全 文 :·综述与专论· 2014年第3期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 :2013-09-16
基金项目 :林业公益性行业科研专项(200904038)
作者简介 :王琼,女,讲师,硕士研究生,研究方向 :植物基因育种 ;E-mail :wangqiong7640@aliyun.com
通讯作者 :陈介南,男,博士研究生,教授,研究方向 :林木遗传育种和生物能源 ;E-mail :chenjny@gmail.com
麻疯树(Jatropha curcas L.)是一种重要的生物
柴油树种,生长迅速,喜光耐旱,其籽粒含油量高,
是制造生物柴油的良好材料,是世界公认的生物能
源树,具有较高的经济价值和药用价值。经改性的
麻疯树油可适用于各种柴油发动机,并在闪点、凝
固点、硫含量、一氧化碳排放量、颗粒值等关键性
技术上均优于国内零号柴油,达到欧洲二号排放标
准。然而目前我国麻疯树生产还存在抗寒性差、产
量低、油脂转化成本偏高等问题,直接影响推广应
用的经济效益[1]。因此,通过高效安全的育种技术,
定向调控麻疯树油脂合成代谢途径,改良麻疯树种
子含油量和抗寒性,已成为当务之急。
麻疯树是很有开发潜力的植物,国内外在其常
规育种方面的研究比较多[2]。但随着现代生物技术
能源植物麻疯树分子育种研究进展
王琼 刘伯斌 孔倩倩 陈介南
(中南林业科技大学 国家林业局生物乙醇研究中心 生物环境科学与技术研究所,长沙 410004)
摘 要 : 麻疯树作为一种重要的能源植物,虽然在常规育种方面的研究比较多,但在分子育种上仍处于起步阶段。在详细
综述了国内外能源植物麻疯树基因的克隆,组织培养再生体系的建立相关研究进展的基础上,重点介绍了农杆菌介导转化法、基
因枪介导转化法和纳米载体转化法等几种新技术在麻疯树育种中的应用,提出了当前麻疯树分子育种中存在的问题,并对其前景
进行了展望。
关键词 : 麻疯树 分子育种 基因克隆 基因转化
Advances in Molecular Breeding of Energy Plant Jatropha curcas
Wang Qiong Liu Bobin Kong Qianqian Chen Jienan
(Ministry of Forestry Bioethanol Research Center,Institute of Biological and Environmental Science and Technology,Central South University
of Forestry and Technology,Changsha 410004)
Abstract: Jatropha curcas as an important energy plant, has draw growing focus in conventional breeding, but it is still at the starting
stage in molecular breeding. Advances in the research of Jatropha curcas gene cloning and tissue culture regeneration system were reviewed.
Futhermore, the methods including Agrobacterium mediated genetic transformation, gene gun mediated transformation and nanocarriers
transformation were summarized as keys. Meanwhile, the existing problems and prospects of the application of molecular breeding in Jatropha
curcas were discussed.
Key words: Jatropha curcas Molecular breeding Gene cloning Gene transformation
的发展,对麻疯树的研究,传统方法已不能满足现
今社会对麻疯树资源的需求。依靠现代分子生物学
技术与常规育种技术相结合的方法,可极大地缩短
麻疯树育种周期,加速育种进程,对创造新种质,
选育新品种具有重要意义。近年来麻疯树分子育种
工作取得了一定的进展,已经分离克隆了多个基因,
对其中部分基因进行了功能分析[3],对遗传再生体
系建立的研究和外源基因转化技术[4,5]进行了相关
研究,为麻疯树优质新品种的获得和分子育种奠定
了良好的基础。本文是在前人的研究基础上,评述
麻疯树基因克隆、组织培养再生体系的建立、外源
基因转化方法及转基因的应用等方面的研究进展,
讨论麻疯树育种研究中存在的问题,并对其发展前
景进行展望。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期2
1 麻疯树基因克隆
从麻疯树种子中克隆的第一个基因核糖体失活
蛋白基因 curcin 是鉴于它的医学应用开展的[6],随
后还进行了原核表达分析和在烟草中的功能分析[7]。
为增强基因表达的组织特异性,秦小波等[8]从麻疯
树中克隆了 curcin 启动子,证实该启动子为麻疯树
胚乳特异性表达启动子。王治涛等[9]构建了麻疯树
胚乳 cDNA 文库,为克隆各类基因奠定了基础。
1.1 麻疯树油脂相关基因的克隆
麻疯树是一种极具开发潜力的多用途经济作
物,但引起人们关注的主要是它的油分。麻疯树种
子油流动性好,种仁中脂肪类物质含量高,除含有
约 21%的饱和脂肪酸外,还含有 70%以上的不饱和
脂肪酸,主要为油酸(41.6%)和亚油酸(33.8%)
及微量的亚麻酸(1.1%)[10]。含油率作为重要的
育种指标,人们已对含油率相关的脂肪酸合成途径
的关键基因进行大量研究,包括与含油量相关的
乙酰辅酶 A 羧化酶(ACCase)[11]、磷酸烯醇式丙
酮酸羧化酶(PEPCase)[12,13],与脂肪链长度相关
的酰基载体蛋白(ACP)[14]、酰基 -ACP 硫酯酶 B
(FATB)[15],与脂肪酸不饱和程度相关的硬酯酰基
去 饱 和 酶(SAD)[16]、 脂酰-脂 脱 饱 和 酶(FAD2、
FAD3 和 FAD7)[10,17]等基因,对它们的序列特征
进行了生物信息学分析。
植物的乙酰辅酶 A 羧化酶(ACCase)催化乙酰
辅酶 A 羧化生成丙二酸单酰辅酶 A,是脂肪酸合成
的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成
的关键调控步骤。Xie 等[11]采用 5RACE 和交错延
伸 PCR 技术获得了 ACCase 基因的全长 cDNA 克隆,
该基因序列长开放阅读框为 1 149 bp,编码 382 个氨
基酸。利用荧光定量 PCR 技术研究 ACCase 基因在
幼叶、成熟叶和老叶 3 个时期表达水平的变化,以
及种子在避光与光照条件下发育过程中表达水平的
变化,结果表明该基因表达与叶片和果实的生长条
件和发育阶段有关。近年来研究发现磷酸烯醇式丙
酮酸羧化酶(PEPCase)参与了植物种子油脂合成的
调控,因此通过反义抑制技术控制麻疯树 PEPCase
基因的表达,可能是提高麻疯树种子含油量的有效
途径[18]。范正琪等[12]从麻疯树中克隆 PEPCase 基
因 cDNA 全长,该 cDNA 全长 3 124 bp,其中开放阅
读框长为 2 898 bp,编码 965 个氨基酸,对 PEPCase
基因编码的氨基酸序列的序列同源性、二级结构、
磷酸化位点等进行生物信息学分析,为后续研究脂
肪酸表达调控从而提高麻疯树脂肪酸含量奠定基础。
另外,范正琪等[13]采用该技术对 JcPEPC 基因在
麻疯树不同组织及不同发育阶段的种子进行了表达
模式分析,在麻疯树中的时空表达模式阐明麻疯树
JcPEPC 基因的功能。
酰基载体蛋白(ACP)在脂肪酸合成中运载正
在延伸的脂肪酸链,参与最初的去饱和反应以及碳
16 和碳 18 不饱和脂肪酸的酰基转运,在植物脂肪
酸合成中有重要的调节作用[19]。江璐玎等[14]从麻
疯树胚乳 cDNA 文库中筛选分离了一个编码酰基载
体蛋白的 cDNA 序列,全长为 806 bp,开放阅读框
长 393 bp,编码 130 个氨基酸,该序列在 GenBank
登录号为 EF179617。RT-PCR 试验结果表明该基因
在种子中的高度表达可能与种子萌发时的代谢活动
有关。在高等植物质体游离脂肪酸的生物合成过程
中,酰基-ACP 硫酯酶(FAT)能催化脂酰-ACP 脱去
ACP,产生游离的脂肪酸。因此,酰基-ACP 硫酯酶
对植物种子中贮存态的脂肪酸种类和含量,植株中
从质体输出脂肪酸的链长和饱和性都起着关键的作
用[20]。为了对脂肪酸生物合成途径有进一步理解,
Wu 等[15]成功克隆了麻疯树的脂酰-酰基载体蛋白
硫酯酶基因,命名为 JcFATB1,而 JcFATB1 基因在
拟南芥中的种子特异性超量表达导致饱和脂肪酸特
别是棕榈酸的比例增大,不饱和脂肪酸的比例下降。
该结果表明木本油料作物中的 JcFATB1 作为饱和酰
基载体蛋白硫酯酶,能改善麻疯树种子油特别是增
加棕榈酸的水平。
植物组织中不饱和脂肪酸的组成和含量主要由
脂肪酸去饱和酶决定,控制油脂不饱和度的主要目
的是为了调控油脂的质量。脂酰 -ACP 脱饱和酶以
脂酰-ACP 为底物,能催化与 ACP 结合的饱和脂肪
酸形成单不饱和脂肪酸。其中研究最多的为 SAD 基
因,它催化饱和脂肪酸的第一步脱饱和,即催化硬
脂酞 -ACP 在 9-10 碳原子之间脱氢形成一个双键,
去饱和形成油酞 -ACP,即硬脂酸形成油酸(C18∶1),
可直接调控油脂中饱和与不饱和脂肪酸的比例。罗
2014年第3期 3王琼等 :能源植物麻疯树分子育种研究进展
通等[16]通过采用 RT-PCR 和 RACE 技术成功克隆
了麻疯树的硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶(JcSAD)
基因,其 cDNA 全长 1 491 bp,包含一个 1 191 bp 的
完整的开放阅读框,GenBank 登录号为 DQ084491,
并对其进行了原核表达,为利用基因工程技术,调
节 SAD 基因活性,为改善和 SAD 有关的植物功能(如
抗冷性等)打下基础。脂酰-脂脱饱和酶在脂酰链中
引入双键,由脱饱和酶催化反应,在控制生物膜的
形成,决定贮脂和膜脂的脂肪酸组成与不饱和度方
面起着关键作用。FAD3,FAD7 基因是去饱和酶基
因家族中的重要成员,该基因主要催化植物细胞中
亚油酸形成亚麻酸,其中 FAD7 主要定位于叶绿体,
FAD3 定位于内质网[21]。付瑜华等[10]从麻疯树叶
片中克隆了 JcFAD3 基因,并研究了麻疯树 JcFAD3
的亚细胞定位。曾玲等[17]利用 TAIL-PCR 技术成功
克隆了麻疯树 JcFAD7 基因起始密码子的上游 1 926
bp 序列。利用生物信息学手段对其序列特征和潜在
的调控元件进行分析表明 JcFAD7 的表达可能受多
种因素的调控。将启动子连接到 pBI101.1 载体,成
功构建了驱动报告基因 GUS 的植物表达载体。为阐
明麻疯树不饱和脂肪酸的合成代谢过程和植物生长
发育的调控机理奠定了基础。
1.2 麻疯树抗逆相关基因的克隆
干旱、盐碱、金属离子和低温等逆境条件严重
抑制植物生长发育。借助分子生物学手段,从基因
组成、表达调控及信号转导等方面进行深入研究,
揭示抗逆的分子机理,并导入相关抗性基因改良作
物的胁迫抗性,近年来取得较大进展。目前在麻疯
树上也得到了部分抗性相关的基因,并进行了转化
研究。
植物水通道蛋白(Aquaporin)介导细胞与介
质之间快速的被动的水分运输,是调控水进出细胞
的关键基因。张颖等[22]采用 RT-PCR 和 RACE 技
术成功克隆了麻疯树 JcPIP 基因,其 cDNA 全长为
985 bp,包括一个 843 bp 的完整的开放阅读框,Gen-
Bank 登录号为 EF030420,干旱胁迫下 JcPIP 在基因
表达量和蛋白含量上都有明显增加。试验结果验证
了水通道蛋白基因(JcPIP)在干旱中的积极作用。
麻疯树 Curcin-L 毒蛋白属于Ⅰ型核糖体失活蛋
白,通过紫外线等外界刺激被诱导表达,在麻疯树
的自然生境中能抵抗不良生理环境,在一定程度上
能保护麻疯树的正常发育与生长。林娟等[23]依据
Curcin-L 的 N 端部分氨基酸设计引物,从未成熟种
子 总 RNA 中 克 隆 到 Curcin-L 全 长 cDNA 序 列。 该
cDNA 全 长 由 1 173 个 碱 基 组 成, 包 含 一 个 编 码,
293 个氨基酸的前体蛋白,前 42 个氨基酸为信号肤。
将 Curcin-L 的编码区与表达载体 pQE-3 相连后,转
入大肠杆菌中得到了有效的表达。
由于麻疯树种植区域狭窄,仅分布在热带亚
热带地区,低温冻害是麻疯树引种、扩大栽培与速
生丰产的主要影响因子。因此,目前麻疯树抗逆性
育种的目标主要集中在培育抗寒能力强的优良品
种。朱双等[24]克隆得到麻疯树质体甘油 -3-磷酸
酰 基 转 移 酶(JcGPAT2) 基 因(GenBank 登 录 号 :
FJ952147), 其 cDNA 全 长 1 516 bp, 其 中 编 码 区
1 389 bp,编码 462 个氨基酸,在冷处理麻疯树叶
片中,其受冷诱导后表达量在处理 4 h 时显著增加,
12 h 后又逐渐降低,表明 JcGPAT2 在种子油脂合成
和抗冷性反应中可能起到重要作用。ERF 转录因子
是一类在植物抵抗非生物胁迫中起到重要调控作用
的转录因子。Tang 等[25]首次从麻疯树体内分离得
到了 AP2 /ERF 家族的基因 JcERF,并对该基因进
行了功能分析发现,在拟南芥中超量表达的麻疯树
JcERF 基因可增加转基因株的耐冷和耐盐性。植物
对低温、高盐及干旱耐性的强弱并非取决于某单一
因子,而是受到许多因子的影响[26],通过转录因子
与多个胁迫相关基因的调控,使这些相关的基因被
激活进而使植株的抗耐性得到很好的改善。
2 麻疯树组织培养再生体系的建立
目前国内外关于麻疯树的组织培养和植株再生
的研究已有不少,主要采用腋芽快繁[27-31]、子叶和
胚轴再生[32-35]和叶片再生[32]方法。
腋芽再生是快速繁殖中的一种重要的离体繁殖
方法。李化等[27]研究发现随着 BA 的浓度增加,腋
芽诱导数也大量增加,平均每个外植体诱导的腋芽
个数可以达到 8 个以上,但是腋芽分化越多,变异
量也越多。陈金红等[28]使用野外采集的枝条,研
究腋芽的增殖培养,在培养基组合为 2.5 mg/L BA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期4
和 0.1-0.5 mg/L IBA 时效果最好,出芽率最高,可
以达到 47.6%- 47.8%,同时丛生芽的数量也最多。
Mukul[29]和 Kalimuthu[30]调整培养基的组合使每个
腋芽分化 30-40 个腋芽。Sarika 等[31]用腋芽作为外
植体,在培养基中加入了硫酸腺嘌呤、谷氨酰胺和
精氨酸(15-50 mg/L),可大大提高腋芽的增殖率。
组织再生体系中,使用子叶或胚轴作为外植
体诱导不定芽比较常见。林娟等[32]利用子叶和下
胚轴诱导出愈伤组织,继续分化出芽,子叶诱导
芽的频率为 47.1%,而下胚轴芽的诱导频率只有
21%。秦虹等[33]通过改变激素的种类,在 MS+BA
5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 培养基上可以有效诱导出不
定芽,分化率高达 80%,同时还提高了诱导的速度。
Verma 等[34]通过比较不同外植体(叶柄、顶芽、叶
片)诱导麻疯树植株再生发现,顶芽最适宜诱导愈
伤组织,而从愈伤组织到不定芽的诱导是叶柄最好。
芽诱导培养基为 MS+IBA 0.3 mg/L+BA 0.15 mg/L,诱
导率 75%。而 Li 等[35]以麻疯树的子叶为外植体,
在芽的诱导中通过添加赤霉素,使诱导频率达到了
94%,这是目前再生频率报道的最高值。
采用叶片再生出不定芽包括直接再生和间接
再生方法。间接再生途径即先诱导出愈伤组织,然
后再诱导出不定芽 ;直接再生途径是直接从叶片
诱导出不定芽。陆伟达等[36]采用叶片间接再生方
法,在光照的条件下经过 3 周诱导出愈伤组织,再
经过 4 周诱导出不定芽,最佳组合为 0.5 mg/L BA,
1.0 mg/L IBA,不定芽再生频率为 56%。本研究团
队刘伯斌等[37]以温室中的麻疯树叶片为材料,研
究了 6-BA 和 IBA 对愈伤组织和不定芽诱导率的影
响,麻疯树叶盘间接再生率达到 90.9%,平均不定
芽个数达到 4-6 个。虽然叶盘间接再生能取得较高
的再生频率,但直接分化再生相对周期短,操作简
单,未经过脱化能保持遗传稳定性,Deore 等[38]使
用 TDZ,经过 6 周时间的诱导实现了叶盘直接诱导
出不定芽,最佳组合 0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L BA +0.1
mg/L IBA,诱导频率为 53.5%。刘伯斌[39]采用最佳
激素组合为 1.0 mg/L TDZ+1.5 mg/LBA +0.5 mg/LIBA,
经过 4 周的培养,可再生出大量不定芽,再生频率
可以达到 88%,缩短了麻疯树叶盘直接再生时间,
提高了直接再生频率。
除此之外,任琛等[40]、侯佩等[41] 分别用利
用花药和胚乳进行初步研究了愈伤组织的形成,为
麻疯树的单倍体和多倍体育种奠定了基础。随后,
Timir 等[42]进行了体胚发生的研究,以幼嫩的叶片
为外植体,采用最优培养基为 MS+0.5 mg/L KT+0.2
mg/L IBA,4 周得到球形胚状体,诱导率为 80%,进
而诱导出完整的植株,实现了由体胚发生途径来诱
导植株的途径。
另外,植物悬浮细胞能作为转基因技术的受
体材料,能应用于植物转基因方面的研究,也是组
织培养上的一个重要研究方向。本研究团队[43]建
立了麻疯树悬浮培养细胞系,愈伤组织进行悬浮
培养的最适培养基为 MS+NAA 0.2 mg/L+2,4-D 1.0
mg/L+BA 0.5 mg/L,并对其悬浮培养的生长特性作了
初步探讨,为麻疯树细胞的大规模悬浮培养和基因
转化研究奠定了基础。
3 麻疯树转基因技术和遗传改良的研究
从 1983 年首次获得转基因植物开始,植物转
基因技术迅猛发展,为了提高麻疯树种子含油量及
改变油的组成,增强对病虫害的抵抗及对环境的适
应能力,因此需要对麻疯树进行遗传改良。遗传改
良的方法中诱导突变具有不确定性,可以通过种间
杂交引入优良性状,但周期太长,还不能够获得特
异外源基因,因此利用基因转化技术改变遗传背景
是目前麻疯树遗传改良的重点研究方向。麻疯树转
基因方法主要有农杆菌介导转化法[35,44-48]、基因枪
法[49,50]和纳米基因转化法[51,52],详见表 1。
3.1 农杆菌介导转化法
农杆菌介导转化法是遗传转化系统中研究得最
多、机理最清楚、技术最成熟的基因转化系统。农
杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将 T-DNA 插
入到植物基因组中。中国科学院华南植物所李美茹
等[35]通过瞬时表达测定的方法首次研究了农杆菌
处理方式、外植体类型等对转化的影响,同时进行
了药物敏感性试验,初步建立了转化体系。在此基
础上,李美茹[44]再以子叶为外植体,建立以潮霉
素和除草剂为筛选标记和以 GUS 为报告基因的农杆
菌转化体系,获得了具有除草剂抗性的转基因植株,
这是第一例麻疯树转基因植株的报道。张明婧[45]
2014年第3期 5王琼等 :能源植物麻疯树分子育种研究进展
将细胞分裂素合成限速酶-异戊烯基转移酶基因(ipt)
导入麻疯树的基因中,并对转基因植株的生理特性
进行检测,筛选出了抗寒性增加的转基因麻疯树。
日本大阪大学 Khemkladngoen 研究小组[46]为建立一
个高效的麻疯树农杆菌介导体系,测试了超声、涡
流等不同愈伤处理方法。结果表明,外植体进行 1
min 的超声处理,然后在农杆菌悬浮液中摇动 9 min
时,能达到最高的最稳定的转化率(约 53%),如
图 1 所示。在此基础上,为了改善麻疯树的耐旱性能,
该研究小组还研发了 3 种不同转基因植物[47]。第 1
种转 PPAT 基因,该基因编码能催化乙酰辅酶 A 生
物合成途径产生的酶。第 2 种是过表达的 NF-YB 基
因,它编码 NF-Y 的亚基转录因子,第 3 个是 GSMT
和 DMT 基因,它编码能催化生产甜菜碱的酶。初
步结果表明转入 GSMT 和 DMT 基因能成功表达,并
增强麻疯树中甜菜碱的合成,从而有效地提高了麻
疯树耐旱性能。新加坡国立大学 Qu 等[48]通过全
基因序列分析首先确定 3 个假定的脂肪酸脱氢酶基
因(FAD2),再构建种子特异表达的 RNA 干扰载
体,试验结果表明仅 FAD2-1 基因的表达得到下调。
转 JcFAD2-1 基因植物增加了油酸含量(大于 78%),
而其种子油中的不饱和脂肪酸相应减少(小于 3%),
从而提高了油的质量,高种子油酸含量并未对麻疯
树其他性状产生负面影响。这可能是世界上第一个
提高生物柴油质量的转基因麻疯树品种。
3.2 基因枪介导的转化法
基因枪(Particle gun)又称微弹轰击法,是目
前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。利用火
药爆炸或高压气体加速(加速设备称为基因枪)将
包裹了带目的基因的 DNA 溶液的高速微弹直接送入
完整的植物组织和细胞中,然后通过细胞和组织培
养技术,再生出植株,其中的阳性植株即为转基因
植株。与农杆菌转化相比,基因枪法转化虽然存在
整合率低、成本昂贵等不足,但其主要优点是不受
受体植物范围的限制,而且其载体质粒的构建也相
对简单。到目前为止,已发表文献中仅有两篇[49, 50]
利用基因枪法进行麻疯树遗传转化,并且只限于
物理参数的优化和初步转化的表征。印度理工学
院 Purkayastha 等[49]使用茎尖作为轰击的靶组织。
首先得到最大转化频率外植体,加入苄氨基嘌呤
(BAP2.5 μmol/L)和赤霉素(GA30.5 μmol/L)可有
效促进芽的生成和伸长,在花椰菜花叶病毒(CaMV)
35S 启动子控制下,利用粒子轰击法将含有 GUS-INT
和 NPTII 基因转入到麻疯树中,首次利用基因枪介
导法建立了麻疯树的遗传转化体系。用 1 μm 金颗粒
a b c
d e f
a-c:在含抗生素的芽伸长培养基中转化的外植体;a:涡流搅拌 15 s;
b :超声 1 min ;c :超声 2 min ;d :在含抗生素的芽伸长培养基中
生长良好的芽 ;e :转化生根试管苗 ;f :园艺土壤培养的转基因植
物 ;坐标 :5 mm[46]
图 1 转化后的麻疯树再生培养
表 1 麻疯树遗传转化方法简述及优缺点
麻疯树遗传转化方法 方法简述 优点 缺点 参考文献
农杆菌介导 用农杆菌感染植物受伤部位,将农
杆菌细胞中携带的 T-DNA 插入植物
基因组中,获得转基因植株
应用广泛,转化效率高,培养
周期短,遗传稳定性较高
T-DNA 整合不稳定,转化株遗
传稳定性差,有时还会出现非
目的性状变异
[35][44-48]
基因枪 通过高速飞行的纳米金属颗粒将包
被基因导入细胞
无宿主限制 ;受体类型广泛 ;
操作简便
嵌合体多、外源基因的插入具
有随机性且成本甚高
[49,50]
纳米载体转导 利用纳米粒子将目的基因导入细胞
或组织
无病毒载体毒性和免疫原性。
DNA 装载量大,有保护作用,
载体组装难度相对低。
目的基因的释放不受控制,表
达也不受控制,转染效率低
[51,52]
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期6
在压力为 1 100 psi、目标距离为 9 cm 时对外植体轰
击两次可获得的最高转化率。利用卡那霉素对转化
后增殖的茎尖进行筛选,PCR 和 Southern 印迹杂交
证实了转基因植物的目标基因已整合到基因组中,
转基因植株含有一个至多个拷贝的外源基因。随后
该国科学与工业研究理事会 Joshi 等[50]对金颗粒大
小,轰击压力,目标距离,微弹运行距离等类似的
条件进行研究,找到了适合胚轴轰击的最优条件,
转化效率能达到 44.7%。与传统育种技术结合的基
因工程将是改善麻疯树品种的一种有力工具,但目
前麻疯树基因改造的研究报道很少,且只在子叶和
叶片外植体的使用上,具有理想性状的转基因方面
的研究并没有取得多大进展。
3.3 纳米载体转基因法
纳米转基因技术是利用纳米粒子将目的基因导
入细胞或组织内的技术,目前在动物和人体细胞的
基因治疗等方面已取得成功。美国爱荷华州立大学
科学家们利用二氧化硅纳米粒子(MSN)装载基因
穿过植物细胞壁,成功获得了转基因植株,首次将
纳米科技带入植物学的领域。纳米转基因技术的优
势在于纳米载体突破病毒载体的病毒性和广泛的免
疫原性,而且纳米载体的 DNA 装载量大,载体组
装难度相对低。另外,合适的纳米载体本身还能对
DNA 和 RNA 起保护作用。由此可见,纳米转基因
技术给基因工程带来了新的发展契机。本实验室[51]
使用半胱氨酸作为稳定剂和最优实验条件自组装合
成水溶性 CdSe 纳米粒子,并建立荧光光谱。量子点
再通过静电作用标记壳聚糖 -DNA(CS-DNA)纳米
粒子,CdSe /CS-DNA 复合物展现出了优越的荧光特
性,该复合体系优于农杆菌介导的麻疯树基因遗传
转化方法。PCR 检测结果和激光共聚焦显微镜检测
到 CdSe /CS-DNA 复合物转导入麻疯树愈伤组织细胞
的过程中,报告基因 GFP 并未发生降解,绿色荧光
信号表示该基因已经进入植物细胞内部,并得到表
达。该方法为麻疯树基因转化技术的发展带来新的
研究方向。随后本团队[52]还将该纳米复合物载体
用于麻疯树的悬浮细胞系的直接转化,建立了麻疯
树基因转化新方法,为后续麻疯树遗传改良新技术
的完善和优良品种的产生奠定了基础。
4 展望
目前麻疯树克隆得到的基因较少,很多的基因
组、转录组信息还有待进一步分析鉴定。对于功能
基因的分离和克隆多限于表达模式分析和原核表达
阶段。虽然有文献提供了转基因麻疯树提高油质,
抗寒、抗旱性和降低毒性等方面的试验数据,非常
有价值,但对于转基因功能验证方面的工作却开展
相对较少。而到目前为止,似乎尚未有转基因麻疯
树规模化实地测试的报道。另外,一个麻疯树遗传
转化研究中亟需解决的问题是,由于转入基因整合
的随机性等原因,造成表达不稳定性和遗传不稳定
性,致使在商业种植条件下转基因植株产油的生产
力也同样不可预测。介于麻疯树分子育种方面存在
的这些不足,在以后的发展过程中,还必须对大量
未知和已知的基因和蛋白进行更为详尽的分析和鉴
定,以期找到提高脂肪酸含量和提高植株抗逆性的
关键基因。低成本组织培养体系的建立,大规模快
繁技术以提高生根效率、降低生产单位成本等方面
的研究也都需要进一步完善。另外,高效、稳定的
基因转化技术的研究和开发将是麻疯树分子育种发
展的一个重要方向。虽然鲜见有关麻疯树遗传转化
方面的报道,但随着分子手段的提高,对麻疯树基
因工程的深入分析和探索势在必行。
参 考 文 献
[1] 陈新 , 袁星星 , 陈华涛 , 等 . 国内外麻疯树最新研究进展[J].
江苏农业科学 , 2010(5):5-10.
[2] 田斌 , 唐军荣 , 郑元 , 等 . 我国麻疯树的遗传改良现状及建
议[J]. 贵州农业科学 , 2013, 41(6):23-27.
[3] 王海波 , 邹竹荣 , 李旭娟 , 等 . 生物能源植物小桐子功能基因及
基因组研究进展[J]. 基因组学与应用生物学 , 2012, 31(5):
522-530.
[4] 水庆艳 , 王健 , 宋希强 , 等 . 麻疯树组织培养研究进展[J]. 热
带作物学报 , 2010, 31(7):1227-1231.
[5] 刘伯斌 , 卢孟柱 , 陈介南 , 等 . 麻疯树基因转化研究进展[J].
林业实用技术 , 2009, 5 :30-32.
[6] Lin J, Chen Y, Xu Y, et al. Cloning and expression of curcin,
a ribosome-inactivating protein from the seeds of Jatropha
curcas[J]. Acta Bot Sinica, 2003, 45(7):858-863.
[7] 魏琴 , 张新申 , 黄明星 , 等 . 麻疯树逆境蛋白(curcin2)基因
2014年第3期 7王琼等 :能源植物麻疯树分子育种研究进展
的原核表达[J]. 四川大学学报 :自然科学版 , 2006, 43(l):
206-211.
[8] Qin XB, Zhang JP, Shao CX, et al. Isolation and characterization of
a curcin promoter from Jatropha curcas L. and its regulation of gene
expression in transgenic tobacco plant[J]. Plants Mol Biol Rep,
2009, 27 :275-281.
[9] 王治涛 , 高帆 , 张淑文 , 等 . 麻疯树胚乳 cDNA 文库的构建与分
析[J]. 四川大学学报 :自然科学版 , 2007, 44(1):173-175.
[10] 付瑜华 , 陈新 , 王文泉 , 等 . 麻疯树 FAD3 基因的克隆及亚细
胞定位研究[J]. 热带作物学报 , 2012, 33(11):2030-2034.
[11] Xie WW, Gao S, Wang SH, et al. Cloning and expression analysis
of carboxyltransferase of acetyl-coA carboxylase from Jatropha
curcas[J]. Z Naturforsch C, 2010, 65(1/2):103-108.
[12] 范正琪 , 李纪元 , 田敏 , 等 . 麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸梭化酶
pepc 基因全长 cDNA 克隆及序列分析[J]. 林业科学研究 ,
2010, 23(3):349-354.
[13] 范正琪 , 卢孟柱 , 李纪元 , 等 . 麻疯树 pepc 基因正义、反义植
物表达载体构建与功能初步分析[J]. 林业科学研究 , 2010,
24(2):165-170.
[14] 江璐玎 , 王云霄 , 王迎春 , 等 . 麻疯树酰基载体蛋白的基因克
隆、表达分析及原核表达[J]. 应用与环境生物学报 , 2008,
14(6):769-773.
[15] Wu PZ, Li J, Wei Q, et al. Cloning and functional characterization
of an acyl-acyl carrier protein thioesterase(JcFATB1)from Jatro-
pha curcas[J]. Tree Physiol, 2009, 29 :1299-1305.
[16] Luo T, Peng SM, Deng WY, et al. Characterization of a new stearoyl-
acyl carrier protein desaturase gene from Jatropha curcas[J].
Biotech Lett, 2006, 28(9):657-662.
[17] 曾玲 , 吴平治 , 魏倩 , 等 . 麻疯树 JcFAD7 基因启动子克隆及
植物表达载体构建[J]. 广东农业科学 , 2010, 9 :177-180.
[18] 文明富 , 卢诚 , 王海燕 , 等 . 能源植物麻疯树遗传改良国内研
究进展[J]. 热带作物学报 , 2011, 32(12):2385-2393.
[19] Ohlrogge JB, Kuo TM. Plants have isoforms for acyl carrier protein
thatare expressed differently in different tissues[J]. J Biol Chem,
1985, 260 :8032-8037.
[20] 元冬娟 , 吴湃 , 江黎明 . 高等植物的酰基 -ACP 硫酯酶研究进
展[J]. 中国油料作物学报 , 2009, 31(1):103-108.
[21] Ye J, Qu J, Bui HTN, et al. Rapid analysis of Jatropha curcas gene
functions by virus-induced gene silencing[J]. Plant Biotech J,
2009, 7(9):964-976.
[22] Zhang Y, Wang YX, Jiang L, et al. Aquaporin JcPIP2 is involved in
drought responses in Jatropha curcas[J]. Acta Biochim Biophys
Sin, 2007, 39(10):787-794.
[23] Lin J, Chen Y, Xu Y, et al. Cloning and expression of curcin,
a ribosome -inactivating protein from the seeds of Jatropha
curcas[J]. Acta Botanica Sinica, 2003, 45(7):858-863.
[24] 朱双 , 曾玲 , 吴平治 , 等 . 麻疯树质体甘油 -3-磷酸酰基转移
酶(JcGPAT2)cDNA 的克隆及序列分析[J]. 广东农业科学 ,
2012, 11 :1-5.
[25] 唐跃辉 , 吴平治 , 陈雅平 , 等 . 一个麻疯树 AP2 /ERF 家族基
因的克隆和植物表达载体的构建[J]. 安徽农业科学 , 2013,
41(13):5677-5679.
[26] Tang M, Sun J, Liu Y, et al. Isolation and functional characterization
of the JcERF gene, a putative AP2/EREBP domain-containing
transcription factor, in the woody oil plant Jatropha curcas[J].
Plant Molecular Biology, 2007, 63(3):419-428.
[27] 李化 , 曾妮 , 贾勇炯 , 等 . 麻疯树的促腋芽分枝快繁及生根诱
导[J]. 四川大学学报 :自然科学版 , 2006, 43(5):1116-
1120.
[28] 陈金红 , 陈金洪 , 高敏 , 等 . 麻疯树茎段离体培养及快速繁殖
研究[J]. 广西农业科学 , 2006, 37(3):221-223.
[29] Mukul MD, Priyanka M, Biswajit G, et al. In vitro clonal propagation
of biodiesel plant(Jatropha curcas L. )[J]. Current Science,
2007, 93(10):1438-1442.
[30] Kalimuthu K, Paulsamy S, Senthilkumar R, et al. In vitro
propagation of the biodiesel plant Jatropha curcas L. [J]. Plant
Tissue Cult & Biotech, 2007, 17(2):137-147.
[31] Sarika S, Meenakshi B. In vitro clonal propagation of physic nut
(Jatropha curcas L. ):influence of additives[J]. International
Journal of Integrative Biology, 2008, 3 :73-79.
[32] 林娟 , 唐琳 , 陈放 . 麻疯树的组织培养及植株再生[J]. 植物
生理学讯 , 2002, 39(3):252.
[33] 秦虹 , 宋松泉 , 龙春林 , 等 . 小桐子的组织培养和植株再生[J].
云南植物研究 , 2006, 28(6):649-652.
[34] Verma KC, Gaur AK, Singh US. Evaluation of in vitro responses
from different explants of elite Jatropha curcas L. [J]. Indian
Journal of Plant Physiology, 2008, 13(3):231-237.
[35] 李美茹 , 洪清 , 国江 . 影响农杆菌介导的麻疯树基因转化因素
的研究(简报)[J]. 分子细胞生物学报 , 2006, 39(1):83-
89.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期8
[36] 陆伟达 , 魏琴 , 唐琳 , 等 . 麻疯树愈伤组织的诱导及快速繁
殖[J]. 应用与环境生物学报 , 2003, 9(2):127-130.
[37] 刘伯斌 , 卢孟柱 , 李玲 , 等 . 麻疯树叶盘法高效再生的研究
[J]. 林业科学研究 , 2010, 23(3):326-329.
[38] Deore AC, Johnson TS. High-frequency plant regeneration from
leaf-disc cultures of Jatropha curcas L. :an important biodiesel
plant[J]. Plant Biotechnol Rep, 2008, 2 :7-11.
[39] 刘伯斌 , 麻疯树的高效再生和基因转化研究[D]. 长沙 :中
南林业科技大学 , 2009.
[40] 任琛 , 侯佩 , 邓鹜远 , 等 . 麻疯树花药愈伤组织诱导的初步
研究[J]. 四川大学学报 :自然科学版 , 2006, 43(3):717-
719.
[41] 侯佩 , 张淑文 , 杨琳 , 等 . 麻疯树胚乳愈伤组织诱导及其污染
消除[J]. 应用与环境生物学报 , 2006, 12(2):264-268.
[42] Timir BJ, Mukherjee P, Datta MM, et al. Somatic embryogenesis
in Jatropha curcas L. , an important biofuel plant[J]. Plant
Biotechnol Rep, 2007, 1(3):135-140.
[43] 王琼 , 孔倩倩 , 李志辉 , 等 . 麻疯树悬浮细胞系的建立与优
化[J]. 生物技术通报 , 2012(10):173-179.
[44] L i MR, L i HQ, J iang HW, e t a l . Es tab l i shment o f an
Agrobacteriuim- mediated cotyledon disc transformation method for
jatropha curcas[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult, 2008, 92(2):
173-181.
[45] 张明靖 , 赵德刚 , 胡远 . 小油桐组织培养及遗传转化体系建
立[C]. 生命科学与生物技术前沿研讨会 , 中国生物工程杂
志增刊 , 2007, 27 :74-75.
[46] Khemkladngoen N, Cartagena J, Fukui K. Physical wounding-
assisted Agrobacterium-mediated transformation of juvenile
cotyledons of a biodiesel-producing plant, Jatropha curcas L. [J].
Plant Biotechnol Rep, 2011, 5 :235-243.
[47] Tsuchimoto S, Cartagena J, Khemkladngoen N, et al. Development
of transgenic plants in jatropha with drought tolerance[J]. Plant
Biotechnology, 2012, 29(2):137-143.
[48] Qu J, Mao HZ, Chen W, et al. Development of marker-free
transgenic jatropha plants with increased levels of seed oleic
acid[J]. Biotechnology for Biofuels, 2012, 5 :10-16.
[49] Purkayastha J, Sugla T, Paul A, et al. Efficient in vitro plant
regeneration from shoot apicesand gene transfer by particle
bombardment in Jatropha curcas[J]. Biol Plant, 2010, 54 :13-
20.
[50] Joshi M, Mishra A, Jha B. Efficient genetic transformation of
Jatropha curcas L. by microprojectile bombardment using embryo
axes[J]. Ind Crops Prod, 2011, 33 :67-77.
[51] Wang Q, Chen JN, Zhang HY, et al. Synthesis of water soluble
quantum dots for monitoring carrier-DNA nanoparticles in plant
cells[J]. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2011, 11
(3):2208-2214.
[52] Chen JN, Wang Q, Zhang L, et al. Establishment and optimization
of a nano transgenic system for molecular breeding of Jatropha
curcas[J]. Journal of Bionanoscience, 2013, 7 :1-5.
(责任编辑 狄艳红)