全 文 ：中药渣固体发酵亮菌产漆酶研究
杨丽红1，叶选怡2，凌庆枝3* ，张 超1，何军邀3，魏兆军4 (1．安徽理工大学医学院，安徽淮南 232001;2．丽水学院生态学院，
浙江丽水 323000;3．浙江医药高等专科学校，浙江宁波 315100;4．合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 230009)
摘要 ［目的］研究中药渣固体发酵亮菌产漆酶及其发酵条件，以充分利用中药渣。［方法］在单因子试验基础上，用正交试验法对中药
渣固体发酵亮菌的培养基和培养条件进行优化筛选。［结果］在供试的 6种药渣培养基中以白芍药渣为碳源时产漆酶量最佳，其最适培
养条件为葡萄糖 0． 6%，白芍麸皮比 3∶ 7，温度 25 ℃，含水量 65%，接种量 11%。［结论］供试 6种中药渣固体发酵亮菌均可产漆酶，培养
条件优化后，亮菌漆酶酶活力较初始培养基提高了 19倍。
关键词 中药渣;亮菌;固体发酵;漆酶
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2013) 06 －02396 －03
Study on Residues of Traditional Chinese Medicine to Produce Laccase by Solid Fermentation of Armillariella Tabescens
YANG Li-hong et al ( Medical College of Anhui University of Science and Technology，Huainan，Anhui 232001)
Abstract ［Objective］To study the residue of traditional chinese medicine to produce laccase by solid fermentation of Armillariella tabescens
and its fermentation conditions，in order to make full use of residue from traditional Chinese medicine． ［Methods］On the basis of unifactor ex-
periment，the orthogonal experiment were employed to optimize culture medium from residue of traditional Chinese medicine and fermentation
conditions，and produce laccase with solid fermentation of Armillariella tabescens． ［Result］Radix paeoniae alba residue was found to be a
good carbon source of laccase production，and the ratio of radix paeoniae alba and wheat bran was 3∶ 7，the optimum conditions were glucose
0. 6%，moisture content of substrate 65%，inoculation dosage 11%，and culture temperature 25 ℃ ． ［Conclusion］It is capable of producing
laccase with the six kinds of residue of traditional Chinese medicine by solid fermentation of Armillariella tabescens． And the production of lac-
case under solid culture with optimal fermentation conditions was 19 times higher than that in the original medium used previously．
Key words Residue of traditional Chinese medicine; Armillariella tabescens; Solid fermentation; Laccase
基金项目 浙江省科技厅公益技术研究社会发展项目( 2010C33072 ) ;
浙江医药高等专科学校重点科研项目( ZPCSR2010001) 。
作者简介 杨丽红( 1985 － ) ，女，甘肃张掖人，硕士研究生，研究方向:
生物医药，E-mail: 13429340343@ 139． com。* 通讯作者，教
授，从事生物医药研究，E-mail: lingqingzhi@ sina． com。
收稿日期 2013-01-28
漆酶(Laccase，EC1． 10． 3． 2)是一种含铜的多酚氧化酶，
属蓝色氧化酶家族［1］。漆酶最早在日本漆树(Japanese lac-
quer tress，Rhus vernicifera)的渗出液中发现［2］，后被证明其
广泛存在于真菌中［3］。近年有报道，漆酶还存在于部分细
菌［4 －6］和昆虫［7 －8］中。漆酶生物氧化功能独特，在造纸、纺
织、环境保护、食品加工等领域具有广阔的应用前景［9 －12］。
亮菌(Armillariella tabescens) ，又名假蜜环菌、青杠钻，因
其菌种由腐朽柳树中分离出来，且菌丝在黑暗处可发出淡蓝
色荧光，故名亮菌［13］。亮菌在我国民间曾流传作为治疗急
慢性肝炎及胆道疾病的偏方，其子实体可食用，是一种药食
兼用的珍贵真菌。亮菌自发现以来，对其研究主要集中在药
用功能方面。笔者所在课题组近年来研究发现亮菌具有产
漆酶的能力［14］，从而开辟了亮菌应用的新领域。
中药是中华文化的瑰宝之一，随着国内中药提取物产业
的快速发展，每年有大量的中药渣产生，已成为环境的新威
胁。发挥微生物的生物降解作用，充分利用中药渣的生物质
资源，使其变废为宝，将有重要的社会意义和巨大的经济价
值。据此，该研究以常见的中药渣为培养基，固体发酵亮菌
从而产漆酶。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 主要仪器。MLS-3780 型高压蒸汽灭菌器:购自日本
Tega SANYO Industry Co．，Ltd;TU-1810SPC 型紫外可见分光
光度计:购自北京普析通用仪器有限公司;Biofuge Stratos冷
冻离心机:购自德国贺利氏公司;PHS-3C型 pH计:购自上海
精科仪器有限公司;BCM-1000型生物净化工作台:购自苏州
净化设备有限公司;SPX 智能型生化培养箱:购自宁波江南
仪器有限公司;BS124S型电子天平:购自赛多利斯科学仪器
有限公司。HH-2 型恒温水浴锅:购自国华电器有限公司;
BSD-226SK型冰箱:购自青岛海尔股份有限公司。
1． 1． 2 主要试剂。2，2-联氮 －双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺
酸)二胺盐(ABTS) :美国 Sigma 公司; (NH4)2SO4 等试剂均
为国产分析纯。丹参、白芍等中药渣，由宁波立华植物提取
技术有限公司提供。
1． 1． 3 菌种与培养基。亮菌(Armillariella tabescens)菌种，由
浙江医药高等专科学校生物技术实验室保藏。
实验用中药渣为中药经水提取有效成分后剩留物，立即
晾晒后烘箱烤干，粗粉碎，备用。
综合 PDA固体培养基(1 L) :葡萄糖 20 g、琼脂粉 18 g、
土豆汁 200 g 、MgSO4·7H2O 1． 5 g、KH2PO4 3 g、VB1 0． 05 g;
液体种子培养基(1 L) :葡萄糖 20 g、蛋白胨 15 g、KH2PO4 5
g、MgSO4·7H2O 1 g、(NH4)2SO4 5 g、玉米粉 20 g，pH 6． 0;中
药渣培养基Ⅰ:丹参(白芍、刺五加、甘草、穿心莲、石菖蒲)
80%、麦麸 17%、石膏 1%、葡萄糖 2%、水 65%，pH 自然;中
药渣培养基Ⅱ:丹参(白芍、刺五加、甘草、穿心莲、石菖蒲)
39%、麦麸 58%、石膏 1%、葡萄糖 2%、水 65%，pH 自然;中
药渣培养基Ⅲ:丹参(白芍、刺五加、甘草、穿心莲、石菖蒲)
38． 5%、麦麸 57． 8%、葡萄糖 2%、(NH4)2SO4 0． 5%、CuSO4
0． 03%、CaCl2 0． 47%、KH2PO4 0． 5%、MgSO4 0． 2%、VB1
0. 005%、水 65%，pH自然。
责任编辑 朱琼琼 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(6):2396 － 2398
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.06.032
1． 2 方法
1． 2． 1 不同中药渣培养亮菌试验。试验分别以丹参、白芍、
刺五加、甘草、穿心莲、石菖蒲 6 种中药渣为主料，辅以其他
成分配制 3类培养基，即中药渣培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，进行固体发酵
亮菌。培养过程中观察亮菌菌丝生长情况，测定固体培养料
中漆酶的酶活力，考察不同中药渣培养基固体发酵亮菌产漆
酶的情况。
1． 2． 2 中药渣固体发酵亮菌产漆酶正交试验。以“1． 2． 1”
的试验为基础，选出其中的最优产漆酶中药渣(即白芍药渣)
为碳源，以中药渣培养基Ⅲ(菌丝生长、漆酶活力均优)为基
础培养基，选择葡萄糖浓度、白芍麦麸比、温度、含水量、接种
量 5个因素进行 L16(4
5)正交试验，试验因素水平见表 1，发
酵后测定漆酶酶活力，分析不同培养基及发酵条件对亮菌固
体发酵产漆酶的影响。
表 1 固体发酵因素水平表
水平
因素
A:葡萄糖
%
B:白芍∶麦麸
C:温度
℃
D:含水量
%
E:接种量
%
1 0 6∶ 4 25 55 5
2 0． 3 5∶ 5 26 60 8
3 0． 6 4∶ 6 27 65 11
4 0． 9 3∶ 7 28 70 14
1． 2． 3 粗酶液制备。将固体培养基按质量比 1∶ 1加入蒸馏
水，捣碎培养料并搅拌均匀，放置于 4 ℃冰箱中浸泡 24 h后
8层纱布过滤，然后将滤液于 4 ℃、8 000 r /min 下离心 10
min，上清液即为粗酶液，4 ℃冰箱保存备用。
1． 2． 4 漆酶酶活测定［15］。4 ml的反应体系中含:0． 5 mmol /L
的 ABTS作为反应底物，0． 1 mol /L的柠檬酸 －柠檬酸钠缓冲
液(pH 4． 0) ，1 ml 稀释的粗酶液。35 ℃反应 5 min，于波长
420 nm处测吸光度，取吸光度变化的线性部分。
酶活定义:在一定条件下，每分钟催化 1 μmol ABTS 氧
化所需的漆酶量为一个酶活力单位，以 U/g表示。
酶活力 =△OD ×稀释倍数 × 4 ml × 106 /(1 ml ×△t × ε
×1 cm) ，［ε为消光系数，ε =3． 6 ×104 L /(mol·cm) ］
2 结果与分析
2． 1 不同中药渣固体发酵亮菌产漆酶
2． 1． 1 亮菌菌丝生长。分别将3类培养基(中药渣培养基Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ)上培养的亮菌菌丝生长情况进行对比，菌丝生长情况
如表 2所示。从表 2中可知，中药渣培养基Ⅲ最适合菌丝生
长。比较同一类型不同中药渣培养基培养的亮菌菌丝，发现
3类培养基中不同种中药渣培养的亮菌菌丝长势由强到弱的
顺序依次为:白芍 ＞穿心莲 ＞甘草 ＞丹参 ＞刺五加 ＞石菖
蒲。综合试验结果，确定以白芍药渣为主料的中药渣培养基
Ⅲ最适合亮菌菌丝生长。
表 2 亮菌菌丝生长状况
培养基 菌丝外观及变化 长势 长满时间∥d
中药渣培养基Ⅰ 稀疏，细弱;由白变褐 + 中途停止生长
中药渣培养基Ⅱ 较密，粗壮;由白变褐 + + + 28 ～33
中药渣培养基Ⅲ 浓密，粗壮;由白变褐 + + + + 27 ～31
注:“+”的多少表示菌丝长势的优劣。
2． 1． 2 亮菌漆酶活力。在亮菌固体发酵培养 15 d后，以5 d
为一个时间段检测不同培养阶段漆酶的酶活，结果表明随着
时间的延长，漆酶的酶活力逐渐升高，在 30 d左右达最大值，
并趋于稳定，到 40 d后漆酶酶活逐渐降低。试验中中药渣培
养基Ⅰ培养的菌丝生长情况较差，影响了漆酶的产生，漆酶酶
活低，最高只有 364 U /g，因此该类培养基被舍弃。中药渣培
养基Ⅱ、Ⅲ效果较好，发酵 30 d时漆酶活力见表 3，结果表明，
白芍药渣为主料的Ⅲ类药渣培养基发酵亮菌产漆酶的酶活
力最高，达 3 116． 88 U /g。
表 3 不同种类的中药渣对亮菌固体发酵产漆酶的影响
培养基
酶活力∥U/g
丹参 白芍 刺五加 甘草 穿心莲 石菖蒲
中药渣培养基Ⅱ 205． 70 2 983． 34 1 239． 20 2 284． 00 1 508． 70 1 522． 60
中药渣培养基Ⅲ 313． 02 3 116． 88 1 898． 30 2 806． 08 2 041． 01 1 854． 26
2． 2 中药渣固体发酵产漆酶的正交试验 以葡萄糖浓度、
白芍麦麸比例、温度、含水量、接种量 5 个因素进行正交试
验，并对其结果进行极差分析和方差分析，结果表明，各因素
极差由大到小为白芍麸皮比例 ＞含水量 ＞接种量 ＞温度 ＞
葡萄糖用量，白芍麸皮比例是影响亮菌固体发酵产漆酶的重
要因子，方差分析表明白芍麸皮比例对漆酶酶活的影响显著
高于其他因子。以各因素水平为横坐标，试验指标的均值为
纵坐标绘制曲线效应图(图 1) ，从图中可看出漆酶酶活随着
葡萄糖用量、白芍麸皮比例、温度、含水量、接种量这 5 个因
素条件变化而变化的趋势。综合分析得出最佳产漆酶条件
为:A4B4C1D3E3，即葡萄糖 0． 9%，白芍麸皮比为 3∶ 7，温度 25
℃，含水量为 65%，接种量为 11%。随后以试验获得的最佳
该组合配制培养基，进行亮菌固体发酵验证，结果获得了最
高的漆酶酶活，达 6 956 U /g。
3 结论与讨论
该试验表明，常见根茎类中药渣固体发酵亮菌产漆酶是
可行的，其中以白芍为主料的固体发酵最优条件是葡萄糖
0. 9%，白芍麸皮比 3∶ 7，温度 25 ℃，含水量 65%，接种量 11%。
亮菌分离自腐朽的柳树，它可有效利用木质素和纤维
素。亮菌代谢产物现已被制成治疗胆囊炎、胃炎等消化系统
疾病的药物。因漆酶是一类具有广阔应用前景的多酚氧化
酶，亮菌漆酶的发现无疑将开辟亮菌应用的新途径。
中药渣是中药提取生产过程中的弃留物，处置不当会污
染环境。然而，中药渣也是一种中药的生物资源，特别是根
茎类的中药渣，含有大量的木质素和纤维素，具有较大的开
发利用价值。目前已有一部分木质素含量高的中药渣被直
793241 卷 6 期 杨丽红等 中药渣固体发酵亮菌产漆酶研究
图 1 固体发酵正交试验效应曲线
接作为燃料使用，但大多数是被进行初步处理后作为生物质
资源进行再循环利用，如栽培食用菌等［16 －17］，该试验结果表
明根茎类中药渣可转化为生物类产物，同时也为亮菌的开发
应用探索了新的途径。关于中药渣的综合利用及亮菌的进
一步开发，笔者所在课题组将做进一步的探索。
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