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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):102-107
花粉发育是开花植物生命进程中的一个重要组
成部分，早期的研究主要集中在花粉形态学的观察
以及育性的调控，随着现代分子生物学的发展，对
花粉发育相关蛋白的研究逐渐成为热点。目前，花
粉发育的相关基因已在多种植物中成功克隆，如拟
南芥的 MMD1 基因［1］、水稻的 PPS1 基因［2］以及白
菜的 BcMFs 基因家族［3］。前人研究表明，MF2 基因
（Male Fertile 21）是白菜花粉发育的重要基因，可在
四分体时期及小孢子中检测到。其启动子区域含有
7 个典型的顺式调控元件和 3 个花粉特异元件［4］。
收稿日期 ：2014-08-06
基金项目 ：浙江省自然基金项目（LY12C15009），浙江省农业新品种选育重大科技专项（2012C12903-3-3），浙江省重大科技项目（2010C-
12004），温州科技局项目（N20090016）
作者简介 ：裴徐梨，女，博士研究生，研究方向 ：蔬菜遗传育种 ；E-mail ：2012204024@njau.edu.cn
通讯作者 ：荆赞革，男，博士研究生，助理研究员，研究方向 ：蔬菜遗传育种与生物技术 ；E-mail ：jingzange@aliyun.com
青花菜花粉发育基因 MF21 的克隆及表达特征分析
裴徐梨1，2  荆赞革1  唐征1  王岩2  王镇2  陈忠文2  罗天宽1  张小玲1
（1. 温州科技职业学院 浙南作物育种重点实验室，温州 325006 ；2. 南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095）
摘 要 ： 从青花菜自交系‘WN12-95B’中克隆得到花粉发育基因 MF21。序列生物信息学分析表明，该基因全长 468 bp，
编码 151 个氨基酸，相对分子量为 16.70 kD，等电点为 8.56，为疏水性蛋白。青花菜 MF21 蛋白的信号肽长度为 22 个氨基酸残基。
且该蛋白含有两个蛋白激酶 C 磷酸化位点，4 个 N 端豆蔻酰化位点和一个酪氨酸磷酸化位点。不规则卷曲和 β-转角是其二级结构
主要构成成分。分子进化表明，MF21 基因与同属的埃塞俄比亚芥进化关系最近。通过荧光定量 PCR 对青花菜 MF21 基因的时空
表达特性进行分析，结果表明该基因在保持系花蕾中表达较高，具有明显的组织特异性。在 Ogu 不育系及其保持系不同发育阶段
的花蕾中 MF21 相对表达量差异明显。
关键词 ： 青花菜 ；花粉发育 ；MF21 ；基因克隆 ；表达分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.014
Cloning and Expression Analysis of a Pollen Development Gene MF21
in Broccoli
Pei Xuli1，2 Jing Zan’ge1 Tang Zheng1 Wang Yan2 Wang Zhen2 Chen Zhongwen2
Luo Tiankuan1 Zhang Xiaoling1
（1. Zhenan Key Laboratory of Crop Breeding，Wenzhou Vocational College of Science and Technology，Wenzhou 325006 ；2. State Key
Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095）
Abstract: In this study, the MF21 gene were cloned from a broccoli maintenance line ‘WN12-95B’. Bioinformatic analysis showed that
the full length of MF21 gene was 468 bp and encoded 151 amino acid peptides. The relative molecular weight and pI of MF21 was 16.70 kD and
8.56, respectively. Meanwhile, the MF21 protein was speculated as a hydrophobic protein. The MF21 protein include a 22 amino acid length
signal peptide, and also contain two CK2 phosphorylation sites, four N-myristoylaton sites and one tyrosine kinase phosphorylation site. Random
coils and β-strands were main components of the two-dimension structure. Based on the molecular evolution, we found that the MF21 gene had
approximate evolution relationship between broccoli and Brassica carinata. The expression analysis of MF21 gene by qRT-PCR indicated that
this gene was mainly expressed in bud of broccoli and had tissue specificity. The expressive abundance of bud in different development stage had
great differences between the Ogu CMS line and its maintenance line.
Key words: broccoli ；pollen development ；MF21 ；gene clone ；expression analysis
2015,31(3) 103裴徐梨等：青花菜花粉发育基因 MF21的克隆及表达特征分析
迄今白菜 MF 基因研究较为深入，但在青花菜
中的研究处于起步阶段。MF 基因属于一个大的基因
家族，家族成员包括多聚半乳糖醛酸酶 MF6［5］、跨
膜蛋白 MF12［6］、花粉败育蛋白 MF13［7］以及 C2H2
锌指蛋白 MF20［8］等。MF21 是 MF 基因家族中一个
新发现的成员，其基因特征及功能有待进一步研究。
青花菜（Brassica oleracea var. italica）是十字花
科芸薹属一二年生草本植物，以绿色或紫色花球为
食用器官，在我国广泛栽培。青花菜营养丰富，是
深受消费者喜爱的蔬菜之一。本试验从青花菜高
代自交系‘WN12-95B’中克隆得到花粉发育基因
MF21，通过分子生物学方法对其分子结构及序列特
征进行分析，同时利用荧光定量 PCR 技术对 MF21
基因在 Ogu 不育系及其保持系不同发育阶段花蕾中
的表达特性进行分析，旨在为了解青花菜 MF21 基
因在花粉发育中的作用提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 以课题组培育的青花菜 Ogu 不育
系‘WN12-95A’及其保持系‘WN12-95B’ 为试验
材料，种植于温州科技职业学院试验田，于花期取
保持系的根、茎、叶、花蕾和嫩荚。同时取不育系
和保持系不同发育阶段的花蕾（<2 mm，2-4 mm，
>4 mm），用铝箔纸包好后，迅速投入液氮中固定，
-70℃冰箱中保存备用。
1.1.2 菌株和试剂 基因克隆和荧光定量试验过
程 中 使 用 的 RNA 提 取 试 剂 盒、 反 转 录 试 剂 盒 以
及 SYBR Green Ⅰ、dNTP、Taq 酶 等 均 购 于 大 连
TaKaRa 公司；大肠杆菌 DH5α 菌株由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取及 MF21 基因的克隆 青花
菜总 RNA 提取参照 RNA 提取试剂盒操作说明书进
行。反转录 cDNA 使用反转录试剂盒（Prime Script
1st Strand cDNA Synthesis Kit）。根据本实验室转录
组数据库中花粉发育基因 MF21 设计全长引物对 ：
BoMF21-F（5-AGAAAGCCAAAATGGCAGAA-3）
和 BoMF21-R（5-GCTAGTTAGATTGTGGTGTCAT
TG-3）。以保持系花蕾 cDNA 为模板扩增目的片段，
PCR 反 应 体 系 包 括 1 μL cDNA， 上、 下 游 引 物 各
1 μL，10 μL Taq mixture，ddH2O 7 μL。扩增参数为 ：
94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，55℃复性 50 s，
72℃延伸 1 min，32 个循环 ；72℃延伸 10 min。PCR
产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测并回收，回收片段
连接 pMD18-T 载体，转化大肠杆菌，选取阳性克隆
送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.2 青花菜 MF21 基因的生物信息学分析 开放
阅读框的查找使用 ORF FINDER 程序（http ：//www.
ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html）进行。青花菜花粉发育基
因 MF21 与同源物种的检索在 NCBI 的 BLAST 程序
中完成。使用 pI/MW 软件预测蛋白质分子量和等电
点 ；通过 Signal P 预测蛋白信号肽序列及位点。采
用 DNAMAN 分析青花菜 MF21 的疏水性 / 亲水性及
氨基酸的理化性质。系统进化树的构建使用 MEGA
5.0 经多重比对后完成。蛋白质二级结构使用 Predict
Protein 软件（http：//www.predictprotein.org）进行预测。
1.2.3 青花菜 MF21 基因的荧光定量 PCR 分析 通
过 荧 光 定 量 PCR（Relative quantitative real-time RT-
PCR）技术检测花粉发育基因 MF21 在青花菜不同
组织中的表达情况。检测引物为 ：5-CTTGCTGGTC-
TGGATCAT-3 和 5-AGTTAGATTGTGGTGTCATTG
-3，以 actin 基因为内参基因，其引物序列为 ：正向
引 物 5-GACAACTTACAACTCCATCAT-3 和 反 向 引
物 5-CTCATACGGTCAGCGATA-3。QRT-PCR 反 应
在 Bio-Rad IQ5 上完成。
实时定量 PCR 参照大连 TaKaRa 公司的 SYBR
Premix Ex Taq 试剂盒操作说明进行，相对定量计算
方法使用 2-ΔΔCT 法，其中 ΔCT=CT，基因 -CT，actin。
2 结果
2.1 青花菜MF21基因的克隆及序列生物信息学分析
从青花菜保持系花蕾中克隆得到一个 468 bp 左
右的 MF21 基因片段（图 1），该片段包含一个开放
阅读框为 456 bp，5 非翻译区 11 bp，3 非翻译区 1
bp，预测编码 151 个氨基酸（图 2）。使用 pI/MW 软
件预测 MF21 蛋白相对分子量为 16.70 kD，等电点
为 8.56。Signal P 预测表明 MF21 基因存在信号肽的
可能性为 0.814，剪切位点位于第 22 位与第 23 位之
间，信号肽序列为 MAELKWMCLSFSVSLLLSLAVG。
通过 Prosite 数据库对 MF21 蛋白质功能位点进行查
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3104
询，结果得出在 28-30 bp、189-131 bp 含有两个蛋
白激酶 C 磷酸化位点，52-57 bp、55-60 bp、93-98
bp、105-110 bp 含有 4 个 N 端豆蔻酰化位点，120-
123 bp 含有一个酪氨酸磷酸化位点。
因的氨基酸残基数变化范围较小，为 124-131 个 ；
相对分子量差异较小，均为 16.50 kD 左右 ；等电
点、酸性氨基酸比例、碱性氨基酸比例差异较小 ；
芳香族氨基酸数量最高为拟南芥（16 个），其余均
为 12-15 个不等 ；脂肪族氨基酸数量及不溶蛋白的
比例较为固定。
2.3 青花菜MF21基因的氨基酸序列疏水性/亲水
性分析
氨基酸序列亲水性及疏水性的分析对蛋白质高
级结构的预测具有重要作用。通过对 MF21 氨基酸
序列的疏水性 / 亲水性分析，发现该蛋白疏水性氨
基酸比亲水性氨基酸多，推测其为疏水性蛋白，其
中第 18 位丝氨酸（2.76）为疏水性最大位点，其次
为相邻的第 17 位亮氨酸（2.70）；第 64 位甘氨酸和
2000
bp
M 1
1000
500
750
100
200
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：WN12-95B
图 1 RT-PCR 克隆青花菜 MF21 基因
2.2 青花菜与其他物种MF21基因的氨基酸序列同
源性分析
通过 GenBank 的氨基酸序列同源检索，发现 19
种物种的 MF21 基因的氨基酸序列与青花菜具有相
似性，经序列多重比对，MF21 蛋白与埃塞俄比亚芥、
紫菜苔、大叶芥、小白菜、甘蓝型油菜、卷心菜、黑芥、
荠菜、玉山筷子芥、拟南芥等 10 种植物具有较高同
源性，其中相似性最高的物种为埃塞俄比亚芥，相
似度达到 100%。同时 MF21 与刚果锥虫、放线菌以
及野草莓等具有较低的同源性，保守结构域预测表
明无保守结构域与青花菜 MF21 蛋白相匹配（图 3）。
通过对上述 11 种植物的 MF21 基因的氨基酸组
成特性的分析，结果显示，11 种植物中的 MF21基
1 $*$$$*&&$$$$7**&$*$$&7&$$$7**$7*7*7&777&&77&7&$*7$7&7&7777*&7*$*&77$*&$*77*0$(/.:0&/6)696///6/$9
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451 &$&&$&$$7&7$$&7$*&73461
* 表示终止密码子 ；下划线代表引物序列
图 2 青花菜 MF21 基因的 cDNA 序列及编码的氨基酸序列
第 73 位丝氨酸为亲水性最大位点，最大值均为 1.50，
其次为第 74 位精氨酸和第 75 位天冬氨酸。
2.4 青花菜MF21蛋白的高级结构预测及分析
蛋白质的二级结构主要由其一级结构折叠而成，
包括 α-螺旋和 β 型结构两种类型，二级结构的构建
对于了解蛋白质的生物功能有重要作用。本试验克
隆得到的青花菜 MF21 蛋白的二级结构含有 α-螺旋
（14%）、不规则卷曲（33%）、延伸链（9%）和 β-转
角（43%），其中不规则卷曲和 β-转角是其二级结构
的主要构成成分。
2.5 青花菜MF21基因分子进化分析
通过 MEGA 5.0 对青花菜和上述 10 种植物的氨
基酸序列进行多重比对并构建系统进化树，结果（图
4）显示，11 个物种的 MF21 蛋白可分为两个大的分
2015,31(3) 105裴徐梨等：青花菜花粉发育基因 MF21的克隆及表达特征分析
支，一支包括拟南芥属植物，另一支包括芸薹属和
荠菜属植物，其中青花菜 MF21 与同属的埃塞俄比
亚芥进化关系最近，位于进化树的同一个亚组 ；其
次与甘蓝和油菜进化关系较近，同植物学的分类较
相符。
蕾（<2 mm）中，保持系 MF21 表达量是不育系的
20 倍，不育系 2-3 级花蕾中未检测到该基因的表达
（图 5-B）。
3 讨论
花粉由花粉母细胞分化而来，其发育机理十分
复杂，涉及的基因以及蛋白也种类繁多。对花粉发
育的研究，不仅为了解植物的生殖规律及分子机理
奠定基础，同时还可以促进杂种优势育种。本试验
使用 RT-PCR 技术成功在青花菜中克隆得到花粉发
育基因 MF21，功能位点分析显示，该基因编码的
蛋白含有蛋白激酶 C 磷酸化位点、N 端豆蔻酰化位
点以及酪氨酸磷酸化位点。蛋白激酶 C 基因是信号
转导过程中突触形成的调控因子［9］，N 端豆蔻酰化
参与了信号转导过程中蛋白质的运输以及 Ca2+ 的调
控［10］，同时酪氨酸磷酸化也参与了信号传递［11］。
由此推测青花菜的 MF21 蛋白在花粉发育过程中以
信号转导的方式发挥重要作用。
氨基酸序列同源性分析得出，12 种物种之间
氨基酸序列、等电点、酸性氨基酸比例、碱氨基酸
比例差异很小，表明该基因编码的蛋白在种属间高
度保守，青花菜与同属植物的蛋白同源性达 66%-
100%，而且同源植物集中在十字花科植物。氨基酸
序列分析发现 MF21 蛋白的疏水性氨基酸比亲水性
Arabidopsis thaliana
Brassica oleracea var. italica
Brassica carinata
Brassica rapa var. purpuraria
Brassica juncea var. rugosa
Brassica rapa subsp. chinensis
Brassica napus
Brassica oleracea var. capitata
Brassica nigra
Eutrema salsugineum
Arabidopsis lyrata subsp. lyrata
Arabidopsis thaliana
Brassica oleracea var. italica
Brassica carinata
Brassica rapa var. purpuraria
Brassica juncea var. rugosa
Brassica rapa subsp. chinensis
Brassica napus
Brassica oleracea var. capitata
Brassica nigra
Eutrema salsugineum
Arabidopsis lyrata subsp. lyrata
图 3 青花菜 MF21 基因氨基酸序列与不同物种的多重比对结果
Arabidopsis_thaliana
Arabidopsis_lyrata_subsp._lyrata
Eutrema_salsugineum
Brassica_nigra
Brassica_rapa_subsp._chinensis
Brassica_rapa_var._purpuraria
Brassica_juncea_var._rugosa
Brassica_napus
Brassica_oleracea_var._capitata
Brassica_oleracea_var._italica
Brassica_carinata
图 4 青花菜及 11 个物种的 MF21 基因氨基酸序列系统发
生树分析
2.6 青花菜MF21基因的时空表达特征分析
采用 qRT-PCR 技术对 MF21 基因的时空表达特
性进行分析，结果（图 5-A）表明在保持系中 MF21
基因只在花蕾中表达，根、茎、叶和嫩荚中均未检
测到表达。保持系 1、2 级花蕾中的表达量较 3 级花
蕾表达量显著上调。Ogu 不育系及其保持系不同发
育阶段花蕾中 MF21 基因表达差异较大，在 1 级花
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3106
氨基酸多，为疏水性蛋白，推测可能与花粉发育过
程中壁层形成中的脂类代谢相关［12］。
芸薹属“禹氏三角”理论指出，芸薹属植物都
是由白菜（AA）、黑芥（BB）和甘蓝（CC）分化而来，
这 3 种植物经过两两杂交之后演化形成甘蓝型油菜
（AACC）、芥菜（AABB）和埃塞俄比亚芥（BBCC）［13］。
系统进化树分析表明，青花菜首先与埃塞俄比亚芥
聚类，青花菜属于 CC 基因组，埃塞俄比亚芥属于
BBCC 基因组 ；同时属于 AA 基因组的小白菜、紫菜
苔和 AABB 基因组的大叶芥位于同一个亚组，聚类
结果与“禹氏三角”理论相符。Udall 等［14］研究发现，
AA 基因组与 CC 基因组进化关系较近，BB 基因组
则较远，本试验中青花菜的 MF21 蛋白在进化上具
有高度的保守性，进化方向与其他芸薹属植物保持
一致，进化关系与 BB 基因组的黑芥较远。
花粉发育基因按照作用时间的不同可分为早
期基因和晚期基因，早期基因主要在减数分裂时期
到花粉成熟期间发挥作用，而晚期基因多表达于成
熟花粉中［15］。试验通过 qRT-PCR 技术对青花菜保
持系中 MF21基因的表达特性进行分析，仅在花蕾
中检测到表达，根、茎、叶中均未检测到。在 Ogu
不育系及其保持系的 1-3 级的花蕾中，1 级花蕾中
MF21 的表达量均最高，表明花粉发育基因 MF21 是
在花粉中特异表达的早期基因，参与花粉细胞分化
和花粉成熟。本研究克隆了青花菜 MF21 基因，并
对其进行生物信息学和时空表达特性分析，为今后
进一步深入研究 MF21 基因在青花菜花粉发育过程
中的作用奠定基础，同时为进一步利用转基因等现
代生物技术手段创建具有自主知识产权的新型青花
菜雄性不育系提供候选基因资源。
4 结论
本研究从青花菜高代自交系中克隆得到花粉发
育基因 MF21，并对其序列进行生物信息学分析。分
子进化揭示了 MF21 基因与甘蓝和油菜进化关系较
近。qRT-PCR 结果表明 MF21 基因在保持系花蕾中
表达较高，在 Ogu 不育系及其保持系不同发育阶段
的花蕾中表达差异明显。
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0.0 0.0 0.0
1.0
0.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8⴨ሩ㺘䗮䟿⴨ሩ㺘䗮䟿
1.0
1.2
A
B
ṩ 㤾 ਦ 㣡㮮 ᄙ㦊
2.0
1.5
0.10.1 0.0 0.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
A1 B1 A2 B2 A3 B3
A ：MF21 在保持系不同组织部位表达情况 ；B ：Ogu 不育系和保持系不同发
育阶段花蕾中 MF21 基因表达，其中 A1-A3、B1-B3 为保持系和 Ogu 不育
系不同长度花蕾。A1，B1 ：<2 mm ；A2，B2 ：2-4 mm ；A3，B3 ：> 4 mm
图 5 青花菜 MF21 基因的表达特性
2015,31(3) 107裴徐梨等：青花菜花粉发育基因 MF21的克隆及表达特征分析
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（责任编辑 马鑫）