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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-11-11
作者简介 : 陈俊 , 女 , 博士研究生 , 讲师 , 研究方向 : 微生物和病毒生物化学与分子生物学 ; E-mail: celljun@163.com
通讯作者 : 杨之帆 , 男 , 博士 , 研究方向 : 生物化学与分子生物学 ; E-mail: sailyangzhf@yahoo.com.cn
一株絮凝菌的鉴定、絮凝基因定位及其絮凝剂成分分析
陈俊1 詹志钢1 陈哲1 王涛1 杨之帆2
（1 武汉科技大学化学工程与技术学院，武汉 430081 ；2 湖北大学生命科学学院，武汉 430062）
摘 要： 从武汉市综合废水处理的活性污泥中筛选得到一株絮凝剂产生菌株 MBF03，其絮凝率达到 90%以上，絮凝效果稳定。
通过 16S rDNA鉴定，该菌为泛菌属，扫描电镜结果显示为杆状。通过质粒转化与质粒消除试验，初步证实了 MBF03菌的絮凝基因
位于染色体上。提取该菌所产的絮凝剂，进行紫外、红外分析，结果表明，该絮凝剂主要成分是胞外多糖类物质，不含蛋白质和核酸。
关键词： 絮凝菌 16S rDNA鉴定 絮凝基因 絮凝剂
Identification, Flocculation Gene Mapping and Flocculant
Composition of a Flocculation Bacteria
Chen Jun1 Zhan Zhigang1 Chen Zhe1 Wang Tao1 Yang Zhifan2
（1College of Chemical Engineering and Technology, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081；
2College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062）
Abstract: One flocculant-producing strain named MBF03 was isolated from the activated sludge of Wuhan integrated wastewater
treatment factory, of which flocculation rate reached 90%. Sequencing of the 16S rDNA gene revealed identification as Pantoea sp.. Scanning
electron microscopy showed that MBF03 was rod-shape. With plasmid transformation and plasmid elimination experiments, we primary confirmed
that the flocculation gene of MBF03 bacteria was located on chromosome DNA rather than a plasmid. Subsequent ultraviolet and infrared
analysis on MBF03 flocculants revealed the main component of the extracellular flocculants was polysaccharide rather than protein and/or
nucleic acid.
Key words: Flocculation bacteria 16S rDNA identification Flocculation gene Flocculant
微生物絮凝剂（MBF）是一类由微生物或其分
泌物产生的代谢产物，可使液体中不易降解的固体
悬浮颗粒凝聚、沉淀，其分子量一般高于 100 000，
包括糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和 DNA 等［1］。
传统的无机絮凝剂铝盐和有机絮凝剂聚丙烯酰氨，
具有诱发老年痴呆及强致癌风险。MBF 因其具有絮
凝活性高、安全无毒、无二次污染等特点，备受中
外学术界和环保行业的关注 ［2-5］。我国对于微生物絮
凝剂的研究起步较晚，从 20 世纪 90 年代起，国内
才逐步开展有关 MBF 的相关研究，迄今为止，该研
究还主要停留在实验室研究阶段，尚未见大规模的
工业应用［4］。研究工作也多集中在絮凝菌高效菌种
的选育及废水处理应用方面，对于絮凝菌的絮凝机
制方面的研究相对较少。本研究对筛选到的一株具
有高絮凝活性的絮凝菌进行了菌株鉴定，扫描电镜
观察，絮凝功能的基因定位，絮凝剂成分分析等相
关研究，旨在为后续构建高活性基因工程菌和应用
于废水处理生产实践奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
絮凝菌 MBF03 由本试验选育，大肠杆菌 E. coli
DH5α 由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 絮凝率的测定
1.2.1.1 高岭土法 具体测定方法参照文献［6］。
2012年第4期 123陈俊等 ：一株絮凝菌的鉴定、絮凝基因定位及其絮凝剂成分分析
1.2.1.2 铝土矿粉法 用 200 目的铝土矿粉代替高
岭土法中的高岭土，其他步骤同 1.2.1.1。
1.2.2 基因组 DNA 的提取 采用 CTAB 方法，具体
方法参照文献［7］。
1.2.3 16S rDNA 的扩增［8］ 正向引物：27F：5-AG-
AGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 反 向 引 物 ：1492R ：
5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，扩增程序 ：94℃
预变性 5 min ；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，
30 个循环 ；72℃延伸 10 min。
1.2.4 絮凝剂的分离与纯化［9］
（1）将 MBF03 接种至发酵培养基中，30℃，
220 r/min，培养 48 h。
（2）发酵液于 4℃，8 000 r/min 离心，取上清，
加入3倍体积预冷的无水乙醇，混匀后4℃静置过夜。
然后 4℃，8 000 r/min 离心 10 min，去上清，沉淀于
真空冷冻干燥。
（3）用适量无菌水溶解沉淀，于 4℃用透析带
透析 24 h。
（4）透析液中加 3 倍体积预冷的无水乙醇，沉
淀絮凝剂，并用无水乙醇洗涤两次，冷冻真空干燥。
1.2.5 絮凝基因定位
1.2.5.1 MBF03 菌质粒提取［10］
（1）挑取单菌落于发酵培养基中，30℃震荡培
养至对数晚期，取 3 mL 培养液于 12 000 r/min 离心
30 s，收集菌体。
（2）弃尽上清，菌体沉淀用 100 μL 冰预冷的
溶液Ⅰ重悬，再加入 200 μL 新鲜配制的溶液Ⅱ，快
速轻柔颠倒离心管数次，冰上静置 2 min，再加入
150 μL 预冷的溶液Ⅲ，快速轻柔颠倒数次，冰上静
置 3-5 min 后，12 000 r/min 离心 10 min。
（3）将上清转移至另一离心管中，加入等体积
的酚、氯仿抽提 1-3 次，12 000 r/min，离心 5 min，
将上清液转移至另一个离心管中，加 2 倍体积的无
水乙醇，室温放置 10 min 沉淀质粒 DNA，12 000 r/min
离心 5 min，收集沉淀的质粒 DNA。
（4）用 70% 乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min 离心 5
min，沉淀用 50 μL 含有 RNase A 的 TE 缓冲液溶解
质粒 DNA，于 -20℃保存备用。
1.2.5.2 转化子质粒提取同 1.2.5.1。
1.2.5.3 抗性测定 选取常用的 2 种抗生素（氨苄
青霉素和卡那霉素），测定 MBF03 以及所含质粒的
抗性。分别向 LB 培养基中加入 20、40、60、80 和
100 mg/L 抗生素，制成不同抗生素、不同浓度的培
养基平板，将絮凝菌及转化质粒后的大肠杆菌涂布
其上，观察生长情况，确定抗性的有无及最大耐受
浓度。
1.2.5.4 质粒转化及转化子絮凝率的测定［10］ 按照
常规转化方法将絮凝菌 MBF03 的质粒转化到大肠
杆菌 DH5α 中，涂布氨苄青霉素平板，获得转化子。
分别测定转化子和大肠杆菌（阴性对照）的絮凝率。
1.2.5.5 质粒消除［11］ 将 MBF03 菌液接种于不同浓
度 SDS 的培养基中，42℃，180 r/min，培养 24 h ；
再将培养物置于 30℃，180 r/min，培养 24 h ；重复
3 次。然后将取培养液涂布氨苄青霉素平板（浓度
为 50 mg/L），30℃恒温培养 3 d 后，观察菌落生长
情况，并测定消除质粒后的絮凝菌的絮凝率。
1.2.6 絮凝剂的成份鉴定
1.2.6.1 紫外光谱分析 将 0.5 g/L 的絮凝剂溶液在
分光光度计下进行特征吸收光谱的紫外吸收扫描分
析，扫描波长范围 ：200-400 nm，扫描间隔 ：1 nm。
1.2.6.2 红外光谱分析 采用溴化钾压片法（1%），
对提取的絮凝物质进行红外光谱扫描分析。准确称
取 0.01 g 干燥的絮凝剂和 0.99 g 溴化钾，在研体中
充分研磨混匀，用付立叶红外光谱仪对样品进行扫
描分析，根据吸收光谱分析絮凝物质中的特征基团。
2 结果
2.1 菌株的鉴定与扫描电镜形态观察
从武汉周边的焦化废水、生活废水、印染废水
等活性污泥及土壤中采样，筛选得到了多株絮凝活
性较高的菌株，选取其中的一株菌（MBF03）进行
了 16S rDNA 菌种鉴定，结果（图 1）显示，DNA 片
段大小约为 1.5 kb。图 2 是根据 16S rDNA 测序结果
绘制的进化树。由进化树可以看出，试验菌株（图
中黑色方框所示）属于泛菌属（比对分析表明二者
同源性达 98%）。但文献表明，目前尚未见该菌用于
絮凝方面的研究。通过扫描电镜观察该菌的形态结
构表明，该菌成杆状（图 3）。
2.2 基因定位
2.2.1 MBF03 的抗性测定及转化子的抗性测定 由
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期124
表1可以看出，絮凝菌MBF03具有氨苄青霉素（Amp）
抗性，最大耐受浓度可达 100 mg/mL，而对卡那霉
素（Kan）没有抗性。提取 MBF03 菌的质粒，将质
粒转化大肠杆菌后，依照上述浓度，涂布氨苄青霉
素平板，均有转化子长出，说明此菌的抗性遗传标
记位于质粒上。
携带质粒。图 5 为试验中随机挑选的 4 个转化子接
种提取质粒验证图，结果显示，其中 3 个转化菌含
有质粒，一个转化菌不含有质粒。
图 1 16S rDNA电泳图
图 2 MBF03系统进化树
图 3 MBF03菌扫描电镜照片图
表 1 两种抗生素下转化菌的抗性结果
抗生素
浓度（mg/L）
0 20 40 60 80 100
Amp + + + + + +
Kan + - - - - -
2.2.2 MBF03 菌的质粒的提取 按照方法 1.2.5.1，
提取 MBF03 菌的质粒，结果（图 4）显示， MBF03
图 4 MBF03质粒电泳图 图 5 转化子质粒电泳图
2.2.3 转化子絮凝率的评定 由图 6 可以看出，转化
M. DNA Marker ；1. MBF03 质粒 M. DNA Marker ；1-4. 转化子质粒
2012年第4期 125陈俊等 ：一株絮凝菌的鉴定、絮凝基因定位及其絮凝剂成分分析
菌的絮凝率很低，与阴性对照大肠杆菌 DH5α 的絮凝
率相差无几，因此判断 MBF03 的絮凝基因不在质粒
上。而对 MBF03 进行质粒消除处理，消除后的菌记
为 MBF03*，其絮凝率仍然达 89%，与原始的 MBF03
的絮凝率 92.3% 相近；另外，MBF03* 不能在含有氨
苄青霉素的平板生长，与文中 2.2.1 判断的抗性基因
位于质粒上相一致 ；而按照方法 1.2.5.1 对消除后的
MBF03* 菌进行质粒提取，没有提到质粒，因此确定
絮凝基因应位于 MBF03 染色体 DNA 上。
失的问题）。
2.3.2 絮凝剂红外扫描结果 对絮凝成分进行红
外扫描结果（图 8）所示，3 445、2 924、2 858、
1 648、1 460 和 1 040 cm-1 六处吸收峰是已知多糖
类的特征峰［12］，其中，3 445 cm-1 处的强宽吸收峰
是 -OH 的伸缩振动的特征峰，说明存在多羟基结构；
2 924 cm-1 和 2 858 cm-1 分别为 C-H 的 2 个伸缩振动
的特征峰 ；1 648 cm-1 和 1 460 cm-1 处的吸收峰分别
是 C-O-O 非对称伸缩和对称伸缩振动造成的结果，
表明絮凝剂中有羧酸根离子 ；1 150 cm-1-1 029 cm-1
是吡喃环（吡喃环是糖苷基本结构之一）的特征吸
收峰，由 C-O-C 和 C-OH 两种 C-O 伸缩振动吸收峰。
可以确定提取絮凝剂主要成分为酸性多糖类物质。
图 6 絮凝率比较
2.3 絮凝剂的成分分析
2.3.1 絮凝剂紫外扫描结果 从絮凝成分的扫描结
果（图 7）可以看出，由于蛋白质中色氨酸、酪氨
酸在 280 nm 处有较强吸收，苯丙氨酸在 260 nm 处
有较弱吸收，因而蛋白质的紫外光谱表现为在 280
nm 处有较强吸收峰，而核酸由于芳香环的存在，会
在 260 nm 处有特征吸收峰。因此通过检测这两个波
长处的吸收峰的有无及峰值高低，来判断样品中蛋
白、核酸的有无及含量高低。本试验中 MBF03 菌所
产的絮凝剂经纯化精制后，在 260 nm 和 280 nm 处
没有特征吸收峰，初步判断该絮凝剂不含蛋白质及
核酸或者含量极低（在纯化的过程中存在得率和损
图 7 絮凝剂紫外扫描分析
图 8 絮凝剂红外扫描图
3 讨论
3.1 絮凝率测定方法的改进
关于絮凝菌絮凝活性的测定方法，通用的都
是高岭土法，而高岭土法测定菌株絮凝活性时，向
高岭土悬浮液中加入絮凝菌发酵液后一般需要等待
5-30 min［13-15］，然后取上清于 550 nm 处测定上层
清液吸光度，再与测定的对照的吸光度比较进而确
定目的菌株的絮凝率，该方法比较耗时。本试验在
初筛时采用粒径 200 目铝土矿粉来测定菌株絮凝活
性的有无及高低。具体做法是用铝土矿粉代替高岭
土，制成悬浮液，加入絮凝菌发酵液后，与对照组
（即不加絮凝菌发酵液）比较，一般为 1-2 min 左右，
可直接目测两组的差别，对照组铝土矿粉悬浮液仍
然很浑浊，而试验组已经变得很澄清。用这种检测
方法确定的高活性絮凝菌株与用高岭土法测定的结
果具有一致性，但是却大大节约了目的菌株的选育
时间，而检测方法更简便。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期126
3.2 絮凝基因定位
已有的文献报道有关酵母的絮凝基因研究较多，
对于细菌的研究较少［16］。要了解絮凝基因，首先要
对其进行定位，即絮凝基因究竟是位于染色体上还
是位于质粒上。在质粒转化与质粒消除试验中，对
转化子再次进行质粒提取是非常必要的，以此确认
转化子确实携带了 MBF03 的质粒，在这种情况下，
即转化子携带了 MBF03 的质粒而又不具备絮凝活
性，方能断定絮凝基因没有位于质粒上。否则会出
现判断误差，即转化子没有絮凝活性可能是质粒根
本没有转化进细胞的缘故。同理，对消除后的菌也
有必要进行质粒提取，从而判断絮凝活性不是来自
于质粒。
4 结论
本研究从武汉市综合废水处理的活性污泥中分
离到的絮凝菌 MBF03 属于泛菌属，该菌与絮凝相关
的基因位于染色体上 DNA，所产生的絮凝剂的成分
主要是酸性胞外多糖。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）