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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2012-02-17
基金项目 : 国家重点基础研究发展计划“973”项目（2009CB118802）
作者简介 : 安俊峰 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 分子细胞生物学 ; E-mail: junfengan@hotmail.com
通讯作者 : 侯鑫 , 男 , 副教授 , 研究方向 : 分子细胞生物学 ; E-mail: bihouxin@imu.edu.cn
鸡细胞色素 P450 1A5的原核表达与活性重组
安俊峰 王运浩 侯鑫
（内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021）
摘 要： 旨在对鸡细胞色素 P450 1A5（CYP1A5）蛋白进行体外功能研究，采用大肠杆菌系统进行 CYP1A5的异源表达。以
鸡的 cDNA为模板，扩增出 CYP1A5 基因，将该基因的 N端编码区进行修饰，并连接到 pCW载体中构建 His-CYP1A5，经 IPTG
诱导在大肠杆菌中表达。经 CO-差示光谱检测，所获得的 His-CYP1A5具有典型的 P450吸收峰。 该蛋白与细胞色素 P450还原酶
（CPR）进行体外重组，构成的重组酶系表现出乙氧基试卤灵-O-脱乙基酶活性。结果表明，所采用的表达策略可以成功产生出具有
催化活性的鸡细胞色素 P450 1A5（CYP1A5）蛋白。
关键词： 细胞色素 P450 1A5（CYP1A5） 异源表达 体外重组 酶活性
Functional Expression of Chicken Cytochrome P450 1A5 in
Escherichia coli
An Junfeng Wang Yunhao Hou Xin
（College of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot 010021）
Abstract: To survey the in vitro activities of chicken cytochrome P450 1A5 （CYP1A5）, genetically engineered Escherichia coli was
used in the present study for recombinant expression of target protein. Chicken cDNA was used as template to amplify CYP1A5 gene which was
then connected to pCW vector （EcoR I/Sal I） and induced by IPTG in E. coli. Through the detection of CO-difference spectra, the expression
of CYP1A5 had the typical P450 absorption peak. The expressed protein reconstituted with cytochrome P450 reductase （CPR） showed
7-ethoxyresorufin O-deethylase activity. The results suggested that the expressions used in this study can successfully produce the catalytic
activity of the chicken cytochrome P450 1A5 （CYP1A5） protein.
Key words: Cytochrome P450 1A5 （CYP1A5） Heterologous expression Reconstitution in vitro Enzymatic activity
细胞色素 P450（cytochrome P450，cytochrome C-
YPs，简称 P450）是一类以血红素为辅基的 B 族细
胞色素超家族蛋白酶［1］。因还原型 P450 与一氧化
碳复合物在 450 nm 处有一吸收峰，故命名为 P450。
细胞色素 P450 是一族在温和条件下能够把许多惰
性化合物氧化的单加氧酶，负责内源性和外源性底
物的代谢，包括甾类激素、胆汁酸、药物、胆固醇、
脂肪酸、毒素、前致癌剂的合成或降解［2］ 。细胞色
素 P450 在原核生物中游离于胞质中，为一种可溶性
蛋白 ；在真核生物中作为一种膜结合蛋白，主要分
布在内质网、微粒体和线粒体内膜上［3］。
人们关注细胞色素 P450 在药物的生物利用、药
物间相互作用，以及在致癌代谢物形成中的作用的
研究主要集中在人［4, 5］和一些试验室动物中［6］，有
关鸡的细胞色素 P450 对药物等外源性化合物的代谢
作用的研究很有限。鸡基因组测序结果显示，鸡体
内存在许多细胞色素 P450，但是这些基因的功能大
多未被鉴定，在鸡体内所发挥的作用及作用机制还
不清楚，其亚型与药物的代谢相关性还不确定。鸡
作为重要的食品动物，对其在外源性化合物（如药物、
饲料中的有毒污染物）代谢中起重要作用的细胞色
素 P450（CYP1A5）的功能的研究，对于提高鸡产
2012年第6期 95安俊峰等 ：鸡细胞色素 P4501A5 的原核表达与活性重组
品的产量和食用安全性都有重要意义。
微粒体细胞色素 P450 家族中的 1A 家族在异生
物质的解毒，以及前致癌物质的活性中起支配性角
色，现有的研究表明，CYP1 家族中的 CYP1A5 能代
谢活化多种外源化合物［7］。鸡 CYP1A5 位于鸡的第
10 号染色体上［8］，mRNA 长度为 1 845 bp，分布在
鸡的肾脏、肝脏及肠上皮中，但以肝脏中居多。鸡
CYP1A5 与人的 CYP1A2 以及火鸡的 CYP1A5 是同
源物［7, 9］，尽管人的 CYP1A2 以及火鸡的 CYP1A5
的生物化学特征及其在药物代谢中的作用都有所开
展，但尚无有关鸡 CYP1A5 功能的报道。本研究的
目的就是重组表达鸡细胞色素 P450（CYP）1A5 蛋
白，为 CYP1A5 代谢活性的进一步研究提供酶源。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
pGM-T 试剂盒购自天根生化科技（北京）有限
公司，克隆菌株大肠杆菌 DH5α、表达菌株大肠杆菌
Transetta（DE3）、核酸 Marker V、蛋白预染 Marker、
T4 DNA 连接酶、质粒抽提和 DNA 纯化及回收试剂
盒、IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）均购自
北京全式金生物技术有限公司，LA Taq酶（原始序
列克隆）、 PrimerStar HS DNA 聚合酶（修饰后的序列
克隆）、限制性内切酶 Sal I 及 EcoR I 均购自宝生物
工程（大连）有限公司，DTT （二硫苏糖醇），PMSF
（苯甲基磺酰氟）、δ-ALA（盐酸 5 氨基乙酰丙酸）均
购自 Merck 公司，鸡肝 cDNA 由本实验室保存，表
达载体 PCW 由英国邓迪大学（University of Dundee，
Scotland）Thomas Friedberg 教授惠赠。
1.2 方法
1.2.1 鸡 CYP1A5 基因的克隆 根据鸡 CYP1A5 基
因序列（GenBank accession NO. X99454），设计两
条 PCR 引物（Forward1，Reverse1 见表 1），以鸡肝
cDNA 为模板［7］进行 PCR 反应，反应程序为 : 94℃
预变性 2 min ；然后 94℃变性 50 s，49℃退火 30 s，
72℃延伸 90 s，30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min，
反应结束后 4℃保存。将 PCR 产物 1% 凝胶电泳分
离后，回收 CYP1A5 片段，与 pGM-T 载体连接，转
化入 E. coli DH5α 感受态细胞中，进行菌液 PCR（复
苏后的菌液上清为模板）筛选阳性转化子。将阳性
克隆送北京华大公司进行 DNA 测序，保存序列正确
的质粒，用于以下表达质粒的构建。
1.2.2 His-CYP1A5 重组质粒的构建 参考文献［10］，
对鸡 CYP1A5 序列进行修饰，通过设计两条 PCR
引物（表 1），将原始序列 N端第 3-31 位氨基酸删
除，第 2、32、33、34、35、36、37 位氨基酸的密
码子 GGG CTG CTG CTG ACC CAG ACC 进行同义突
变为 GCT TTA TTA TTA ACT CAA ACT。上游引物
Forward2，在 5端引入 EcoR I 酶切位点（下划线处），
下游引物 Reverse2，在 5端引入 Sal I 酶切位点（下
划线处）和 6×His-tag（粗字体显示）。以构建好的
pGM-CYP1A5 质粒为模板，反应程序为 ：94℃预变
性 2 min ；98℃变性 10 s，55℃退火 30 s，72℃延伸
90 s，30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min，反应结束
后放入 4℃保存。取 8 μL 反应液进行电泳分析，检
测是否扩增出约 1.5 kb 的目的片段。将预期的 PCR
产物胶纯化回收。纯化后的 PCR 产物（CYP1A5）
与 pCW 载体分别进行双酶切（用 EcoR I 和 Sal I），
酶切产物分别进行回收、连接，转化入 E. coli DH5α
感受态细胞中，挑取转化子进行验证后，将预期的
重组质粒进行 DNA 测序，以确认序列的正确性。将
测序得到的正确的质粒重新转化入 E. coli（Rossetta）
菌株中，用于蛋白的表达。
表 1 CYP1A5的引物
引物名称 引物序列（5-3）
Forward 1 ATGGGGCCGGAGGAAGTGAT
Reverse 1 TTAGTTTGAGCTCTTCATGGAG
Forward 2 CGGAATTCATGGCTTTATTATTAACTCAAACTCGCCGGC
AGCACGCACCCAA
Reverse 2 CGGTCGACTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTTTGAGC
TCTTCATGGA
1.2.3 鸡 CYP1A5 蛋白的异源表达 在 LB 培养基
中复苏含 His-CYP1A5 质粒的菌液，过夜培养。之
后将培养物按 1 100 的比例加入 TB 培养基中，
30℃，200 r/min 条件下培养。 当培养物的 OD600 达
到 0.7-0.8 时，加入 ALA（终浓度 0.5 mmol/L）和
IPTG（ 终 浓 度 1 mmol/L），28℃，170 r/min 诱 导
36 h，收集菌体。在冰上聚冷 15 min 后 5 157 r/min，
4℃， 离 心 20 min， 用 溶 液 I（100 mmol/L Tris-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期96
acetate，500 mmol/L 蔗糖和 0.5 mmol/L EDTA）来重
悬细胞（100 mL 菌体用 10 mL 溶液一重悬），然后
加入溶菌酶到终浓度 0.25 mg/mL，加入 EDTA 至终
浓度 2.5 nmol/L，4℃，140 r/min 摇 40 min，后 4℃，
6 891 r/min，离心 20 min。 用溶液 II（0.1 mol/L 磷
酸钾缓冲液，pH7.6，含 6 mmol/L 乙酸镁，20%（V/V）
甘油 ）重悬沉淀（100 mL 菌体中加入 5 mL 溶液
II），再加入 PMSF（终浓度 1 mmol/L），DTT（终浓
度 0.5 mmol/L），超声破碎（功率 25%，开 5 s，关
10 s，超声 2 min）。破碎后在 11 600 r/min，4℃，离
心 20 min，取总上清进行光谱活性测定。将总上清
进行 57 700 r/min 超速离心，4℃，1 h，离心后的膜
成分用溶液Ⅲ（0.25 mol/L 蔗糖）溶解，对超速离心
后的上清和沉淀进行光谱活性测定。
1.2.4 蛋白含量测定 Bradford 法［11］测定蛋白含量。
1.2.5 SDS-PAGE 将样品和上样缓冲液在 100℃煮
沸 10 min，1 300 r/min 离心 10 min，上样 20 μg 蛋白。
进行电泳，分离胶浓度为 10%。
1.2.6 CYP1A5 含量测定 将 200 μL 样品加入 2 mL
的溶液Ⅳ（200 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，含 20 mmol/L
CHAPS，40%（V/V）甘油，2 mmol/L EDTA）中，加
入少许连二亚硫酸钠，颠倒混匀，4℃，静置 6 min
等分到两个比色皿中，在 400-500 nm 处进行基线
校正，在通风橱内，将 CO 轻轻导入到样品比色
皿（1 个气泡 /s），持续 1 min。 波长 400-500 nm 扫
描，测定在 450 nm 吸收峰大小（用 490 nm 处吸光
度作为参照），记录在 450 nm 和 490 nm 的光吸收
值之差，用下述消光系数进行 P450 的定量 ：ecytP450=
0.091 μmol/L-1cm-1。
1.2.7 细胞色素 P450 还原酶的表达 参考文献［12］
的方法进行。
1.2.8 鸡细胞色素 P450 1A5 酶系重组及其乙氧基试
卤灵 O- 脱乙基活性测定 参考文献［13，14］，在 1
mL 体系中加入 7-乙氧基试卤灵（0.25 μmol/L），25
pmol 的 P450 1A5，125 pmol 的 CPR。用分析 buffer
补齐至 975 μL。放置在 37℃循环水浴的荧光分光光
度计中，设置激发波长 530 nm，发射波长 582 nm。
加入25 μL 10 mmol/L的NADPH（终浓度0.25 mmol/L）
到比色皿中，混匀以起始反应。记录 10 min 内的酶
学反应，计算反应速率。以试卤灵（Resorufin）标
准曲线定量反应产物试卤灵的生成量。
2 结果
2.1 鸡CYP1A5基因的克隆
以鸡肝 cDNA 为模板，经 PCR 获得了约 1.5 kb
长度的目的条带（图 1），得到预期大小的产物。将
目的片段电泳后回收连接，转化入大肠杆菌 E. coli
DH5α 感受态细胞。从平板中挑取白色菌落进行菌
落 PCR 鉴定，将阳性克隆测序，测序结果显示 PCR
产物为 CYP1A5 基因。
M. DNA Marker ；1. CYP1A5 PCR 产物
图 1 CYP1A5 PCR产物电泳图
2.2 His-CYP1A5重组质粒的构建
取测序正确的 pGM-CYP1A5 质粒为模板，通过
设计特定引物，对 CYP1A5 的 N 端序列进行修饰，
同时引入酶切位点。将得到的目的片段（图 2）电
泳后回收，将回收产物和 pCW 载体进行 EcoR I 和
Sal I 双酶切，酶切后的目的条带和载体进行连接，
DNA 测序结果表明基因序列为预期序列，说明 His-
CYP1A5 重组质粒构建成功。
M. DNA Marker ；1. 修饰后 CYP1A5 PCR 产物
图 2 经修饰后的 CYP1A5 PCR电泳图
2.3 鸡CYP1A5蛋白的原核表达
用大肠杆菌表达系统对鸡 CYP1A5 进行异源
表达，并且通过 CO 差示光谱法进行检测（图 3）。
2012年第6期 97安俊峰等 ：鸡细胞色素 P4501A5 的原核表达与活性重组
11 600 r/min 离心上清液在 450 nm 处出现 P450 的特
征吸收峰，表明有活性形式的 P450 表达，P450 含量
是 0.136 1±0.037 8 nmol/mg。将 11 600 r/min 离心后
的上清液进行 57 700 r/min 超速离心，并分别对离心
上清液和沉淀重悬液（即膜成分）进行光谱检测，在
450 nm处出现吸收峰。CYP1A5 的含量分别为0.127 2
±0.039 3 nmol/mg 和 0.189 9±0.045 3 nmol/mg。
检测结果表明，用本研究所述方法，CYP1A5 的表
达并不完全定位在膜上。PCW 空载体（阴性对照）
的 57 700 r/min 超速离心沉淀重悬液的光谱检测结果
（图 3）显示，在 450 nm 处没有出现吸收峰，表明
无细胞色素 P450 的表达。
重叠性，因此要分析不同型细胞色素 P450 的功能需
要获得单一的细胞色素P450蛋白。以往的研究表明，
通过蛋白纯化的方法来实现以上目标在技术上非常
困难，通过重组表达的方式获得 P450 蛋白成为现在
的主要手段［4, 6, 10, 15］。细胞色素 P450 的重组表达的
系统很多，有真核的哺乳动物细胞系、昆虫细胞系
和酵母，也有原核的大肠杆菌。在所有表达系统中，
大肠杆菌系统在外源蛋白质表达方面表现出很多优
越性，该系统对技术要求较低、操作简便、成本低
廉、表达水平高、易于吸收血红素、没有背景 P450
干扰等优点，而且可供选择的载体与表达菌株很多，
并可轻易对序列进行加工修饰［16-18］。在大肠杆菌中
表达 P450 显现优势的同时，也表现出不足，如与绝
大多数真核生物不同的密码子偏好以及对转录调控
区域和目的基因 5-末端碱基的特殊要求（如 A+T 含
量较高，避免形成二级结构）。所以，直接对真核生
物P450的天然cDNA序列进行表达的蛋白含量很低，
很难取得成功［15］。
4 结论
本研究应用了大肠杆菌原核表达系统，通过采
1. 11 600 r/min 离心上清；2. 57 700 r/min 离心后膜成分；
3. 57 700 r/min 离心上清 ；4. 阴性对照
图 3 细胞色素 P450 1A5（CYP1A5）CO差示光谱图
M. 蛋白质分子量标准 ；1. 样品 11 600 r/min 离心上清 ；2. 阴性对照
11 600 r/min 离心上清 ；3. 样品 57 700 r/min 离心后膜成分 ；4. 阴性对
照 57 700 r/min 离心后膜成分
图 4 经 IPTG诱导后表达的蛋白在不同离心力下的
SDS-PAGE图
图 5 CYP1A5的 EROD活性
SDS-PAGE 电泳检测（图 4），在 1A5 蛋白预期
大小（56 kD，图中箭头所示）的位置看到蛋白条带，
也表明细胞色素 P450 1A5 得到表达。
2.4 鸡CYP1A5体外重组酶系对乙氧基试卤灵代谢
活性测定
将在大肠杆菌中表达的 CYP1A5（本研究）与
鸡 CPR［7］ 重组酶系，测定了其探针底物乙氧基试
卤灵的活性（图 5）。从图 5 可知，CYP1A5 与 CPR
重组体系表现出 EROD 活性。经过多次测定得到
的 CYP1A5 的 EROD 活性是 0.01±0.00 pmol/min/mg
protein。PCW 空载体为对照没有检测到活性。
3 讨论
细胞色素 P450 在物质代谢中起着十分重要的
作用。不同生物体往往存在多种不同的细胞色素
P450，不同细胞色素 P450 之间存在底物的特异性和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期98
用经典的 17a 策略对原始 CYP1A5 序列进行了修饰，
成功表达了具有代谢活性的鸡 CYP1A5 蛋白，并将
其与 CPR 进行了体外重组。在大肠杆菌中表达的
CYP1A5，在 450 nm 附近有吸收峰，表明它以活性的
形式表达。进一步的代谢活性结果显示，CYP1A5 与
鸡细胞色素 P450 还原酶的重组酶系具有对探针底物
乙氧基试卤灵的催化活性。本研究所采用的表达方
法可以成功产生出具有催化活性的鸡 CYP1A5 蛋白。
致谢：试验工作在中国科学院动物研究所经济生态学
与昆虫毒理学研究组完成，邱星辉研究员指导研究、提供
科研条件并指导论文写作，特此致谢。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）