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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):209-217
聚唾液酸（Polysialic acid，PSA）是以 N- 乙酰
神经氨酸为单体，以 α-2，8 和 / 或 α-2，9 糖苷键
连接的聚合度在 8-400 的聚阴离子型线性多糖［1-4］，
通常存在于脊椎动物细胞的神经黏附分子（NCAM）
末端和一些致病菌（如大肠杆菌 K1 株和奈瑟斯脑
膜炎球菌）细胞表面。在脊椎动物体内，PSA 参与
细胞迁移、突触形成等生物功能且与神经系统的可
塑性有关。由于 PSA 具有良好的生物相容性和生物
可降解性，因此 PSA 可用作神经再生修复的组织工
程支架材料［5］。另外，PSA 在结构上具有较多羟基，
从而具有高度亲水性，再加上其非免疫原性，使得
聚唾液酸化的药物可以延长在血液循环中的半衰期，
是目前发现可以替代聚乙二醇（PEG）的比较理想
的蛋白类药物缓释材料［6］。
目前，生产 PSA 的唯一方法是通过微生物发酵，
之后从发酵液中提取、纯化来制备［7，8］，用于生产
收稿日期 ：2014-12-19
基金项目 ：国家“863”计划项目（2012AA021505），江苏省自然科学基金项目（BK2011158）
作者简介 ：闫霞，女，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：13643544548@126.com
通讯作者 ：吴剑荣，男，副教授，硕士生导师，研究方向 ：工业微生物 ；E-mail ：kinowu@jiangnan.edu.cn
大肠杆菌 K235 能量代谢扰动影响聚唾液酸合成的研究
闫霞  吴剑荣  郑志永  詹晓北
（江南大学生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）
摘 要 ： 通过不同装液量、不同氧化还原状态的碳源和添加 NAD+ 的前体烟酸来调控大肠杆菌胞内的能荷、还原力水平，研
究胞内核苷酸和聚唾液酸合成之间的关系。结果表明，聚唾液酸合成量越高，胞内 UTP 含量越低、UMP 含量越高 ；同时，合成
UTP、CTP 消耗大量 ATP 使胞内能荷水平较低。与其他碳源的发酵相比，以山梨醇为碳源时，由于胞内 NADH 水平的提高使菌体
合成的聚唾液酸量最高。添加烟酸可以提高胞内的 NAD+ 水平，导致胞内的氧化水平提高，从而使胞内还原产物如聚唾液酸、琥珀酸、
乳酸的产量降低甚至消失。
关键词 ： 大肠杆菌 ；聚唾液酸 ；能荷 ；核苷酸 ；氧化还原势
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.030
Influence of Perturbation of Energy Metabolism in Escherichia coli
K235 on Biosynthesis of Polysialic Acid
Yan Xia Wu Jianrong Zheng Zhiyong Zhan Xiaobei
（Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，
Wuxi 214122）
Abstract: Different medium volumes, carbon sources with varied redox states and adding nicotinic acid, and the precursor of NAD+ were
used to adjust the intracellular energy charge and reduction of Escherichia coli in order to investigate the relationships between biosynthesis of
polysialic acid and intracellular nucleotides. The results showed that the higher the production of polysialic acid was, the lower UTP was, but
higher UMP was. Meanwhile, energy charge level was lower because the synthesis of UTP and CTP consumed a lot of ATP. Using sorbitol as
carbon source, more polysialic acid was produced than those of fermentation with glucose, xylose and sodium gluconate due to the increase of
NADH. Addition of nicotinic acid to the fermentation medium elevated intracellular NAD+, which led to the raise of intracellular oxidative stress,
sequentially the decrease of the reducing metabolites such as polysialic acid, succinate and lactate, and even the vanish of them.
Key words: Escherichia coli ；polysialic acid ；energy charge ；nucleotides ；redox potential
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9210
PSA 的大肠杆菌（Escherichia coli）主要有 K235 和
K1 两株［9，10］。从 1999 年起，本实验室对利用 E.
coli K235 生产 PSA 进行研究，通过诱变、培养基的
优化、培养条件的优化，使 PSA 的产量较出发菌株
提高了 5 倍［9，11］。但总体而言，PSA 的产量仍较
低，且菌株的 PSA 产量不稳定，难以满足产业化的
需求。
我们前期研究发现 E. coli K235 发酵生产 PSA
受溶氧的严重影响［12］，而氧作为电子传递链（Elec-
tron transport chain，ETC）的最终电子受体直接影响
微生物细胞内的能荷（Energy charge，EC）和氧化
还原状态。调节微生物细胞内能荷、还原力的方法
有细胞改造和发酵工艺调节两种方法。其中，细胞
改造方法包括 ：（1）通过基因工程操作使与 NAD+/H
代谢 有 关 的 酶 过 量 表 达 ［13，14］；（2） 将 与 NAD+/H
竞争的代谢途径删除［15，16］；（3）引入其他生物的
NAD+/H 再生系统［17，18］。发酵工艺调节方法包括 ：
补加（1）外源电子受体例如富马酸［19］、乙醛［20］；
（2）不同氧化还原状态的碳源［21］，如山梨醇、葡萄
糖、葡萄糖酸钠 ；（3）NAD+ 的前体。本研究尝试利
用不同氧化还原状态的碳源和 NAD+ 合成的前体来
调控菌体细胞内能荷、还原力水平，探索其与 PSA
合成之间的联系，用于指导 PSA 的生产合成。
1 材料与方法
1.1 材料
大 肠 杆 菌（Escherichia coli CCTCC M208088），
由江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室保
藏。ATP、ADP、AMP、UMP、UTP、NAD+ 等 购 于
Sigma-Aldrich 公司，其他药品由国药试剂提供。
斜面培养基（g/L）：氯化钠 5，胰蛋白胨 10，
牛肉膏 3，琼脂粉 20，pH7.2-7.4。种子培养基（g/L）：
氯化钠 5，胰蛋白胨 10，牛肉膏 3，pH7.2-7.4。发
酵 培 养 基（g/L）：山 梨 醇 40， 硫 酸 铵 4.94，磷 酸
氢二钾（三水）26.2，胰蛋白胨 1.5，硫酸镁 0.9，
pH7.8（灭菌前）。
1.2 方法
1.2.1 斜面培养 将保存于 4℃ 冰箱里的菌种，挑
取一环到准备好的固体斜面培养基上，在 37℃ 恒温
箱内恒温培养 12 h。
1.2.2 种子培养 将斜面培养活化后的种子接种两
环于 250 mL 三角瓶中（内装 50 mL 种子培养基）后，
放置于摇床中培养，摇床条件为转速 250 r/min、温
度 37℃，培养 8-10 h。
1.2.3 发酵培养 将准备好的种子培养基按照 4%
的接种量接种于 250 mL 三角摇瓶（内装 35 mL 发酵
培养基）后，250 r/min、37℃培养 60 h。
1.2.4 烟酸对 PSA 发酵的影响 准确称取 1 g 烟酸
溶于 1 L 蒸馏水中，配制成 1 g/L 的烟酸溶液，灭
菌 待 用。 向 分 装 灭 菌 的 1.2 的 发 酵 培 养 基 中（35
mL/250 mL）分别加入上述 1 g/L 的烟酸溶液 175 μL、
350 μL、525 μL、700 μL，配制成含烟酸为 5 mg/L、
10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L 的发酵培养基，研究烟
酸对 PSA 发酵的影响。
1.2.5 分析方法
1.2.5.1 生物量测定 将样品稀释至一定倍数后，
测定 600 nm 下吸光值，然后对照 OD600 吸光度 - 菌
体干重的标准曲线计算生物量，OD600=1.0 相当于 0.4
g/L 细菌干重。
1.2.5.2 PSA 的 测 定 对 PSA 的 测 定 采 用 间 苯 二
酚法［12］。
1.2.5.3 碳源及有机酸含量的测定 发酵液离心后
即得待测样品，利用高效液相色谱（LC-2010A，岛
津）测定，色谱柱为 Aminex HPX-87H（9 μm，300
mm×7.8 mm，Biorad）；流 动 相 为 5 mmol/L 硫 酸 ；
流动相流速 0.6 mL/min ；示差检测器 ；柱温 35℃ ；
进样量 5 μL。
1.2.5.4 胞内核苷酸的测定 样品的处理 ：取 4 mL
对数中期发酵液，经 4℃，12 000 r/min 离心 10 min
后，弃去上清，得到菌体，将获得的菌体悬浮于 2
mL 预冷的 0.1 mol/L pH7.4 的磷酸钾缓冲液中，超声
波破碎（超声 1 s，间隔 1 s，）10 min，之后经 4℃，
12 000 r/min 离心 10 min，得到的上清于 HPLC 中进
行测定。
色谱条件：色谱柱为 InertSustain C18 柱（5 μm，4.6
mm×250 mm，Shimadzu）；流动相为 20% 乙腈与含
20 mmol/L 四丁基溴化铵的 0.4 mol/L pH7.0 磷酸钠缓
冲液以 1∶1 混合 ；流动相流速 0.5 mL/min ；紫外检
测器 ；检测波长 254 nm ；柱温 25℃ ；进样量 10 μL。
2015,31(9) 211闫霞等：大肠杆菌 K235 能量代谢扰动影响聚唾液酸合成的研究
2 结果
2.1 装液量对PSA发酵的影响
2.1.1 装液量对 PSA 合成和菌体生长的影响 由图
1 可以看出，与装液量 35 mL 的发酵结果相比，其
它装液量下菌体的 PSA 产量和生长状况都较差，尤
其在装液量大时更为明显。当装液量为 50 mL 时
PSA 产量和生物量分别为 1.08 g/L 和 3.02 g/L，而装
液量为 35 mL 时，PSA 产量和生物量分别达 1.51 g/L
和 4.07 g/L。山梨醇消耗与 PSA 产量、菌体生长趋
势相一致。如图 1 所示，当装液量为 35 mL，菌体
的山梨醇消耗量最大，为 22.40 g/L。
20 25 30 35 40 45 50 55
0
1
2
3
4
5⭏⢙䟿ǃPSA䟿/g·L-1  㻵⏢䟿mL
⭏⢙䟿 PSA ⎸㙇ኡỘ䞷
0
6
12
18
24 ⎸㙇ኡỘ䞷/g·L-1 
图 1 不同装液量下的发酵参数
2.1.2 装液量对有机酸合成的影响 不同装液量下
有机酸的合成情况如图 2 所示。在装液量小的情况
下，柠檬酸合成量较高 ；当装液量为 25 mL 时，柠
檬酸的合成量最高，为 62.33 mmol/L。而当装液量
分别为 35 mL、40 mL、45 mL、50 mL 时，柠檬酸的
合成量比较接近，为 55 mmol/L 左右。获得 PSA 产
量最高的装液量（35 mL）下，乙酸的合成量也最低
（1.82 mmol/L），远低于其它装液量下的乙酸合成量，
表明该条件下供氧充足，消耗的山梨醇用于菌体生
长和 PSA 合成。在各个装液量下乳酸、琥珀酸的合
成量较低或无法检测到，而在所有的装液量下没有
乙醇的合成（数据没有给出）。
2.1.3 装液量对胞内核苷酸的影响 根据上述结
果可知，E. coli 合成 PSA 受溶氧的影响，而氧作为
ETC 的最终电子受体与氧化磷酸化产生能量密切相
关。在不同装液量下胞内能荷与 PSA 合成的关系如
图 3 所示，随着摇瓶装液量的增大，胞内 ATP 含量
0
15
30
45
60
75 ҉䞨mmoL·L-1 Ḑ⃜䞨mmoL·L-1  㻵⏢䟿mL25 30 35 40 45 50 0246
8
10
Ḑ⃜䞨 ҉䞨
图 2 不同装液量下的有机酸合成量
缓慢下降，从 25 mL 装液量的 3.22 μM/g·cell 下降到
50 mL 装液量的 2.65 μM/g·cell，而 EC 水平在装液
量为 35 mL 时最低（0.22），此时 PSA 的产量最高。
在 E. coli 合成 PSA 的过程中，ATP 除了用于菌
体生长外，还用于合成 UTP、CTP、GTP 等高能物
质。其中 UTP 用于 UDP- 葡萄糖胺和 CTP 的生成，
CTP 用于活化 PSA 合成前体——N- 乙酰神经氨酸
（Neu5Ac）和 2- 酮基 -3- 脱氧辛酸（KDO），因此菌
体细胞内 UTP、CTP 的含量也将影响 PSA 合成。装
液量对胞内 UTP、UMP 的影响如图 3 所示，随着装
液量的增加，胞内 UTP 的量先下降后上升，在装液
量为 35 mL 时菌体细胞内的 UTP 含量最低，为 3.38
μM/g·cell。而菌体细胞内 UMP 的含量随装液量的
增加先上升后下降，在装液量为 35 mL 时 UMP 含
量最高，为 83.19 μM/g·cell。菌体合成 PSA 消耗的
UTP 转化为 UDP、UMP，从而使 UMP 的量明显高
于其他装液量。
根据上述分析，菌体 PSA 合成和溶氧有紧密的
联系，而氧气在代谢过程中作为电子受体接受通过
ETC 传递的质子并最终被氧化为水，伴随氧气的氧
化同时释放能量，同时携带电子的载体是 NADH，
其与胞内氧化还原水平密切相关，因此胞内能荷、
还原力的变化存在一定的关联性。故初步确定 PSA
的合成与能荷、还原力有密不可分的关系。
2.2 不同氧化还原状态的碳源对PSA发酵的影响
2.2.1 碳源对 PSA 合成和菌体生长的影响 分别以
40 g/L 山梨醇、葡萄糖、木糖、葡萄糖酸钠为碳源
发酵生产 PSA，结果如图 4 所示。发现 E. coli K235
可以利用不同的碳源进行菌体生长，利用葡萄糖酸
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9212
钠为唯一碳源时菌体干重（1.66 g/L）仅是对照组
（4.07 g/L）的 40.8%。与其他碳源相比，山梨醇是生
产 PSA 最有效的碳源。在以葡萄糖、木糖、葡萄糖
酸钠为唯一碳源时，菌体的 PSA 产量极低，甚至无
法合成 PSA，而以山梨醇为唯一碳源时，PSA 产量
最高。此结果表明，菌体细胞的还原状态较高时更
有利于 PSA 的生成。
在消耗碳源方面，当以山梨醇、葡萄糖、木糖
为碳源时，发酵结束时碳源的消耗量分别为 22.40
g/L、18.88 g/L 和 17.35 g/L，消耗碳源量比较接近 ；
而以葡萄糖酸钠为碳源时，发酵结束后葡萄糖酸钠
的消耗量达到 37.41 g/L，碳源基本全部耗尽，如图
4 所示。利用不同碳源发酵生产 PSA 时，山梨醇、
葡萄糖、木糖的消耗主要在发酵过程的前 25 h，而
葡萄糖酸钠为碳源时，其碳源消耗速度非常快，在
发酵进行仅 12 h 时，葡萄糖酸钠的消耗量将近 30 g/L。
在以葡萄糖酸钠作为碳源时，葡萄糖酸钠的消耗量
虽然很高，但是菌体浓度和 PSA 产量都较低，且乙
酸大量合成。
2.2.2 碳源对有机酸合成的影响 在呼吸方式方面，
当以山梨醇为碳源时，菌体主要进行有氧呼吸，无
氧呼吸产物极少，发酵液中乙酸、乳酸的含量分别
仅为 1.82 mmol/L 和 0.26 mmol/L（图 5）。而当以葡
萄糖、木糖、葡萄糖酸钠为碳源时，无氧呼吸明显
加强，发酵液中存在大量被氧化的副产物如乙酸，
无氧呼吸代谢产物量明显高于以山梨醇为碳源的发
酵液中无氧呼吸代谢产物量。以葡萄糖酸钠和葡
萄糖为碳源时，发酵液中乙酸的量分别高达 287.93
mmol/L 和 86.57 mmol/L（图 5）。而乙酸的生成伴随
1 分子 ATP 的生成，这样胞内 ATP 水平有所提高，
更有利于菌体的生长。另外，一般情况下，乙酸的
大量生成是由糖酵解途径和三羧酸循环的不平衡引
起的。在以葡萄糖或葡萄糖酸钠为唯一碳源的情况
下，除了积累大量的乙酸外，还有较多的乳酸生成（积
累的乳酸量分别为 1.70 mmol/L 和 0.29 mmol/L），比
以山梨醇或木糖为碳源的乳酸积累量要高。而乳酸
的生成意味着从丙酮酸到乙酰 -CoA 这一步的代谢速
0
3
6
9
12
15
㻵⏢䟿mL25 30 35 40 45 50 0612
18
24
ATP ADP AMP EC
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
EC
A
M
PµM·g-1 ·cell-1 
AT
PǃADP/µM·g-1 ·cell
0
1
2
3
4
5
U
M
P/
µM·g-1 ·cell-1 
U
TP
/µM·g-1 ·cell-1  㻵⏢䟿mL25 30 35 40 45 50 0204060
80
100
UTP UMP
A
B
图 3 不同装液量下的胞内能荷、UTP、UMP
0
1
2
3
4
5⭏⢙䟿/g/L-1  ⭏⢙䟿 PSA ⎸㙇⻣ⓀኡỘ䞷 㪑㨴㌆ ᵘ㌆ 㪑㨴㌆䞨䫐 0.00.40.8
1.2
1.6
PS
A
/g/L-1 
0
10
20
30
40⎸㙇⻣Ⓚ/g·L-1 
图 4 不同碳源下的发酵参数
ኡỘ䞷 㪑㨴㌆ ᵘ㌆ 㪑㨴㌆䞨䫐0100200
300
400҉䞨ǃщ䞞䞨/mmol·L-1 
҉䞨 щ䞞䞨 ң䞨
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 ң䞨/mmol·L-1 
图 5 不同碳源下有机酸的合成量
2015,31(9) 213闫霞等：大肠杆菌 K235 能量代谢扰动影响聚唾液酸合成的研究
率降低，从而使糖酵解途径和三羧酸循环之间的不
平衡降低。
当以木糖为碳源时，发酵液中存在大量的丙
酮酸，高达 395.4 mmol/L，没有乳酸的生成，而其
他碳源下的发酵液中并无丙酮酸的积累，如图 5 所
示。木糖为碳源时发酵液中乙酸的积累相对于葡萄
糖、葡萄糖酸钠为碳源时低。由于木糖在代谢过程
中主要经过糖酵解途径生成丙酮酸，在丙酮酸节点
只有小部分经乙酰 -CoA 转化为乙酸。在 E. coli 的代
谢过程中，由丙酮酸生成乙酰 -CoA 时伴随甲酸的生
成，而在 4 种不同氧化还原状态的碳源下发酵液中
都未检测到有甲酸的积累，这可能是由于无氧呼吸
形成的甲酸在甲酸脱氢酶（Formate dehydrogenase，
FDHF）的催化下分解为二氧化碳和氢气。同时 4 种
碳源下柠檬酸的合成量较接近、琥珀酸的合成量较
低（数据未给出）。
2.2.3 不同碳源对胞内核苷酸的影响 分别以山梨
醇、葡萄糖、木糖、葡萄糖酸钠为碳源进行 PSA 发
酵时，最终 PSA 合成量明显不同，测定对数中期胞
内的 EC 水平，结果如图 6 所示。与对照（以 40 g/L
山梨醇为碳源的发酵）相比，以葡萄糖或葡萄糖酸
钠为碳源时，胞内的 EC 水平较高，分别为 0.42 和
0.40，远高于对照的 0.22。通过以上分析可知，当
以葡萄糖或葡萄糖酸钠为碳源时，菌体在代谢过程
中生成浓度较高的乙酸，而乙酸的生成也偶联合成
ATP，所以当葡萄糖或葡萄糖酸钠作为碳源时，胞
内的 ATP、EC 水平相对较高。当以木糖为碳源时，
由于菌体生成大量的丙酮酸，积累的丙酮酸并未通
过无氧或有氧呼吸的方式释放能量，从而导致以木
糖为碳源时，胞内的 ATP 水平较低，且 EC 水平最
低（0.21）。以葡萄糖酸钠为碳源时，虽然生成乙酸
量和生成乙酸偶联生成的 ATP 量要远远高于以葡萄
糖为碳源的情况，但由于其生成 PSA 量要高于后者，
且在 PSA 的合成中需要大量的能量，最终导致胞内
ATP、EC 水平低于以葡萄糖为碳源的发酵。
PSA 的合成需要 UTP 的参与并生成 UDP- 葡萄
糖胺，足量的 UTP 是合成 PSA 的基础。在 4 种不
同的碳源下，以葡萄糖为碳源时，胞内的 UTP 含量
最高（5.85 μM/g.cell）。此时没有 PSA 的合成，所以
UTP 可以在胞内积累，相应 UMP 的量在胞内减少，
如图 6 所示。同理，在以葡萄糖、木糖、葡萄糖酸
钠为碳源时，PSA 产量越低，胞内 UTP 含量越高，
UMP 含量越低。当以山梨醇为碳源时，菌体进行有
氧呼吸生成的 ATP 激活 UTP 合成代谢中的天冬酸氨
基甲酰转移酶，从而导致胞内的 UTP 含量相对较高，
且合成 PSA 时消耗的 UTP 使胞内的 UMP、UDP 含
量也有所提高，胞内的 UMP 量高达 83.2 μM/g.cell。
2.3 添加NAD+的前体烟酸对PSA发酵的影响
2.3.1 烟酸对 PSA 合成和菌体生长的影响 向以山
梨醇为碳源的发酵培养基中添加不同浓度的 NA，研
究 NA 对 PSA 发酵的影响。当向发酵培养基中添加
NA 后，PSA 的产量会下降（图 7），而且生物量、
消耗山梨醇量也会随之下降。向培养基中加入不同
浓度的 NA 后，PSA 产量从对照（没有添加 NA）的
1.51 g/L 下降到 0.5 g/L 左右，生物量同样出现明显
的下降趋势。NA 的添加使山梨醇的消耗量明显下降，
当添加 NA 的量为 10 mg/L 时，山梨醇消耗量仅为
8.03 g/L，比对照的山梨醇消耗量下降了 64.2%。加
入 NA 后 PSA 产量和生物量的下降可能是由于山梨
醇的消耗量大幅度降低、微生物细胞的分解代谢受
阻所致。
2.3.2 NA 对有机酸合成的影响 微生物细胞中存在
大量辅因子，如 ATP、ADP、AMP、NADH、NAD+、
NADPH、NADP+、乙酰 -CoA 及其衍生物、维生素
和微量元素等，这些辅因子是大量生化反应的基
础。作为辅因子 NAD+/H 参与许多生化反应，胞内
NAD+/H 的改变会影响细胞生长和代谢产物的合成，
ኡỘ䞷 㪑㨴㌆ ᵘ㌆ 㪑㨴㌆䞨䫐0369
12
15
A
M
PǃUMP/µM·g-1 ·cell-1 
AT
PǃADPǃUTP/µM·g-1 ·cell-1 
ATP ADP UTP EC AMP UMP
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
EC
0
20
40
60
80
100
图 6 不同碳源对胞内核苷酸的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9214
甚至导致代谢流发生改变。当向发酵培养基中添加
NA 后，使还原性代谢产物（聚唾液酸、琥珀酸、乳酸）
的产量降低甚至消失，如图 8 所示。当加入的 NA
量为 5 mg/L 时，琥珀酸和乳酸的合成量从对照的
0.14 mmol/L、0.26 mmol/L 分别下降到 0.02 mmol/L、
0.03 mmol/L。当 NA 的添加量高于 5 mg/L 时，菌体
就不再合成琥珀酸和乳酸。与琥珀酸、乳酸不同的
是，当加入 NA 后，即使浓度较高，仍有不需要消
耗 NADH 的乙酸正常合成。乙酸的合成使细胞减少
对 NADH 的利用量，从而导致细胞氧化还原状态的
平衡。添加 NA 后，菌体合成的柠檬酸量稍有降低（数
据未给出）。
NA 后，胞内的 NAD+ 水平提高，如图 9 所示。还原
力（NADH/NAD+）水平相对降低，此时菌体会减少
对 NADH 的利用，从而导致琥珀酸、乳酸的合成量
降低（合成琥珀酸、乳酸所需要的酶是依赖 NADH
的酶），如图 10 所示。
在向发酵培养基中添加 NA 后，菌体合成的乙
酸量降低，而乙酸的生成偶联 ATP 的再生，同时，
发酵培养基中较高浓度的 NA 导致胞内还原力水平
降低后，抑制 NADH 通过 ETC 产生能量，故添加
NA 后菌体细胞内的 ATP 水平有所降低。如图 9 所示，
当加入的 NA 量为 15 mg/L 时，胞内的 ATP 水平仅
为 2.05 μM/g.cell，比对照的低 34.2%。故添加 NA 后，
ATP 的不足导致 PSA 的合成量明显降低，由于用于
PSA 合成的 ATP 量减少，胞内的 EC 水平要高于对
照的 0.22。
0
1
2
3
4⭏⢙䟿ǃPSA䟿g·L-1  ✏䞨mg·L-1
PSA ⭏⢙䟿 ⎸㙇ኡỘ䞷
0 5 10 15 20
0
5
10
15
20
25 ኡỘ䞷⎸㙇䟿g·L-1 
图 7 烟酸对 PSA 发酵的影响
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
✏䞨mg·L-1⩕⧰䞨ǃң䞨mm
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-1
 ⩕⧰䞨 ң䞨 ҉䞨
0 5 10 15 20
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 ҉䞨mmol·L-1 
图 8 烟酸对有机酸合成的影响
2.3.3 NA 对胞内核苷酸的影响 向山梨醇的发酵培
养基中添加不同浓度的 NA，其中以不含 NA 的培养
条件为对照，取对数中期的细胞，测定胞内的 EC、
还原力水平。由于 E. coli 可以 NA 作为合成 NAD+
的前体物质，与对照相比，当向发酵培养基中添加
在向发酵培养基中添加 NA 后，PSA 合成量降低，
故合成 PSA 消耗的 UTP 量降低，菌体细胞内积累的
0
3
6
9
12
15
AT
PǃADPǃNAD+ /µM/g·cell-1 
0 5 10 15 20
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
EC
0
6
12
18
24
30
ATP ADP NAD+ EC AMP
A
M
P/
µM/g·cell-1 ✏䞨⎃ᓖmg·L-1
图 9 烟酸对胞内能荷的影响
0
6
12
18
24
30
N
A
D
+ /µM·g-1 ·cell-1 
10✏䞨⎃ᓖ(mg·L-1)
NAD+
0 5 15 20
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3⩕⧰䞨ң䞨 ⩕⧰䞨ǃң䞨mmol·L-1 
图 10 烟酸对胞内 NAD+ 量、菌体有机酸合成量的影响
2015,31(9) 215闫霞等：大肠杆菌 K235 能量代谢扰动影响聚唾液酸合成的研究
大量的丙酮酸，积累的丙酮酸并未通过无氧或有氧
呼吸的方式释放能量，从而导致以木糖为碳源时，
胞内的 ATP、EC 水平都较低。
微生物会自动调节胞内的 NADH 水平，而对
NADH/NAD+ 的比没有严格的要求［26，27］。向培养基
中添加 NA 后，虽然胞内 NAD+ 总量提高，但 NADH
水平基本维持平衡状态，从而导致胞内还原力水平
下降。由于 PSA 的合成需要在较高的还原环境下进
行，所以向培养基中加入 NA 后，PSA 产量会降低。
Liu 等［20］利用光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸时，当
向发酵培养基中添加 8 mg/L NA 后，胞内的 NAD+
量从未添加 NA 的 13.1 mg/g DCW 提高到 28.6 mg/g
DCW，从而降低了胞内 NADH/NAD+ 水平 ；由于在
丙酮酸合成代谢中需要消耗 NAD+，故导致葡萄糖的
消耗速率和丙酮酸的产量分别增加了 48.4%、29%。
微生物细胞内 NADH/NAD+ 水平的改变会导致
代谢产物组成的变化。Berrios-Rivera 等［28］向 E. coli
内引入来自 Candida boidinii 的 NADH 再生途径，该
途径中的甲酸脱氢酶（Formate dehydrogenase，FDH）
可以将甲酸转化为二氧化碳，并伴随 NADH 的生
成，而存在于 E. coli 内的 FDH 在催化过程中没有
NADH 的生成，故该异源代谢途径的引入可以提高
菌体细胞内的还原水平。在厌氧和好氧条件下，异
源 NADH 再生途径对代谢物的组成都产生显著的影
响，在厌氧条件下主要形成还原代谢产物乙醇，而
在好氧条件下由于胞内 NADH 的增多使菌体在有氧
环境中却转向厌氧代谢，主要表现在乙醇、乳酸、
琥珀酸等厌氧代谢产物的大量合成中。本研究向 E.
coli 的发酵培养基中添加 NA 后，胞内的 NAD+ 水平
明显提高，此时菌体就会降低对 NADH 的利用。由
于琥珀酸合成需要消耗 2 分子的 NADH，乳酸的合
成需要消耗 1 分子的 NADH，菌体为了达到胞内氧
化还原的平衡，减少了向琥珀酸、乳酸的代谢流量，
当 NA 的添加量大于 5 mg/L，菌体甚至停止合成琥
珀酸、乳酸。
4 结论
可以利用装液量、不同氧化还原状态的碳源、
烟酸等来调控菌体细胞内的核苷酸变化。当装液量
为 35 mL 时，PSA 产量达到最高值 1.51 g/L，由于
UTP 量增加，如图 11 所示。当添加 10 mg/L NA 后，
菌体细胞内的 UTP 量高达 3.67 μM/g·cell，高于对
照的 3.38 μM/g·cell。与 UTP 的变化相反，当菌体
由于添加 NA 使合成 PSA 的量降低时，菌体细胞内
积累的 UMP 会降低，从对照的 83.2 μM/g·cell 下降
到 36.6 μM/g·cell。
3 讨论
本研究在利用不同氧化还原状态的碳源发酵生
产 PSA 时，最终 PSA 产量明显不同，其中以山梨
醇为碳源时 PSA 产量最高，这与山梨醇在代谢过
程中产生较多的 NADH 使细胞处于较高的还原状态
有关。Hong 等［23］在利用 E. coli 工程菌生产琥珀酸
时，选用山梨醇和葡萄糖分别作为碳源，结果表明
山梨醇作为碳源提高琥珀酸产量与其提高胞内还原
力（消耗 1 mol 山梨醇可以形成 3 mol NADH，而同
样消耗 1 mol 葡萄糖却只能产生 2 mol NADH）有密
切的关系，因为从 PEP 向琥珀酸的转化中需要 2 分
子 NADH，而在山梨醇的代谢过程中比葡萄糖可形
成更多的 NADH［24］。同样在琥珀酸的生产中，Lin
等［21］在利用山梨醇为碳源时的产量比以葡萄糖为
碳源时的高 81%，而琥珀酸产量的提高是在胞内可
利用的 NADH 量增加时产生，同时胞内 NADH 的
增加也导致乙醇（在生成乙醇时需要消耗 2 分子
NADH）的产量提高了 62%。最近，Liu 等［25］在利
用 E. coli 生产莽草酸时，由于山梨醇较高的还原性
使莽草酸的产量是用葡萄糖为碳源时的 3.7 倍。本
研究中以葡萄糖、葡萄糖酸钠为碳源时胞内较高的
ATP、EC 水平与乙酸的生成有关，因为乙酸的生成
偶联 ATP 的合成 ；以木糖为碳源时，由于菌体生成
0
1
2
3
4
5
U
M
P/
µM·g-1 ·cell-1 
U
TP
/µM·g-1 ·cell-1 
0 5 10 15 20
0
20
40
60
80
100
✏䞨⎃ᓖmg·L-1
UTP UMP
图 11 烟酸对胞内 UTP、UMP 的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9216
合成 PSA 消耗胞内大量的 ATP，导致 EC 水平较低。
较其他碳源而言，山梨醇高的还原性使其成为发酵
生产 PSA 的最有效碳源。胞内 NAD+、NADH 量的
改变会影响 PSA 合成。当胞内 NAD+ 增多会使 PSA
合成量减少，反之胞内 NADH 增多会使 PSA 合成量
增多。
参 考 文 献
［1］ Rodriguez-Aparicio LB, Reglero A, Ortiz AI, et al. Effect of physical
and chemical conditions on the production of colominic acid by
Escherchia coli in a defined medium［J］. Applied Microbiology
and Biotechnology, 1988, 27（5-6）：474-483.
［2］ Barker SA, Jones RG, Somers PJ. Improvements in the production
and isolation of colominic acid［J］. Carbohydrate Research, 1967,
3（3）：369-376.
［3］ Inoue S, Inoue Y. Development profile of neural cell adhesion
molecule glycoforms with a varying degree of polymerization of
polysialic acid chains［J］. The Journal of Biological Chemistry,
2001, 276（34）：31863-31870.
［4］ Nakata D, Troy FA. Degree of polymerization（DP）of polysialic
acid（polySia）on neural cell adhesion molecules（N-CAMS）：
development and application of a new strategy to accurately
determine the DP of polySia chains on N-CAMS［J］. The Journal
of Biological Chemistry, 2005, 280（46）：38305-38316.
［5］ Haile Y, Berski S, Drager G, et al. The effect of modified polysialic
acid based hydrogels on the adhesion and viability of primary
neurons and glial cells［J］. Biomaterials, 2008, 29（12）：1880-
1891.
［6］ Chen C, Constantinou A, Chester KA, et al. Glycoengineering
approach to half-Life extension of recombinant biotherapeutics［J］.
Bioconjugate Chemistry, 2012, 23（8）：1524-1533.
［7］ Camino CC, Maria LJ. High production of polysialic acid by
Escherichia coli K-92 grow in a chemically defined medium regulated
by temperature［J］. Biological Chemistry Hoppe-Seyler, 1990, 371
（11）：1101-1106.
［8］ 郭良栋 , 钱世钧 , 叶军 , 等 . 产多聚唾液酸的菌种筛选及产酸
条件［J］. 微生物学报 , 1998, 38（2）：103-107.
［9］ 贾薇 . 聚唾液酸生产菌的诱变育种及发酵研究［D］. 无锡 ：无
锡轻工大学 , 1999.
［10］Rode B, Endres C, Ran C, et al. Large-scale production and
homogenous purification of long chain polysialic acids from E. coli
K1［J］. Journal of Bacteriology, 2008, 135（2）：202-209.
［11］于军华 . 聚唾液酸生产菌种的选育及其发酵工艺的研究［D］.
无锡 ：无锡轻工大学 , 2000.
［12］张琦 . 聚唾液酸发酵和分离纯化工艺的研究［D］. 无锡 ：江
南大学 , 2009.
［13］Berrios-Rivera SJ, San KY, Bennett GN. The effect of NAPRTase
overexpression on the total levels of NAD, the NADH/NAD（+）
ratio, and the distribution of metabolites in Escherichia coli［J］.
Metabolic Engineering, 2002, 4（3）：238-247.
［14］ Heuser F, Schroer K, Lutz S, et al. Enhancement of the NAD（P）（H）
pool in Escherichia coli for biotransformation［J］. Engineering in
Life Sciences, 2007, 7（4）：343-353.
［15］Geertman JM, van Maris AJ, van Dijken JP, et al. Physiological and
genetic engineering of cytosolic redox metabolism in Saccharomyces
cerevisiae for improved glycerol production［J］. Metabolic
Engineering, 2006, 8（6）：532-542.
［16］Zhang YP, Li Y, Du CY, et al. Inactivation of aldehyde
dehydrogenase ：A key factor for engineering 1, 3-propanediol
production by Klebsiella pneumoniae［J］. Metabolic Engineering,
2006, 8（6）：578-586.
［17］Hou J, Lages NF, Oldiges M, et al. Metabolic impact of redox
cofactor perturbations in Saccharomyces cerevisiae［J］. Metabolic
Engineering, 2009, 11（4-5）：253-261.
［18］Zhang Y, Huang Z, Du C, et al. Introduction of an NADH
regeneration system into Klebsiella oxytoca leads to an enhanced
oxidative and reductive metabolism of glycerol［J］. Metabolic
Engineering, 2009, 11（2）：101-106.
［19］de Graef MR, Alexeeva S, Snoep JL, et al. The steady-state internal
redox state（NADH/NAD+）reflects the external redox state and
is correlated with catabolic adaptation in Escherichia coli［J］.
Journal of Bacteriology, 1999, 181（8）：2351-2357.
［20］Liu LM, Li Y, Shi ZP, et al. Enhancement of pyruvate productivity
in Torulopsis glabrata ：Increase of NAD（+）availability［J］.
Journal of Bacteriology, 2006, 126（2）：173-185.
［21］Lin H, Bennett GN, San KY. Effect of carbon sources differing
in oxidation state and transport route on succinate production
in metabolically engineered Escherichia coli［J］. Journal of
Industrial Microbiology and Biotechnology, 2005, 32（3）：87-93.
［22］Svennerholm L. Quantitative estimation of sialic acids［J］.
2015,31(9) 217闫霞等：大肠杆菌 K235 能量代谢扰动影响聚唾液酸合成的研究
Biochimica et Biophysica Acta, 1957, 24（4）：604-611.
［23］Hong SH, Lee SY. Importance of redox balance on the production
of succinic acid by metabolically engineered Escherichia coli［J］.
Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 58 ：286-290.
［24］San KY, Bennett GN, Berrios-Rivera SJ, et al. Metabolic
engineering through cofactor manipulation and its effects on
metabolic flux redistribution in Escherichia coli［J］. Metabolic
Engineering, 2002, 4 ：182-192.
［25］Liu XL, Lin J, Hu HF, et al. Metabolic engineering of Escherichia
coli to enhance shikimic acid production from sorbitol［J］. World
Journal of Microbiology and Biotechnology, 2014, 30（9）：2543-
2550.
［26］Wimpenn, JWT, Firth A. Levels of nicotinamide adenine
dinucleotide and reduced nicotinamide adenine dinucleotide
in facultative bacteria and the effect of oxygen［J］. Journal of
Bacteriology, 1972, 111（1）：24-32.
［27］Matin A, Gottschal JC. Influence of dilution rate on NAD（P）and
NAD（P）H concentrations and ratios in a Pseudomonas sp. grown
in continuous culture［J］. Journal of General Microbiology, 1976,
94（2）：333-341.
［28］Berrıos-Rivera SJ, Bennett GN, San KY, et al. Metabolic
engineering of Escherichia coli ：increase of NADH availability by
overexpressing an NAD+-dependent formate dehydrogenase［J］.
Metabolic Engineering, 2002, 4（3）：217-229.
（责任编辑 李楠）