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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
随着工业化的发展，水体富营养化现象日趋严
重，去除水中氮素污染已成为当今水污染防治领域
的一个热点问题［1，2］。目前普遍认为生物脱氮是从
污水中去除氮素污染的经济有效的方法之一［3，4］。
在诸多污水脱氮新技术中，应用广泛、发展较快及
最经济高效的有短程硝化反硝化、同步硝化反硝化
及厌氧氨氧化等，它们因具有节省曝气量、提高反
应速率、节约碳源、缩短反应时间等优点［5］，越来
收稿日期 ：2013-07-29
作者简介 ：郝敏娜，女，硕士研究生，研究方向 ：水污染控制 ；E-mail ：tyuthaominna@163.com
高温短程反硝化菌 Brevibacillus sp.XF-03 特性及其
降解动力学
郝敏娜  杨云龙  葛启隆
（太原理工大学环境科学与工程学院，太原 030024）
摘 要 ： 采用梯度驯化方法，使得菌株 Brevibacillus sp.XF-03 在高温（50℃）条件下，能够降解 1 000 mg/L 亚硝态氮，并
通过单因素试验对其生长碳源和 C/N 进行优化，结果显示，菌株 Brevibacillus sp.XF-03 短程反硝化最适碳源为琥珀酸钠，C/N 为
12∶1。在此最佳条件下，42 h 对初始浓度为 100 mg/L 亚硝态氮去除率为 95.1%。对该菌株亚硝态氮降解动力学过程进行模拟，符
合基质抑制型的 Haldane 模型，各参数分别为 ：最大比降解速率（μmax）=1.28 h
-1，半饱和常数（KS）=451.42 mg/L，底物抑制常数
（Ki）=176.77 mg/L。初步探讨了亚硝酸盐还原酶（NIR）活性，在该菌株生长指数期的后期，亚硝酸盐还原酶比活力达 0.279（U/
mg protein）。
关键词 ： Brevibacillus sp.XF-03 高温 短程反硝化 亚硝态氮降解动力学 酶活性
Characteristics and Degradation Kinetics of Thermophilic Shotcut
Denitrifier Brevibacillus sp.XF-03
Hao Minna Yang Yunlong Ge Qilong
（College of Environmental Science and Engineering，Taiyuan University of Technology，Taiyuan 030024）
Abstract:  The denitrifier Brevibacillus sp. XF-03 could reduce high nitrite concentration（1 000 mg/L）under the condition of high
temperature（50℃）by the method of gradient domestication. The effects of carbon source and C/N on growth and denitrification of the denitrifier
were optimized by single factor experiments. The results showed that the optimum shortcut denitrification carbon source of Brevibacillus sp. XF-
03 was sodium succinate, optimum C/N ratio 12∶1. Under the optimal condition, the nitrite removal efficiency reached 95.1% within 42 hours
when the original concentration of NO-2-N was 100 mg/L. Nitrite degradation kinetic studies indicated that the strain followed Haldane’s model,
and the parameters were ：μmax（maximum specific rate）=1.28 h
-1, Ks（half-satruration constant）=451.42 mg/L, K i（inhibition constant）=
176.77 mg/L. Nitrite reductase（NIR）activity was preliminary discussed. The NIR specific activity reached 0.279（U/mg protein）at the lag
phase of exponential growth.
Key words:  Brevibacillus sp.XF-03 High temperature Shortcut denitrification Nitrite degradation kinetics Enzyme activity
越受到人们的重视［6，7］，实现这些新技术的关键是
获得具有较高脱氮能力的微生物。此外，以上新技
术多适用处理中低温环境的污水［8，9］，若处理高温
污水则需对污水进行降温，这给生物法处理高温污
水带来较大困难。
本文研究菌株 Brevibacillus sp.XF-03 的高温短程
反硝化特性及其亚硝态氮降解动力学，以期为短程
硝化反硝化工艺的应用以及传统反硝化过程中亚硝
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期178
态氮积累问题的解决提供技术参数与新的菌源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 供试菌株 ：Brevibacillus sp. XF-03，
来源于太原理工大学环境科学与工程实验室，经鉴
定为短芽孢杆菌属（Brevibacillus sp.），GenBank 登
录号为 KF052620。试验初步证明在高温条件（50℃）
下，该菌具有较好的短程反硝化能力。
1.1.2 培 养 基 LB 富 集 培 养 基（g/L）：胰 蛋 白 胨
10 ；酵母浸出粉 5 ；NaCl 10 ；pH7.0-7.5。
短程反硝化培养基（g/L）：NaNO2 适量 ；KH2PO4
1.5 ；Na2PO4·7H2O 7.9 ；MgSO4·7H2O 0.1 ；琥珀酸
钠适量 ；微量元素溶液 2 mL ；pH 7.0-7.5。
微量元素溶液成分（g/L）：EDTA 50.0；ZnSO4 2.2；
CaCl2 5.5；MnCl2·4H2O 5.06；FeSO4·7H2O 5.0；（NH4）
6Mo7O2·4H2O 1.1 ；CuSO4·5H2O 1.57 ；CoCl2·6H2O
1.61 ；pH7.0-7.5。
以上培养基 121℃高压灭菌 20 min，固体平板
和斜面培养基均在上述培养基中加入 1.8% 的琼脂
粉。
1.2 方法
1.2.1 菌 株 Brevibacillus sp.XF-03 的 短 程 反 硝 化 驯
化 将 本 实 验 室 保 藏 的 菌 株 Brevibacillus sp.XF-03
接种至装有 LB 培养液的三角瓶中，30℃，160 r/min
摇床振荡活化 2 代，并将次级培养物活化至细菌对
数生长期，作为接种体使用。取活化后的菌液 10
mL，接入装有 100 mL 培养液的三角瓶中，摇床恒
温振荡。以琥珀酸钠作为唯一碳源和能源，利用
NO2
- -N 作为唯一氮源，采用梯度驯化的方法首先
对细菌进行升温培养。驯化培养过程按 10% 梯度接
种的方法，温度梯为 ：30℃→ 35℃→ 40℃→ 43℃
→ 46℃→ 48℃ → 50℃。菌株在 50℃下生长稳定后，
再对其进行亚硝态氮浓度梯度驯化。亚硝态氮浓度
梯度增加依次为 ：50、100、150、 200 、300、400、
500、600、700、800、1 000 mg/L。同时，在驯化的
过程中定期监测水质并观察微生物的生长情况。
1.2.2 菌株 Brevibacillus sp.XF-03 短程反硝化条件优
化 将处于对数生长期的菌液接入 100 mL 短程反硝
化培养基中，通过调节碳源（葡萄糖、苯酚、酒石
酸钾钠、柠檬酸钠、乙醇、琥珀酸钠）和 C/N（3∶1，
6∶1，9∶1，12∶1，15∶1，20∶1），50℃、160
r/min 摇床振荡培养，定期测定培养液中菌体生长量
与 NO2
- -N 含量。考察碳源与碳氧化（C/N）对菌株
Brevibacillus sp.XF-03 生长及短程反硝化能力的影响，
每组试验设 3 个重复。
1.2.3 短程反硝化动力学研究 在最佳试验条件下，
应用 Haldane 方程对菌株生长和亚硝态氮降解特性
进行动力学研究［10］。为用回归曲线求出准确的动力
学方程，动力学试验在较宽的 NO2
- -N 含量范围内进
行，即 0-1000 mg/L。NO2
- -N 浓度选择如下 ：0-200
mg/L 之 间， 每 40 mg/L 一 个 浓 度 梯 度 ；200-600
mg/L 之 间， 每 100 mg/L 一 个 浓 度 梯 度 ；600-1000
mg/L 之间，每 200 mg/L 一个浓度梯度。将菌悬液分
别接种到装有上述不同初始 NO2
- -N 浓度的短程反硝
化培养基中，摇瓶振荡培养，每隔适宜时间取样检
测培养液中的菌体含量和残余 NO2
- -N 含量。
1.2.4 粗酶液的提取 将处于不同生理时期的菌液
离心（8 000 r/min，10 min），弃去上清液，收集菌体，
用 0.01 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液（pH7.2）清洗后重
悬细胞，再次离心，重复 3 次，留取菌体沉淀。按
原菌液体体积的 1/5-1/10 加入裂解液，制成悬浮菌
液，裂解液的成分为 ：pH8.0 的 50 mmol/L Tris-HCI
缓冲液、2 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，置于冰
水浴中超声破碎。破碎液于 12 000 r/min，4℃离心
20 min，收集上清液即为粗酶［11］，低温保存待用。
1.2.5 菌体 OD600 测定 可见分光光度法，细胞干
重采用干燥恒重法测量，根据细胞干重标准曲线将
吸光度转换为细胞干重［12］；亚硝态氮测定 ：N-（1-
萘基）-乙二胺光度法［13］；亚硝酸盐还原酶（NIR）
活 力 测 定 ：测 定 系 统 总 体 系 3 mL， 内 含 1.0 mL
Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液（pH7.2），1 mL 粗酶液以
及 1 mL 0.01 mol/L 的亚硝酸钠溶液，试剂全部加入
后立即取适量上述混合液，测 340 nm 处的吸光度，
剩余待测液在常温静置 20 min 后测其 340 nm 处的
吸光度［14］。定义亚硝酸盐还原酶（NIR）活力单位
（U）为每分钟转化 1 μmol 亚硝酸盐氮所需酶量。总
蛋白含量用 Bradford 法测定［15］，酶的比活力以每毫
克蛋白质中所含酶的活力单位数计算。试验数据分
析借助 Matlab 软件。
2014年第1期 179郝敏娜等 ：高温短程反硝化菌 Brevibacillus sp.XF-03 特性及其降解动力学
2 结果
2.1 碳源对菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝化
影响
图 1 为 不 同 碳 源 情 况 下，42 h 后 菌 株 各 自
生 长 及 NO-2-N 降 解 情 况。 由 图 1 可 以 看 出 菌 株
Brevibacillus sp.XF-03 短程反硝化的顺利进行对碳源
有一定的选择性。该菌几乎不能以乙醇、苯酚、酒
石酸钾钠作为唯一碳源生长 ；而对葡萄糖而言，菌
体在其中所需的适应阶段较长，亚硝态氮降解也
不充分，可能是由糖类物质降解过程的复杂性引起
的。分别以柠檬酸钠和琥珀酸钠为碳源时，菌株
Brevibacillus sp.XF-03 均 能 较 好 地 生 长， 与 以 柠 檬
酸钠为碳源相比，当以琥珀酸钠为碳源时，亚硝态
氮降解率较高 42 h 亚硝态氮由 100 mg/L 降解到 5.9
mg/L，降解率达 94.1%，说明琥珀酸钠为该菌株的
最适碳源。
菌株 Brevibacillus sp.XF-03 进入对数生长期，在该
时期内，短程反硝化作用明显加强，因为这个时期
（18-36 h）是细菌生长和繁殖最旺盛的时期，细胞
合成所需要的能量和还原力主要在这一阶段被消耗，
因此反硝化作用主要在这一时段内完成。培养 42 h，
NO-2-N 从 100 mg/L 降 至 4.90 mg/L， 去 除 率 为
95.1%。在对数期后期，有效细菌的数目虽逐渐减少，
而亚硝酸盐仍有少量降低，此时很可能是细菌的同
化起主要作用。
OD600
O
D
60
0
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ӊ⺍
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⎃ᓖ
mg
/L

1.4
1.2
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0.8
0.6
0.4
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20
40
60
80
100
䞨䫐
碳源
图 1 碳源对菌体生长及 NO-2-N 降解的影响
2.2 碳氮化对菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝
化影响
以琥珀酸钠为唯一碳源，亚硝酸钠为唯一氮源，
固定碳源含量，通过调节亚硝酸钠含量控制碳氮比。
由图 2 可知，当碳氮化（C/N）小于 12 时，亚硝态
氮去除率及菌株生长情况随着 C/N 增加而提高，C/N
大于 12 时，亚硝态氮去除率及菌株生长情况趋于平
缓，提高不明显。综合考虑，确定菌株 Brevibacillus
sp.XF-03 的最适碳氮比为 12∶1。
2.3 菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝化特性
在最适碳源及碳氮比，培养液初始 NO-2-N 浓度
为 100 mg/L 条 件 下， 菌 株 Brevibacillus sp.XF-03 生
长及亚硝酸盐降解曲线如图 3。经 18 h 的适应期后
图 2 碳氮比（C/N）对菌体生长及 NO2
- -N 降解的影响
NO-2-N
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OD600
O
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1.4
1.2
1.0
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0
20
40
60
80
100
NO-2-N
ӊ⺍
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⎃ᓖ
mg
/L

OD600
O
D
60
0
1.4
1.2
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0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 6 12 18ᰦ䰤h24 30 36 42
0
20
40
60
80
100
图 3 菌株 Brevibacillus sp.XF-03 生长曲线及亚硝态氮变化
2.4 亚硝态氮降解动力学
短程反硝化菌在以亚硝酸盐氮为底物进行反硝
化的过程中，亚硝态氮对微生物有一定的毒害作用，
当其浓度达到一定值时，也会对反硝化过程产生抑
制，导致反应速率下降，因此建立动力学模型时，
需要选择一种非竞争性底物抑制模型，已经有多种
底物抑制模型被建立，其中 Haldane 模型是最常见
的模型，定义如下式 ：
μ=μmaxC/（Ks+C+C
2/Ki） （1）
式中，μ 为底物比降解速率（h-1）；μmax 为最大
比降解速率（h-1）；C 为底物初始浓度（mg/L）；KS
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期180
为半饱和常数（mg/L）；Ki 为底物抑制常数（mg/L）。
试验假定亚硝态氮是菌株 Brevibacillus sp.XF-03
比生长速率的单一限制性底物，摇瓶中的溶氧为常
数且为非限制性因素。对于每一个初始亚硝态氮浓
度（C），比生长速率（μ） 由指数生长期决定。对每
一个摇瓶指数生长期的菌体浓度和时间的半对数图
做线性最小二乘拟合得，在指数生长期，μ 约为一
个常数。
运用 Matlab 软件处理试验数据，得到亚硝酸
盐抑制动力学方程式（2）。模型相关性系数 R2 为
0. 992，说明拟合曲线与试验实测值相关性良好。
μ=1.28C/（451.42+ C+C2/176.77） （2）
模拟曲线如图 4 所示。底物比降解速率（μ）随
着亚硝态氮初始浓度的增加呈现先增大后减小的趋
势，这是典型的抑制生长模式，最大比降解速率发
生在亚硝态氮浓度为 282.48 mg/L 处，随着初始亚硝
态氮浓度的继续增加，其比降解速率逐渐减小，在
这一过程中，亚硝态氮抑制作用占主导。此外，反
应体系中代谢物的积累也是造成亚硝态氮比降解速
率下降的原因之一。
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ᘱ≞
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h-1 
ӊ⺍ᘱ≞ࡍ࿻⎃ᓖmg/L
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.05
0.00
0 200 400 600 800 1000 1200
0.10
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Haldane⁑ර
图 4 亚硝酸盐氮降解动力学拟合曲线
2.5 酶活性的测定
以琥珀酸钠为碳源，C/N=12，初始亚硝态氮浓
度为 282.48 mg/L，研究菌株 Brevibacillus sp.XF-03 亚
硝酸盐还原酶活性。由图 5 可知，菌株 Brevibacillus
sp.XF-03 在生长停滞期，亚硝酸盐还原酶活性较低，
亚硝态氮降解率仅有 12.56%，在其生长指数期的后
期，产生大量亚硝酸盐还原酶，且亚硝酸盐还原酶
的比活力达到最大值 0.279（U/mg protein），亚硝态
氮降解速率提高，说明脱氮过程中菌株不同生长阶
段亚硝态氮还原酶的活力不同，亚硝酸盐还原酶是
ᰦ䰤h
ӊ⺍
ᘱ≞
⎃ᓖ
mg
/L

NO-2-N
NIR∄⍫࣋
OD600
300
200
100
150
50
0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
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U/m
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n O
D
60
0
250
图 5 菌体生长，亚硝态氮降解及亚硝态氮还原酶比活力变
化曲线
短程反硝化菌降解亚硝态氮的关键酶。
3 讨论
反硝化微生物大多数需要碳源作为电子供体，
具有较广泛的碳源谱，碳源的种类影响到反硝化强
度［16］。Martienssen 等［17］认为有机碳源的数量和种
类是影响反硝化微生物菌落结构的重要因素之一，
这与本研究结论一致。同时，研究表明碳氮比也是
影响微生物脱氮效果的重要因素之一，低碳氮比条
件下，NO-2 和 N2O 均可利用内碳源进行反硝化，氧
化亚氮还原酶竞争电子的能力较弱，反硝化过程出
现 N2O 积累。碳源充足，亚硝态氮还原酶和氧化亚
氮还原酶同时利用外碳源进行反硝化，初始阶段产
生的 N2O 在接下来的反硝化过程中被迅速还原为
N2
［18］。碳源不足，反硝化速率降低 ；碳源过量虽可
提高系统反硝化脱氮能力，但增加了碳源消耗，同
时也增加了耗氧量。
目前，已发现多种反硝化菌，主要分布于 Pseu-
domonas、Alcaligenes 和 Bacillus 三个属［19］。对反硝
化微生物的研究主要集中于以硝酸盐氮为电子受体
的反硝化菌，对亚硝酸型反硝化菌的研究集中在混
合菌反应器运行上［20，21］，而对在温度与亚硝态氮含
量均较高的条件下短程反硝化单菌种的研究鲜见报
道。亚硝酸型反硝化是一个复杂生化过程，是短程
硝化反硝化的重要过程。本研究采用梯度驯化得到
高效的短程反硝化菌，优化影响短程反硝化的环境
因子，构建亚硝酸盐氮降解动力学模型及初步探讨
其酶活，以期为短程硝化反硝化工艺的应用以及传
统反硝化过程中亚氮积累问题的解决提供技术参数。
同时短程反硝化微生物的特性、亚硝酸盐还原酶的
2014年第1期 181郝敏娜等 ：高温短程反硝化菌 Brevibacillus sp.XF-03 特性及其降解动力学
表达及其应用有待于进一步研究。
4 结论
驯化得到高温短程反硝化菌 Brevibacillus sp.XF-
03，该菌株最佳生长碳源为琥珀酸钠，碳氮比（C/N）
为 12。
动力学模型具有良好的有效性，相关系数（R2）
为 0.992。
亚硝酸盐还原酶是短程反硝化菌降解亚硝态氮
的关键酶，在菌株 Brevibacillus sp.XF-03 生长指数期
的后期，产生大量亚硝酸盐还原酶，且亚硝酸盐还
原酶的比活力达到最大值 0.279（U/mg protein）。
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（责任编辑 李楠）