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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
近年来，国际上 RNA 领域的研究以一日千里的
速度发展。自从 1999 年 RNA 对生命活动的催化功
能得以明确开始，RNA 的地位从细胞“助手”逐渐
向生命“管家”升迁。从 2001 年到 2003 年，以及
2006 年，美国《科学》杂志每年评选的世界十大科
学突破，小分子调控 RNA 都榜上有名［1］。2006 年，
诺贝尔奖被授予 RNA 研究的重大贡献者，以表彰他
们发现 RNA 干扰现象的贡献。现在，RNA 干扰技
术以其优越的特性广泛应用于生命科学的各个领域。
RNA 干扰（RNA interference，RNAi），又称基
因沉默，是由双链 RNA 诱发的在转录后水平［2］上
的特异基因沉默现象。自从被发现以来就受到了广
泛的关注和重视，随着 Hannond 等［3］、Zamore 等［4］
收稿日期 : 2012-05-29
作者简介 : 于定群 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 生物技术在果树上的应用 ; E-mail: ydingqun@gmail.com
通讯作者 : 汤浩茹 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 果树遗传育种及生物技术 ; E-mail: htang@sicau.edu.cn
RNA 干扰及其在果树上的应用
于定群  汤浩茹  张勇  陈清  张晓楠  余昊唯
（四川农业大学园艺学院，雅安 625014）
摘 要 ： RNA 干扰是广泛存在于生物中的一种现象，它是由小干扰 RNA 诱导的特异基因沉默。它是生物体抵抗异常的一
种防御机制，同时在生物生长发育过程中调控基因的表达，为植物基因功能的研究开辟了新途径。综述了 RNA 干扰的作用机制、
RNA 干扰的特点，以及近年来 RNA 干扰在果树生长发育、抗病性、果实品质改良等方面的应用，以期为 RNA 干扰技术在果实品
种品质改良中的应用提供指导。
关键词 ： RNA 干扰 基因沉默 果树
RNA Interference and Its Application in Fruit Trees
Yu Dingqun Tang Haoru Zhang Yong Chen Qing Zhang Xiaonan Yu Haowei
（College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014）
Abstract:  RNA interference, which widely exists in organisms, is a phenomenon of specific gene silencing by small interfering RNA-
induced. RNA interference is a biological self-protective mechanism resisting to abnormal RNA. However, it also regulates gene expression in the
process of growth and development. So it has opened up new avenues on research of plant gene function. This review summarizes the mechanism
and characteristic of RNA interference. Meanwhile, it also focuses on applications of RNA interference in growth and development, disease
resistance, and fruit quality improvement of fruit trees in recent years, which will provide more guidance for further studies on breeding and
quality improvement of fruit.
Key words:  RNA interference Gene silencing Fruit tree
RNAi 作用机制模型的提出，RNAi 已被广泛用作研
究生物体基因表达、调控与功能的一种新技术［5-7］。
本文就 RNAi 作用机制和特性以及在果树上的应用
情况进行综述，以期为今后该技术在果实品种品质
改良中的应用提供指导。
1 RNA 干扰的作用机制
RNAi 现象的遗传学与生物化学机制逐渐清晰。
它 是 在 双 链 RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）
参与指导的，以外源和内源 mRNA 为降解目标的，
具有核苷酸序列特异性的自我防御机制［8］。RNAi
的作用过程是多步骤、多因素参与的复杂过程，大
致经历 3 个阶段，即起始阶段、效益阶段和扩增
阶段［9］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期58
1.1 起始阶段
起始阶段有两个步骤 ：（1）dsRNA 的导入，包
括由外源导入或由转基因转座子、病毒感染等各
种 方 式 引 入 dsRNA ；（2） 导 入 的 dsRNA 被 一 种
ATP 依赖性的核酸酶Ⅲ家族的核酸内切酶 Dicer 切
解为 21-23 nt 的小分子干扰 RNA（small interfering
RNA，siRNA）［10］。Dicer 在基因 Rde-1 编码蛋白的
帮助下与 dsRNA 结合，形成酶 dsRNA 复合体，同
时在 ATP 作用下，将 dsRNA 解旋，接着将其切割
为 21-23 个核苷酸小片段。这些小片段 RNA 称为
siRNA，其 3 端为羟基，且有 2 个突出的单核苷酸
和 5 端为磷酸基团，此结构对于 siRNA 行使其功能
非常关键，具特异性［11］。
1.2 效益阶段
在效应阶段，双链的 siRNA 首先被包裹进一
个多蛋白复合体中，与细胞源性的某些酶和蛋白质
形成 RNA 诱导沉默复合体（RNA-induced silencing
complex，RISC）。在 ATP 存在的情况下，RISC 被激
活，双链 siRNA 打开，释放出正义 RNA 链，以反义
RNA 单链作为选择目标的向导寻找互补的靶 mRNA
并与之结合，该复合体通过碱基互补配对识别靶
mRNA，并在互补区中距 siRNA 反义链 3 末端 12 bp
处切断靶 mRNA［12］，介导其降解，使对应的蛋白质
水平下降，最终导致特定基因沉默。RISC 犹如一个
mRNA 降解平台，可与不同的 siRNA 结合，并在不
同的情况下结合不同的调节分子，实现对不同的靶
mRNA 的切割与降解［13］。
1.3 扩增阶段
siRNA 不仅可引导 RISC 切割靶 RNA，而且可作
为引物在 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RNA-dependent
RNA polymerase，RdRP）作用下，以靶 mRNA 或自
身为模板合成新的 dsRNA。新合成的长链 dsRNA 同
样可被 Dicer 切割、降解而生成大量的次级 siRNA。
新生成的 siRNA 和活性的 RISC 又进入以上循环。
这种过程被称为随机降解性多聚酶链式反应（random
degradative PCR）［14］。新生的 dsRNA 反复合成和降
解，不断产生新的 siRNA，而使靶 mRNA 渐进性地
减少，表现出基因沉默现象。同时，结合了 RISC 的
靶 mRNA 也会被内切酶切割，mRNA 链上缺乏 poly
（A）尾巴和稳定头部的保护，而被快速降解。
2 RNA 干扰的特性
2.1 特异性
RNA 干扰具有很高的特异性，只特异性的沉默
外源或内源 dsRNA 同源的 mRNA，1-2 个碱基的错
配就会降低对目的 mRNA 的沉默，而对不相关序列
的表达无干扰作用［15，16］。
2.2 高效性
RNA 干扰抑制基因表达具有很高的效率，数量
相对很少的 dsRNA 分子即能完全抑制相应基因的
表达，而且对目的基因表达的抑制可以达到缺失突
变体表型的程度。许多生物学和遗传学证据表明，
RNA 干扰效应中存在信号分子的扩增机制［2，17］。
siRNA 不仅可引导 RISC 切割靶 RNA，而且可作为
引物在 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRP）作用下，
以靶 mRNA 或自身为模板合成新的 dsRNA。新合成
的长链 dsRNA 同样可被 Dicer 切割、降解而生成大
量的次级 siRNA。次级 siRNA 又可进入“合成 - 切割”
的循环过程，进一步放大 RNAi 作用。
2.3 可传播性和遗传性
在植物体内，通过 RdRP 扩增的 siRNA 不仅在
同一个细胞内维持基因沉默效应，而且还能通过细
胞内的运输通道送到植物体的其他细胞执行基因沉
默功能，把 siRNA 的功能扩展到整个植物体内。研
究表明［18，19］，在发生 RNA 沉默的细胞裂解液中存
在作用不同的 21-26 nt 的 siRNA，而且认为 21-23
nt 的 siRNA 能够进行短距离的信号传导，而 24-26
nt 的 siRNA 很可能参与长距离干扰信号的传导。
dsRNA 分子不仅能够通过细胞膜、细胞间隙
和细胞屏障而被转运，而且能稳定遗传给后代。
Palauqui 等［20］研究发现，转基因引起基因沉默的植
株可以通过嫁接从沉默砧木传播到未沉默接穗上，
通过将含有已沉默基因的植株嫁接到未沉默基因的
寄主植株上，诱发寄主植株发生了 RNA 干扰。许多
研究发现植物中往往能稳定遗传到第 3 代［21，22］。
2.4 ATP依赖性
RNAi 的过程需要 ATP 为其提供能量，去除内
源性 ATP 后，dsRNA 对目的基因的抑制作用明显降
低或消失，而加入外源性 ATP 后，仍不能加强其抑
2012年第12期 59于定群等 ：RNA 干扰及其在果树上的应用
制作用，显示 RNAi 是一个 ATP 依赖的不可逆过程。
研究还认为［4，23］在长双链 RNA 被切割成 siRNA 和
siRNA 与 RPSC 结合形成有活性的 RNA 诱导沉默复
合物 RISC 都需要 ATP 提供能量。
2.5 生物体之间的差异性
尽管不同生物的 RNA 沉默机制相似，但与其他
生物相比植物有其特异性。首先表现在植物中存在
系统性 RNA 沉默现象，即 RNA 沉默不会局限于单
个细胞内，可以在细胞与细胞之间、甚至由诱导部
位向更远的组织传播。有人［19，26-28］推测植物中沉
默效应信号分子的传播可分为短距离和长距离两种，
短距离通过胞间连丝传播 21-23 nt 的 siRNA，而长
距离则是通过维管束传播 24-26 nt 的 siRNA，最后
21-26 nt 的 siRNA 引发植物系统性沉默和甲基化。
而在动物中不存在长距离的 24-26 nt siRNA，这可
能与植物与动物的特定的细胞结构有关。其次，动
物中的 RNAi 遗传往往只限于子 1 代，子 2 代往往
又回复到野生型［29］，而植物中往往能稳定遗传到第
3 代［21，22］。
3 RNA 干扰在果树上的应用
RNAi 作为一种新的特异性体内基因表达的抑制
机制，为有关研究领域提供了一个利用反向遗传学
方法大规模研究未知基因功能的具有可操作性的技
术平台，它的发现激起了世界范围内各个实验室探
索基因功能的兴趣，成为研究基因功能的最有用的
工具。近来许多研究者运用 RNAi 构建了果树的遗
传转化，以研究特定基因在特定生理过程中的作用。
3.1 利用RNAi调控果树生长发育
研究生物体早期发育的基因调控通常是抑制特
定基因的表达，研究该基因在生物体生长发育过程
中的作用。绝大多数果树为木本植物，特别是童期
较长，RNAi 具有高效性和特异性，无疑会成为一种
快速缩短童期、促进果树提前开花结果的高效研究
方法。近年来，有不少学者利用此技术发现了一些
控制果树生长发育的关键基因。
果树往往通过嫁接繁殖，要大规模地获得具有
优良性状砧木可以通过组织培养的方法。但是，组
织培养过程中不定根形成往往是主要的限制因子。
Smolka 等［30］运用 RNAi 技术发现，ARRO-1 与苹果
不定根形成相关，并且这种效应能够通过嫁接从砧
木传播到接穗上［20］。通过 RNAi 技术寻找大量的根
形成相关基因，不仅是一种获得优良性状砧木的有
效方法，还可以解决生产上猕猴桃等果树扦插生根
比较困难的问题。而在果树生长发育过程中，有的
基因在维持其特定的表型中起重要的作用，有的基
因作为调控因子调控其生长发育。Chatterjee 等［31］
研究发现，KNOX 调控草莓叶、花和分生组织的形态，
该基因的缺失和过表达都将导致侏儒的表型，并且
叶和花的形态都发生改变。bHLH 基因与心皮发育、
光敏色素信号、花青素合成、逆境胁迫等相关，将
一类 bHLH 基因 SPATULA 沉默之后，果实变小并
且形状也发生了改变［32］。因此，利用 RNAi 技术可
以发现调控果树生长的关键基因，并且将其调控在
最适合果树生长发育的程度，将极大地缩短果树的
生长周期，促进果树提前开花结果。
3.2 利用RNAi调控果实成熟衰老
果实的成熟是由多种基因控制的，目前已成功
地构建了成熟相关基因的沉默载体，为揭示果实成
熟中相关基因的表达调控及果实成熟的分子机理具
有重要意义。如在呼吸跃变型果实方面，董凤英等［33］
和杨超［34］构建，含有 Maasr1 基因的 RNAi 植物表
达载体，为香蕉的成熟的调控机理的研究奠定了基
础 ；在非跃变型果实方面，朱海生等［35，36］先后构
建了草莓乙烯受体 FaEtr2 、FaEtr1 和 FaErs1 RNAi
表达载体，为后期该基因转化草莓以改良草莓果实
耐贮运性、了解草莓中乙烯的生成、延迟其果实成
熟衰老奠定了基础。了解两种呼吸类型的果实的成
熟相关基因在果实成熟过程中的作用，有利于全面
了解和认识不同种类果实成熟调控的共性机理和特
殊机制。
果实的成熟时间是果树生产上最为关心的话题。
研究发现［37］PpCHLH 为单拷贝基因，在各种组织
中都表达，影响着叶片气孔的运动和果实的成熟时
间。并且外源的 ABA 虽然能促进野生型果实的成熟，
但是并不能挽救 PpCHLH 沉默的果实的成熟，说明
PpCHLH 在果实成熟过程中起着关键作用，调控果
实成熟时间。因此，如果充分利用此类基因调控果
实成熟时间，将打破果实供应时间的局限，为消费
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期60
者提供更多新鲜的果实。
3.3 利用RNAi增强果树抗病虫性
RNAi 介导的植物抗病研究是近年来引起广泛
关注的一项植物抗病基因工程策略。利用 RNAi 技
术的原理可设计合成与病毒同源的 dsRNA，并将其
导入植物体，由植物体的 RNAi 机制对病毒基因组
进行特异性切割降解，阻止病毒的复制扩张，从而
保护植物体不受病毒危害。在葡萄上，已成功构建
葡萄 GVA［38］ 和 GFLV［39］ 的相关基因 RNAi 载体，
为进一步探索葡萄感染病毒之后的病毒脱除奠定了
基础。阳佳位［40］用 SOE 法将 3 个沉默因子拼接成
多基因片段，构建成两个 CTV RNAi 载体，经根癌
农杆菌介导转化锦橙外殖体，成功诱导抗性不定芽
再生并获得转基因植株。将转基因植株嫁接后接种
CTV 强毒系 TRLS14，结果发现有 3 株表现出 CTV
抗性。这些结果为培育抗病毒砧木、接穗、果树新
品种等意义重大。
香蕉穿孔线虫能严重危害香蕉、柑橘、胡椒等
重要经济作物。由于该线虫的危害，曾使得非洲及
印度的香蕉、美国的柑橘、印尼的胡椒等遭受严重
的损失。李宇等［41］发现浸泡可以明显抑制 Cathepsin
B 的表达量，从而影响该线虫的的繁殖力。这为合
成能够表达相关基因的特异 dsRNA 表达载体，并转
化到香蕉穿孔线虫的寄主植物上，培育出具有抗香
蕉穿孔线虫的转基因新品种，为香蕉穿孔线虫的防
治提供一种新的途径。
3.4 利用RNAi改善果实品质
随着生活水平的提高，人们对水果品质的要求
也越来越高。例如，要求果实色香味俱全，营养成
分含量更高且比例更平衡，抗性物质越少，并兼具
保健功能。传统的育种方法显然不能完全满足人们
的需求，而 RNAi 技术的出现使这一切成为可能。
在果实营养成分研究方面，高静等［42］对苹果
果实 L-半乳糖脱氢酶 cDNA 的克隆并获得了其 RNAi
载体，为进一步鉴定该基因的生物学功能和研究苹
果果实 Vc 的生物合成与积累机理等奠定了基础。这
为提高果实 Vc 及其他营养成分以及商品性奠定了
基础。
果实的色泽往往是果实的经济特性之一，国内
外许多研究者都致力于果实色素形成机理的研究。
Muňoz 等［43］利用 RNAi 技术研究发现 Fra a 在草莓
类黄酮生物合成中具有重要的功能。RNAi 后发现，
果实中花青素含量和及其上游代谢水平显著下降，
并且查尔酮转录水平也下降，表明 Fra a 与草莓类
黄酮生物合成直接相关，并且在红色草莓的色素形
成中具有重要的功能。Griesser 等［44］将 FaGT1 基因
沉默序列注射入半成熟的草莓果实，发现有 1/3 的
果实在成熟过程中的花青素含量显著下降。也有研
究发现果实成熟过程中 FaNCED1 降低了 ABA 含量
并且导致果实不着色。Jia 等［45］利用病毒诱导的基
因沉默技术（VIGS）显著地下调了 FaNCED1 和一
种 ABA 受体基因 FaCHLH 的表达，并且均得到草莓
无色果实类型。有意思的是通过外源 ABA 处理能够
挽救 FaNCED1 下调果实的着色却不能恢复 FaCHLH
下调的果实的颜色。并且 FaCHLH 下调的果实中
ABA 水平和糖含量以及一些 ABA 和糖依赖性基因发
生了变化，外源蔗糖能通过促进 ABA 的积累从而显
著地促进果实的成熟，说明 ABA 在果实成熟过程中
是一种重要的信号分子。这些研究说明，果实颜色
的形成受到多基因调控，利用 RNAi 技术研究其颜
色形成的关键基因以及关键物质的积累，为果实色
泽的改良以及培育出不同色泽的水果奠定了基础。
在果实风味的改变方面，Hoffmann 等［46，47］通
过基因沉默发现，CHS 的转录水平和同工酶类水平
降低的同时，增加了芳香类物质子丁香酚和异子丁
香酚基因的表达。说明通过体内的类黄酮合成途径
向苯丙烯合成途径的改变的方式提高草莓的风味是
可行的。
有些过敏性患者往往对特定的果实过敏，因而
不能食用水果。为了解决此类问题，Krath 等［48］、
Maghuly 等［49］、Gilissen 等［50］通过 RNAi 显著地降
低了过敏源 Mal d 1 基因表达水平，而且基因沉默能
够稳定到第 3 年，贯穿生长发育的所有过程。利用
RNAi 通过基因沉默的方式生产低敏感性的果实，让
更多的人也能安全享用水果也是果树生产上的目标
之一。
3.5 利用RNAi提高果实耐贮性
果实独特的成熟衰老机制往往使其贮藏保鲜难
2012年第12期 61于定群等 ：RNA 干扰及其在果树上的应用
度大，其成熟衰老与乙烯的生物合成密切相关。在
乙烯生物合成过程中，ACC 合成酶和 ACC 氧化酶
是两个关键酶。近年来，对控制乙烯合成的基因在
成熟衰老过程中的表达进行了深入研究，获得了
梨［51］、苹果［52］和柿［53］等果树 ACC 合成酶或氧化
酶基因的双链 RNAi 的植物载体和缺失突变体，为
进一步获得耐贮藏的果树新种质提供了可能。利用
RNAi 提高抗褐化能力方面，曹艳红［54］已将苹果
PPO 的 RNA 干扰表达载体成功转入长富 2 号苹果，
获得的转基因苹果植株内 PPO 基因的干扰效果达
91.69% 以上，降解了体内同源的 PPO 基因转录而成
的 mRNA，达到基因敲除的目的。周莉莉［55］将多
酚氧化酶基因 dsRNAi 导入丰水梨，获得了抗性芽，
检测发现 2 个阳性植株可用于后续研究。在抗果实
软化方面，于丛丛等［56］构建了上西早生柿 ETR5 基
因 RNAi 植物表达载体 ；钱春等［57］构建了草莓果胶
裂解酶（PL）RNAi 植物表达载体 ；胡钟东等［58］以
砂梨‘若光’的成熟果实为材料，成功地构建了干
扰 LOX 基因表达的 RNAi 的植物双元表达载体 ；郝
青南等［59］构建了草莓的多聚半乳糖醛酸酶的 RNAi
表达载体，并且均获得了阳性植株。这些为进一
步研究果实成熟过程中相关基因功能及通过转基因
技术获得抗软化、耐贮藏的果实开辟了一条崭新的
途径。
表 1 RNAi 诱导的基因沉默在果树上的运用
基因 蛋白质 功能预测 RNAi 载体 物种 参考文献
ARRO-1 不定根相关氧合酶 不定根形成 pK7GWIWG2（II） 苹果 ［30］
FaKNOX1 KNOTTED1 家族转录因子 叶起源和叶类型调控 CaMV35S 草莓 ［31］
SPATULA 转录因子 转录调控 pBIN20 草莓 ［32］
Maasr1 转录因子 转录调控 pBBB，pBI121 香蕉 ［33，34］
FaEtr2 乙烯受体 乙烯合成和信号转导 pBI121 草莓 ［35］
FaEtr1 乙烯受体 乙烯合成和信号转导 pBI121 草莓 ［36］
FaErs1 乙烯受体 乙烯合成和信号转导 pBI121 草莓 ［36］
PpCHLH 脱落酸受体 调控果实成熟与着色 pTRV2 桃 ［37］
GVA MP GVA 运动蛋白 运动 pFGC5941 葡萄 ［38］
MPc GFLV 运动蛋白 运动 pPZP200 葡萄 ［39］
P25，P20，P23 CTV 沉默抑制因子 抗 CTV 病毒 pCAMBIA2301 锦橙 ［40］
Rs-cb-1 组织蛋白酶 繁殖 —— 香蕉穿孔线虫 ［41］
MdGalD H L-半乳糖脱氢酶 Vc 合成 pMDR 苹果 ［42］
Fra 病原相关蛋白
过敏原
类黄酮生物合成 pBI 草莓 ［43］
FaGT1 花青素葡萄糖基转移酶 色素形成 pBI 草莓 ［44］
FaCHLH 脱落酸受体 调控果实成熟与着色 pTRV2 草莓 ［45］
FaCHS 查尔酮 色素形成
香味形成
ihpRNA
pBI
草莓 ［46］
［47］
Mal d 1 病原相关蛋白
过敏原
过敏原调控 ——
pBINPLUS
苹果 ［48-50］
ACO ACC 氧化酶 延长果实贮藏期 pYF028 梨 ［51］
ACC ACC 合成酶 延长果实贮藏期 pYF9078
pSMAK311
苹果
柿
［52］
［53］
PPO 多酚氧化酶 果实褐化 pYF7704
pYF7704
苹果
梨
［54］
［55］
ETR5 乙烯受体 乙烯合成和信号转导 pSMAK321 柿 ［56］
PL 果胶裂解酶 果实软化 p2024 草莓 ［57］
LOX 脂氧合酶 果实成熟、衰老、软化 pYF7713 梨 ［58］
PG 多聚半乳糖醛酸酶 果实软化 p2301 草莓 ［59］
CsERF1 乙烯响应元件结合蛋白 转录调控 pFGC5941 柑橘 ［60］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期62
由于 RNAi 具有高度的序列专一性和有效的干
扰活力，同时 RNAi 可以在不破坏基因结构或不引
起基因突变的情况下，敲除某种基因，以研究其功
能。但是由于绝大多数果树是木本植物，生活周期
长，因此目前果树 RNAi 的研究多数还处于载体构建、
各种缺失突变体的获得阶段（表 1）。但随着各种缺
失突变体的获得，为果树品种品质改良奠定了深厚
的基础。
4 展望
RNAi 作为一种新的特异性体内基因表达的抑
制机制，与传统的基因敲除技术相比，具有投入少，
周期短，操作简单等优势。它将成为研究果树基因
功能不可或缺的工具，在果树重点突破领域，如抗病、
抗虫、提高环境胁迫、改变果实性状、促进单性结实、
改善果实鲜食与加工品质，以及缩短童期等方面发
挥着重大作用。
随着后基因组时代的到来，人们越来越需要大
规模、高通量地研究基因的功能，而蔷薇科多种植
物基因组测序的完成（www.rosaceae.org）使得这一
切成为可能。RNAi 的应用不仅可以促进果树种质资
源的增加和果实品质的改良，而且还将解决果树多
倍体、遗传变异复杂、基因冗余而很难获得特定的
功能缺失或突变的难题。
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（责任编辑 狄艳红）