 13 16
ᰦ䰤 d
ӗᆒ
䟿 1
08
C
FU
/g
哖哨
ẄⳞ
⦹㊣〨⿶
㧷
图 1 里氏木霉 FS10-C 在不同基质上的产孢状况
0
2
4
6
8
10
12
哖哨+ẄⳞ哖哨+ẄⳞ+㧷ẄⳞ+㧷哖哨+㧷
ӗᆒ
䟿 1
09
C
FU
/g
复合培养基
图 2 复合培养基产孢情况
2.2 平皿固体发酵条件的优化
采用四因素三水平［L9（3
4）］正交试验设计进
一步优化发酵条件，其研究结果如表 2 所示。极差
分析结果表明，各因素对产孢量的影响依次为 ：基
质配比 > 固水比 > 培养时间 > 接种量，即原料基质
配比的影响最大，极差达到 10.31，桔皮与麦麸的质
量比为 1∶1 时产孢量高于其它两种比例 ；不同水平
的料水比对发酵后的分生孢子产量也有一定的影响，
料水比为 1∶1.2 时的孢子浓度高于 1∶0.8 和 1∶1，
低、中水平的含水量发酵后的产孢量之间差异不大；
不同水平的培养时间，后一时间段测定的产孢量都
高于前一次的产孢量 ；接种量对固体发酵的影响不
大，各水平之间平均值较为接近，极差仅为 1.46。
因此，最优工艺条件为 A3B1C3D2，即桔皮与麦麸的
质量比为 1∶1，固料与水的比例为 1∶1.2，接种量
为 5%，培养 14 d 时木霉菌株 FS10-C 的产孢量最
高，达到 2.43×1010 CFU/g，确定此为最佳培养基组
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期114
合。为了进一步检验各个因素对试验影响的显著水
平，对试验结果进行方差分析（表 3） 。从表 3 可看
出，本试验所选 4 个因素对产孢量的影响均表现为
差异不显著，表明产孢量的高低是多个因素共同作
用的结果。
表 2 正交试验结果和极差分析
试验号
培养时间
（d）A
接种量
（%）B
固水比
C
基质配比
D
产孢量 /
（×109 CFU/g）
1 7 5% 1∶0.8 1∶2 0.26
2 7 8% 1∶1 1∶1 5.00
3 7 10% 1∶1.2 2∶1 4.55
4 10 5% 1∶1 2∶1 2.16
5 10 8% 1∶1.2 1∶2 12.92
6 10 10% 1∶0.8 1∶1 12.75
7 14 5% 1∶1.2 1∶1 24.33
8 14 8% 1∶0.8 2∶1 4.44
9 14 10% 1∶1 1∶2 6.59
K1 3.27 8.92 5.82 6.59
K2 9.28 7.45 4.58 14.03
K3 11.79 7.96 13.93 3.72
R 8.52 1.46 9.35 10.31
基质配比，指桔皮与麦麸的质量比 ；K 表示在各因素各水平下获得芽孢数的
平均值 ；R 表示同一因素各水平下平均产孢量的极差（极差 = 平均产孢量的
最大值 -平均产孢量的最小值）
表 3 正交试验结果方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F 比 F 临界值
A 114.914 2 1.038 3.110
B 3.310 2 0.030 3.110
C 154.824 2 1.398 3.110
D 169.856 2 1.534 3.110
误差 442.900 8
2.3 固体发酵罐发酵条件初探
参 照 优 化 好 的 平 皿 培 养 条 件， 将 里 氏 木 霉
FS10-C 种子液接入转轴式固体发酵罐中，进行小试
验探索。实际培养发现，与平皿试验相比，发酵罐
发酵时通过电热蒸汽发生器产生的蒸汽对培养基进
行灭菌，其冷却过程中会有部分残留蒸汽凝结成水
进入培养基，使基质结团，不利于搅拌，透气性差，
影响气生菌丝生长和产孢，因此将培养基的初始固
水比下调为 1∶0.8。此外，50 L 发酵罐的有效容积
为 20-25 L（其余部分为夹套容积），而物料装量最
大为有效容积的一半，因此设置为 6-10 kg，过高不
利于搅拌通气，过低不能使生产效率最大化 ；通气
设置要与压力的设置结合起来，通气量过高会吹干
培养基，降低水分含量，过低不利于木霉菌有氧呼
吸，适宜范围为 20-30 L/min，培养过程中要保持罐
内为正压，防止外面的空气流入产生污染，压力过
高则会损坏罐体，以 0.03-0.05 Mpa 为宜 ；基质配比
和接种量与平皿发酵保持一致，即桔皮麦麸质量比
为 1∶1，接种量为 5%。
采用上述确定的发酵罐参数发酵 2 d 后，培养
基中开始出现少量白色菌丝 ；至第 4 天时，培养基
开始结块，有大量的白色菌丝覆盖在表面，并伴有
少量绿色孢子产生 ；5-8 d 期间打开搅拌电源定时
搅拌，一方面能加大物料与氧气和水分的接触程度，
另一方面可使菌体与基质充分混合，此时木霉菌进
入对数生长期，整个培养基呈现深绿色，第 8 天孢
子产量为 1.01×1010 CFU/g ；8-10 天期间增长速度放
慢，并保持相对稳定，第 10 天时孢子量达到最大，
为 1.44×1010 CFU/g。第 11 天以后孢子含量开始逐
渐下降，说明木霉已进入生长衰亡期，菌丝开始自
溶，加上培养基养分的大量消耗以及水分的过多散
发，导致菌株不能正常生长而逐渐死亡。因此，固
体发酵罐发酵的适宜周期为 8-10 d（图 3，图 4）。
8
9
10
11
0 2 4 6 8 10 12 14 16
ᰦ䰤(d)
lg
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䟿/C
FU
/g
图 3 FS10-C 固体发酵生长曲线
A B
A ：平皿固体发酵产物 ；B ：发酵罐固体发酵产物
图 4 木霉菌在平皿和发酵罐中固体发酵产物
2014年第3期 115罗洋等 ：里氏木霉 FS10-C 固体发酵基质筛选及发酵条件初探
3 讨论
固体发酵生物技术是有毒化合物生物降解与环
境生物修复的有益工具［14］，而发酵基质是影响固体
发酵效果的关键因素之一，因此实现该技术的前提
是选择生产效率高、对环境无污染的发酵基质。麦
麸是小麦加工过程中产生的主要副产物，富含纤维
素、半纤维素以及蛋白质、脂肪、低聚糖等成分。
有研究报道，发酵后麦麸粗蛋白、粗纤维等含量均
有显著提高，可为木霉菌后期生长和产孢提供充足
养分［15］。本研究发现木霉 FS10-C 在单一麦麸培养
基上产孢量极低，原因可能是由于其营养过于丰富，
特别是全氮含量达到 2.5%，导致菌丝生长过旺，抑
制了分生孢子的产生［16］。柑橘皮富含果胶、纤维素、
可溶性糖及多种维生素和矿物元素，是一种良好的
微生物生长基质［17］。同时，柑橘皮渣含有钙磷钾镁
等多种常量元素和铁铜锰锌硒碘等多种微量元素，
利于微生物产孢［18］。但单一桔皮不适合木霉菌快速
生长，麦麸和桔皮混合物是里氏木霉 FS10-C 菌株发
酵的理想培养基，能缩短发酵周期并可以使产孢量
大于 109 CFU/g，这与刘时轮［19］等利用麦麸和玉米
粉混合物培养绿色木霉 Tv04-2 的研究结果类似。同
时，发酵过程不需要外加碳氮源和无机盐，一方面
可以简化生产程序，降低活菌制剂成本，提高两种
农业废弃物桔皮和麦麸的利用率，变废为宝 ；另一
方面实现了里氏木霉 FS10-C 的高密度培养，施用时
可以减少土壤对木霉的抑制作用，使其在重金属污
染土壤的生物修复中具有更好的效果。
影响发酵的因素很多，如发酵基质种类、基质
配比、基质含水量、发酵时间、接种方式、pH、温
度等［20，21］，人工培养微生物，适宜的发酵条件是
提高产出率的关键。鉴于单因素法在考察的因素较
多时需要太多的试验次数和较长的试验周期，因
此培养基优化过程中其常常被用于初步的筛选试
验，筛选出主要因素后，再利用正交、均匀或者响
应面设计对主要因素着重考察［22］。本研究也采取
这一思路，在利用单因素试验确定了主要发酵培养
基质的基础上，通过正交试验对里氏木霉菌的发酵
条件进行了摸索，最终优化条件为 ：桔皮与麦麸质
量比 1∶1，按 5% 比例接种孢子悬液，固水比设置
为 1∶1.2，28℃培养箱中培养 14 d 后产孢量达到最
大，为 2.43×1010 CFU/g。有研究表明多数真菌对环
境 pH 值不是很敏感，一般在 3-9 都能很好的生长［23］，
加上固体发酵基质 pH 不易调节，因此本研究为自
然 pH。此外，培养温度也是影响固体发酵效果的一
个重要因素，但是由于木霉最适宜的生长温度范围
一般在 25-30℃度之间［24］，且固体发酵周期较液体
发酵长，温度控制程序繁琐，所以本研究以一般微
生物最适宜的 28℃为发酵温度。
本试验前期工作主要是在 15 cm 大玻璃平皿中
完成，污染少，利于控温和保湿，小规模生产可以
采用这种培养方式。后期工作则在此基础上对里氏
木霉 FS10-C 进行放大培养，因此众多的工艺都需要
进一步地完善，如培养基质的灭菌方式、接种方式、
保湿以及防污染的控制等都需要相应的措施［25］。王
振宇［26］等在利用浅盘式发酵对枯草芽孢杆菌 B395
的放大培养过程中发现固体培养基在灭菌后将增重
约 3%-5%，需要适当降低灭菌前培养基含水量。本
研究利用发酵罐进行放大培养时也出现了基质水分
增加的现象，因此在平皿试验的基础上对培养基
初始含水量进行了修正，同时结合发酵罐自身特
点，初步摸索出了发酵罐发酵条件。从生长曲线可
以看出，使用发酵罐发酵能缩短 FS10-C 的生长周
期，培养 8-10 d 即可放罐，孢子产量达到 1.44×1010
CFU/g。这相对于平皿培养有所下降，推测是由于发
酵过程的复杂性，往往存在着“放大效应”，即在实
验室研究中目标产物的产量较高，而在放大过程中
随着发酵规模的扩大目标产物的产量不断下降无法
重复实验室试验［27］。至于是否可以通过在不同的阶
段设置不同梯度的温度、通气量以及适时补水等手
段来继续优化发酵参数，以提高产孢量，尚需进一
步研究。
4 结论
（1）木霉 FS10-C 在麦麸、菇渣发酵基质上菌
丝生长良好 ；在桔皮上产孢量大，可达 4.55×109
CFU/g ；当麦麸与桔皮混合时能促进木霉菌丝生长，
提高分生孢子产量，不愧为一良好的培养基质。
（2）采用 15 cm 玻璃平皿固体发酵最佳条件为：
桔皮与麦麸的质量比为 1∶1，接种量为 5%，培养
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期116
基初始料水比为 1∶1.2，发酵时间为 14 d，产孢量
可达 2.43×1010 CFU/g，是单一桔皮产量的 5.35 倍。
（3）采用 50 L 固体发酵罐发酵 10 d 后，产孢量
达 1.44×1010 CFU/g。木霉菌固体发酵具有规模化生
产的潜力。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）