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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
乳酸（Lactic acid），又名丙醇酸，是一种在人体、
动植物、微生物体内普遍存在的有机酸［1］。乳酸及
收稿日期 ：2014-03-27
基金项目 ：国家林业局“948“项目（2011-4-13）
作者简介 ：王义强，男，教授，博士生导师，研究方向 ：细胞工程与生物能源 ；E-mail ：wangyiqiang12@163.com
戊糖乳杆菌发酵产乳酸及高产菌株诱变选育
王义强1，2，3  王启业1  马国辉1  林丽云1
（1. 中南林业科技大学生物技术实验室，长沙 410004 ；2. 经济林培育与保护教育部重点实验室，长沙 410004 ；
3. 国家林业局生物乙醇研究中心，长沙 410004）
摘 要 ： 戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）是能利用木质纤维素水解液发酵产乳酸的潜力菌株，发酵条件优化与高产菌株
的选育是提高乳酸产量的重要手段。通过单因素试验、Plackett-Burman 设计与响应面试验，对戊糖乳杆菌 ATCC 8041 产乳酸的发
酵培养基及发酵条件进行了优化。结果表明，该菌株发酵培养基的最佳组合为葡萄糖 93.11 g/L、酵母浸粉 5.19 g/L、碳酸钙 29.43 g/L、
蛋白胨 10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO4 0.20 g/L、MnSO4 50 mg/L ；最佳发酵条件为 37℃、pH6.5、接种量 6%、装液量
80%。在此优化条件下，该菌株发酵产乳酸为 54.12 g/L。进一步以戊糖乳杆菌 ATCC 8041 为出发菌株，通过原生质体进行紫外诱
变，经多重筛选，最终获得一株遗传稳定性好的高产乳酸突变株，命名为戊糖乳杆菌 Lactic UVC-02，由中国典型培养物保藏中心
保存，注册号为 CCTCC M 2013209。该突变株 Lactic UVC-02 经葡萄糖发酵，乳酸产量达 64.17 g/L，比出发菌株 ATCC 8041（54.12
g/L）提高 18.6%。
关键词 ： 戊糖乳杆菌 乳酸发酵 紫外诱变 响应面试验
Lactobacillus pentosus Fermentation Lactic Acid Production and High
Yield Strain Mutation Breeding
Wang Yiqiang1，2，3 Wang Qiye1 Ma Guohui1 Lin Liyun1
（1. Biotechnology Laboratory of Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004 ；2. Key Lab of Non-wood
Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education，Changsha 410004 ；3. Bio-ethanol Research Center of State Forestry
Administration，Changsha 410004）
Abstract: Lactobacillus pentosus is a potential strain which can make use of the lignocellulose hydrolysate fermentation to produce lactic
acid, optimization of fermentation conditions and the breeding of high yield strain are the important means to improve lactic acid production.
Fermentation medium and fermentation conditions were optimized for strain Lactobacillus pentosus ATCC 8041, through single factor experiment,
Plackett-Burman design and response surface experiment. The results showed that the best combination of fermentation medium is 93.11 g/L
glucose, 5.19 g/L yeast powder, 29.43 g/L calcium carbonate, 10.00 g/L peptone, 5.00 g/L Na2HPO4·12H2O, 0.20 g/L MgSO4, 50 mg/L MnSO4.
The best fermentation conditions is temperature 37℃ , pH6.5, quantity of 6%, and fluid amount 80%. The lactic acid production is 54.12 g/L
under the optimized fermentation medium and fermentation conditions. And then, Lactobacillus pentosus ATCC 8041 was taken as the original
strain, treated with UV mutation ATCC 8041 protoplast, after through multiple screening, finally we have got a mutant which has high lactic acid
production, named Lactobacillus pentosus lactic UVC-02 which conserved in China Center for Type Culture Collection, registration number for
CCTCC M 2013209. The results for glucose fermentation showed that lactic UVC-02 produced 64.17 g/L lactic acid, which was 18.6% higher
than the original strain.
Key words: Lactobacillus pentosus Lactic acid fermentation UV mutation Response surface experiment
其衍生物可广泛应用于食品、化工、纺织、制革、电子、
医药以及农业等诸多领域［2，3］。随着环境污染问题
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期180
日益严重，应用新技术开发新型塑料，从而解决传
统塑料造成的“白色污染”问题，已成为各国研究
的热点［4］。乳酸可聚合生产聚乳酸来制造生物降解
塑料、绿色包装材料及农业薄膜。聚乳酸无毒，无
刺激性，具有较好的生物相容性和生物降解性。以
聚乳酸来加工成塑料可解决日益严重的环境污染问
题，引起世界的广泛关注。乳酸的生产方法有酶合
成法、化学合成法、微生物发酵法 3 种［5］。工业化
生产多采用前两种方法，但它们目前面临原料来源
有限、成本急剧增加的困境，最主要的是生产过程
中带来严重的环境污染。因此，通过微生物发酵法
生产乳酸将成为未来发展的主要趋势。
目前，能应用到工业生产乳酸的微生物只有霉
菌中的根霉属和细菌中的乳酸菌类［6-8］。利用根霉
属的米根霉生产乳酸在国内外研究很多，但其发酵
产乳酸存在糖转化率低（理论值 75%）、有氧混合发
酵成本高和副产物多等不足［5，9］。乳酸细菌能利用
葡萄糖（或可利用的碳水化合物）发酵产乳酸，糖
转化率可达 90% 以上，且发酵成本低，产物主要为
L-型乳酸和 D-乳酸混合物［10］。部分乳酸菌甚至可利
用木质纤维素的水解产物，如木糖、阿拉伯糖等五
碳糖，发酵产生乳酸［11-13］。
传统的乳酸发酵常以粮食作物为底物，不仅浪
费粮食，且使乳酸价格高昂。因此，寻找和选育能
够利用木质纤维素水解液为原料的高产乳酸菌株迫
在眉睫。因传统诱变具有诱变效率高且不易回复突
变等特性，工业生产上乳酸菌种的选育多数是以传
统的诱变选育为主［14］。戊糖乳杆菌（Lactobacillus
pentosus）ATCC 8041 不仅能利用六碳糖也能利用五
碳糖发酵生产乳酸，是能利用木质纤维素水解液发
酵产乳酸的潜力菌株［15］。本研究首次采用紫外线对
出发菌株戊糖乳杆菌 ATCC 8041 原生质体进行诱变
处理，期望筛选出高产乳酸突变株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 本试验所用的戊糖乳杆菌（Lactobacillus
pentosus）ATCC 8041 购于美国典型培养物保藏中心。
1.1.2 培养基 MRS 肉汤活化培养基 ：眎蛋白胨
10 g/L， 酵 母 提 取 物 5 g/L， 牛 肉 膏 10 g/L， 葡 萄
糖 20 g/L，山梨醇酐单油酸 1 g/L，柠檬酸铵 2 g/L，
MnSO4·H2O 0.05 g/L，CH3COONa·3H2O 7.73 g/L，
Na2HPO4·12H2O 5.04 g/L，H2O 1 000 mL，固体培养
基添加 15 g/L 的琼脂，pH6.5。
发酵培养基 ：葡萄糖 90 g/L，眎蛋白胨 10 g/L，
酵母粉 5 g/L，Na2HPO4·12H2O 5 g/L，MgSO4 0.2 g/L，
MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO3 30 g/L。
种子培养基（改良的 MRS 培养基）：眎蛋白
胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、牛肉膏 10 g/L、葡萄
糖 20 g/L、山梨醇酐单油酸 1 g/L、柠檬酸铵 2 g/L、
MnS04·H2O 0.05 g/L、三水合乙酸钠 7.73 g/L、十二
水合磷酸氢二钠 5.04 g/L，pH6.5。
斜面培养基 ：在种子培养基的基础上，添加琼
脂 20 g/L。
筛选培养基 ：改良的 MRS 培养基中加入 0.01％
溴钾酚绿。
高 渗 再 生 培 养 基 ：采 用 双 层 琼 脂 法， 用 0.7
mol/L NaCl 配制 MRS 培养基，上层含 2% 琼脂，下
层含 3% 的琼脂。
渗透压稳定剂 ：0.7 mol/L NaCl 溶液。
1.2 方法
1.2.1 种子培养 取 1 mL MRS 肉汤培养基于安瓿
管中溶解菌体，稀释后涂布平板，培养 3 d ；取平板
培养菌落接种于含 10 mL 种子培养基的 25 mL 试管，
37℃静置培养 10 h 为一级种子液。取 1 mL 一级种
子液接种于含 100 mL 种子培养基的 250 mL 锥形瓶，
37℃恒温摇床中 150 r/min 培养 10 h 后用于试验。
1.2.2 发酵培养基单因素试验 以乳酸产量为考察
指标，对发酵培养基中的 7 个组分 ：葡萄糖（60、
75、90、105、120 和 135 g/L）、蛋白胨（0、5、10、
15 和 20 g/L）、酵母粉（0、2.5、5、7.5 和 10 g/L）、
Na2HPO4·12H2O（0、2.5、5、7.5 和 10 g/L）、MgSO4（0、
0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 g/L）、MnSO4·H2O（0、
25、50、75 和 100 mg/L）、CaCO3（0、10、20、30、
40、50 和 60 g/L）进行单因素试验，除目标因素外，
其余培养基组分均按发酵培养基和已筛选因素中的
较佳条件进行试验，每组 3 个平行，37℃厌氧发酵
72 h，液相色谱检测产物，结果取平均值。
1.2.3 Plackett-Burman 试验设计与响应面试验 在
2014年第11期 181王义强等：戊糖乳杆菌发酵产乳酸及高产菌株诱变选育
单因素试验的基础上确定低水平（-1）值，高水平
（1）为低水平的 1.25 倍，选取影响乳酸产量较大
的 7 个因素（葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、Na2HPO4、
MgSO4、MnSO4、CaCO3）进行全面考察，选用 N=12
的 PB 设计，以乳酸产量（Y）为响应值，利用试验
设计和数据分析软件 Minitab15 进行 Plackett-Burman
设计［16，17］，根据软件给出的试验矩阵表确定各试验
组的编码与取值进行试验，再根据试验结果进行数
据分析，筛选出重要影响因素。
根据 Plackett-Burman 设计试验结果，采用 Box-
Behnken 设计进行试验［18，19］，所得结果利用软件以
乳酸产量（Y）为响应值做响应面分析，从而获得
培养基中重要因子的最佳组合。
1.2.4 发酵条件单因素试验 在发酵培养基优化的
基础上，以乳酸产量为考察指标，分别对温度（31、
33、35、37、39、41 和 43℃）、初始 pH（4.0、4.5、
5.0、5.5、6、6.5 和 7.0）、种子液接种量（2%、4%、
6%、8%、10% 和 12%） 及 100 mL 发 酵 瓶 装 液 量
（65%、70%、75%、80%、85%、90% 和 95%） 依
次进行单因素试验。除目标因素外，其余培养条件
按已筛选的最佳条件进行试验，每组 3 个平行，进
行厌氧发酵，液相色谱检测，结果取平均值。
1.2.5 原生质体制备 取 10 mL 液体种子培养物于
灭过菌的离心管中，4 000 r/min 离心 15 min，去上
清液，用无菌生理盐水洗涤收集的菌体两次，加入
3 mL 含溶菌酶的渗透压稳定剂中，将制备的菌酶混
合液在 30℃的条件下酶解 2 h，将酶解液 3 000 r/min
离心 15 min，取上清液收集原生质体，将原生质体
悬浮于 10 mL 渗透压稳定剂中备用。
1.2.6 原生质体紫外诱变 取 5 mL 经高渗溶液稀释
后原生质体溶液，混匀，倒入直径 9 mm 的培养皿中，
在磁力搅拌下距功率 20 W 的紫外灯 35 cm 处进行 0、
20、40、60、80、100 和 120 s 紫外照射。诱变结束后，
取不同时间的处理液 100 μL 涂布在高渗再生培养基
上，每个处理 3 个重复，37℃条件下恒温避光培养
72 h。以时间为横坐标，致死率为纵坐标，绘制致
死曲线。致死率（%）=（对照 1 mL 菌液中活菌数-
处理后 1 mL 菌液中活菌数）/ 对照 1 mL 菌液中活菌
数 ×100%。
1.2.7 高产突变株的筛选 将最佳处理原生质体稀
释涂布于原生质体再生培养基上，72 h 后用无菌牙
签将菌落转接在筛选培养基平板上。2 d 后培养基为
绿色，菌株的代谢产物乳酸会使菌落周围 pH 降低，
形成黄色显色圈，挑取显色圈较大的 90 株菌株进行
摇瓶发酵，每个菌株接 1 瓶，37℃培养，72 h 后测
其乳酸产量。得到乳酸产量较高的菌株再次进行发
酵复筛，每株 3 瓶，37℃培养，72 h 后测其乳酸产量。
1.2.8 高产突变株遗传稳定性试验 对筛选获得的
高活性的突变株进行继代培养，连续继代 8 次，每
代 5 个平行，测其乳酸产量，分析其稳定性。
1.2.9 乳酸的液相色谱法检测
1.2.9.1 采用液相色谱［20］测定发酵液中乳酸的含
量 色谱条件 ：色谱仪为安捷伦 1100［含在线脱气
机，可变波长检测器（VWD），agilent 1100 四元泵］，
色谱柱为 EDipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm 1.d. 5
μm），流动相为 0.005 mol/L H2SO4 溶液，pH2.5（用
NaOH 调节），流速 1.0 mL/min，检测波长 210 nm，
进样量 20 μm，柱温为室温。
1.2.9.2 流动相配制 0.27 mL 分析纯浓硫酸用水稀
释并定容至 1 000 mL（0.005 mol/L），用 NaOH 溶液
调节 pH 值至 2.5，然后用 0.45 μm 孔径的合成纤维
素酯膜过滤。
1.2.9.3 对照品制备及标准曲线绘制 精密称取乳
酸 1 g 标准品放入 10 mL 容量瓶中，用超纯水溶解
并定容至 10 mL，配成乳酸标准液，然后进行稀释，
分别配成 0.5、1、2、4 和 5 g/L 的标准溶液。用 0.45
μm 孔径的合成纤维素酯膜过滤。再分别经液相色谱
检测，以浓度为横坐标，峰高值为纵坐标，绘制出
的标准曲线如图 1 所示。
y = 145.69x + 8.715
R2 = 0.9999
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6ң䞨⎃ᓖg/Lጠ儈mAU
图 1 乳酸标准曲线
1.2.9.4 样品的制备 取 5 mL 发酵液（5 000 r/min，
10 min）除去碳酸钙，加 5 mL 0.01 mol/L 的硫酸溶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期182
液进行酸解 10 min，离心除去硫酸钙，以 0.45 μm
的滤膜过滤，取 1 mL 滤液适量稀释即得待测液。
2 结果
2.1 戊糖乳杆菌ATCC 8041最佳发酵培养基确定
发酵培养基中的 7 个因素的单因素试验结果
为 葡 萄 糖 90 g/L、 蛋 白 胨 10 g/L、 酵 母 粉 5 g/L、
Na2HPO4·12H2O 5 g/L、MgSO4 0.2 g/L、MnSO4·H2O
50 mg/L、CaCO3 30 g/L 时 对 戊 糖 乳 杆 菌 ATCC8041
发酵产乳酸的影响较大。在此基础上，选取这 7 个
对乳酸产量影响较明显的因素进行 Plackett-Burman
设计试验（表 1），得到了 2 个对乳酸产量影响显著
的因素 ：葡萄糖质量浓度和酵母粉质量浓度，结果
见图 2。在此基础上对葡萄糖、酵母浸粉以及第三
影响因子 CaCO3 做响应面试验（表 2），得到了预测
乳酸产量的模型 ：
Y=54.00+1.62X1+0.33X2-0.020X3-0.075X1X2-
0.020X1X3+0.020X2X3-2.58X1
2-0.79X2
2-0.22X3
2
其中 X1 为葡萄糖质量浓度，X2 为酵母浸粉质
量浓度，X3 为 CaCO3 质量浓度。
对该模型进行方差分析和显著性检验（表 3）
得出，葡萄糖质量浓度、酵母浸粉质量浓度两个因
素对乳酸产量影响均达到显著水平。各因素影响乳
酸产量的大小顺序为 ：葡萄糖＞酵母浸粉 >CaCO3。
二次回归模型的 R2 为 0.9997，方程 P 值 <0.05，失
拟检验 P 值为 0.2500>0.05，失拟不显著，试验结果
可靠。因此模型选择正确，可用于预测乳酸产量。
Design-Expert 软件预测和验证试验表明，发酵
培养基的最佳组合为 ：葡萄糖 93.11 g/L、酵母浸
粉 5.19 g/L、 碳 酸 钙 29.43 g/L、 蛋 白 胨 10.00 g/L、
Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO4 0.20 g/L、MnSO4
50 mg/L。
2.2 戊糖乳杆菌ATCC 8041最佳发酵条件的确定
在发酵培养基优化的基础上，对发酵条件做单
因素试验，结果（图 3-图7）显示，得到较佳发酵
条件为 ：温度 37℃、初始 pH6.5、接种量 6%、装液
量 80%。在培养基与发酵条件优化的基础上，得到
出发菌株发酵葡萄糖产乳酸产量为 54.11 g/L。
2.3 戊糖乳杆菌ATCC 8041最佳诱变剂量的确定
戊糖乳杆菌 ATCC 8041 最佳紫外诱变剂量的
确定结果（图 7）显示，随着紫外照射时间的增加，
菌体的致死率有逐渐增加的趋势。当照射时间为 40
表 1 Plackett-Burman 试验设计与结果
Run A B C D E F G Y（g/L）
1 75 5 2.5 2.5 0.1 0.025 20 49.16±0.13
2 75 5 3.125 3.125 0.125 0.025 25 51.48±0.11
3 75 6.25 3.125 2.5 0.125 0.025 20 51.63±0.12
4 93.75 6.25 3.125 2.5 0.125 0.03125 20 53.45±0.09
5 75 6.25 3.125 3.125 0.1 0.03125 25 51.46±0.15
6 93.75 6.25 2.5 3.125 0.125 0.025 25 52.95±0.11
7 93.75 5 2.5 2.5 0.125 0.03125 25 53.89±0.14
8 93.75 5 3.125 3.125 0.1 0.03125 20 53.72±0.13
9 75 6.25 2.5 2.5 0.1 0.03125 25 50.23±0.19
10 93.75 5 3.125 2.5 0.1 0.025 25 54.64±0.12
11 93.75 5 2.5 3.125 0.125 0.03125 20 49.92±0.05
12 75 6.25 2.5 3.125 0.1 0.025 20 52.16±0.08㳻ⲭ㜘⺛䞨䭠⼧䞨≒Ҽ䫐⺛䞨䭱⻣䞨䫉䞥⇽⎨㊹㪑㨴㌆
1086420 ḷ߶ॆ᭸ᓄ2.78 ૽ᓄѪYˈα=.05
图 2 七个因素的效应 Pareto 图分析
表 2 响应面试验设计及结果
RUN X1（g/L） X2（g/L） X3（g/L） Y（g/L）
1 90 6 20 53.32
2 80 6 30 49.38
3 90 4 20 52.46
4 80 5 40 49.57
5 100 6 30 52.49
6 90 6 40 53.37
7 100 5 20 52.87
8 90 5 30 53.96
9 100 4 30 52.03
10 100 5 40 52.74
11 90 4 40 52.61
12 80 5 20 49.62
13 90 5 30 54.01
14 90 5 30 54.03
15 80 4 30 48.62
2014年第11期 183王义强等：戊糖乳杆菌发酵产乳酸及高产菌株诱变选育
s 时，菌体的致死率为 85.54%，而 60 s 时紫外照射
的致死率为 97.84%。研究表明，当致死率为 80%-
90% 之间时，菌体的诱变效果和生存能力的比例最
好，从而确定在功率 20 W 的紫外灯，距离 35 cm 照
射条件下，最佳诱变剂量为 40 s。
2.4 高产乳酸突变株的选育
出发菌株经紫外诱变后经筛选培养基初筛，观
察筛选平板，正常产酸菌落会产生黄色显色圈（图
表 3 方差分析及显著性检验
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著程度
模型 47.69 9 5.30 1778.02 ＜ 0.0001 * *
X1 20.93 1 20.93 7023.64 ＜ 0.0001 *
X2 0.88 1 0.88 296.80 ＜ 0.0001 *
X3 3200E-003 1 3200E-003 1.07 0.3476
X1X2 0.023 1 0.023 7.55 0.0404 *
X1X3 1.600E-003 1 1.600E-003 0.54 0.4966
X2X3 1.600E-003 1 1.600E-003 0.54 0.4966
X1
2 24.53 1 24.53 8231.50 <0.0001 * *
X2
2 2.32 1 2.32 778.18 <0.0001 * *
X3
2 0.18 1 0.18 61.34 0.0005 *
残差 0.015 5 2.980E-003
失拟性 0.012 3 4.100E-003 3.15 0.2500
纯误差 2.600E-003 2 1.300E-003
总和 47.70 14
** ：极显著 ；* ：显著
0
10
20
30
40
50
60
30 32 34 36 38 40 42 44⑙ᓖćң䞨ӗ䟿g/L
图 3 温度对乳酸产量的影响
0
10
20
30
40
50
60
4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8
pH٬ң䞨ӗ䟿g/L
图 4 初始 pH 对乳酸产量的影响
48
49
50
51
52
53
54
0 2 4 6 8 10 12᧕⿽䟿%ң䞨ӗ䟿g/L
图 5 接种量对乳酸产量的影响
47
48
49
50
51
52
53
54
50 60 70 80 90 100 110㻵⏢䟿%ң䞨ӗ䟿g/L
图 6 装液量对乳酸产量的影响
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120 140ᰦ䰤s㠤↫⦷%
图 7 Lactobacillus pentosus ATCC 8041 紫外致死率曲线
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期184
8-B），挑取黄色较深的 90 株菌落进行复筛，结果（表
4）显示，紫外诱变后正突变为 32.22%，负突变为
28.89%，38.89% 的菌株没有明显差异。在正突变菌
株中，平均产量提高幅度为 7.4%，最大产量提高率
达到 18.84%。进一步对正突变菌株进行摇瓶发酵测
乳酸产量进行再复筛，结果（表 5）显示，经过再
次复筛，突变株 Lactic UVC-02 和 Lactic UVD-05 产
量较对照高 15% 以上。故对突变株 Lactic UVC-02
和 Lactic UVD-05 进行传代培养，检验其遗传稳定性。
8 次，测定其乳酸产量（每代重复 5 次）如表 6 所
示。进一步对数据进行方差分析，结果见表 6。由
方差分析可以看出，F crit=2.31 是 α=0.05 的 F 统计
量临界值，F=1.58 是 F 统计量的计算值，1.58<2.31，
P=0.177，故数据间无显著差异，说明突变株 Lactic
UVC-02 遗传稳定性好。
表 6 突变株 Lactic UVC-02 遗传稳定性及方差分析
代数 乳酸产量（g/L） 平均值
1 64.17 63.22 64.28 63.39 65.02 64.016
2 64.32 65.02 63.85 63.68 65.03 64.380
3 64.12 64.66 65.32 64.23 64.52 64.570
4 63.55 63.68 63.78 64.27 63.13 63.682
5 64.18 63.52 64.38 65.08 65.46 64.524
6 63.55 65.14 65.56 64.45 64.81 64.702
7 64.61 63.97 64.73 65.32 65.67 64.860
8 64.03 63.55 66.89 65.38 64.86 64.942
差异源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 F crit
组间 6.380 7 0.911 1.58 0.177 2.31
组内 18.467 32 0.577
总计 24.8466 39
将突变株 Lactic UVD-05 进行传代培养，传代 8
次，其乳酸产量如表 7 所示（每代重复 5 次）。对数
据进行方差分析，见表 7。由方差分析可以看出，F
crit=2.31，是 α=0.05 的 F 统计量临界值，F=4.64 是
F 统计量的计算值，4.64>2.31，P=0.001，数据间差
异显著，说明突变株 Lactic UVD-05 的遗传稳定性差。
表 7 突变株 Lactic UVD-05 遗传稳定性及方差分析
代数 乳酸产量（g/L） 平均值
1 64.32 63.84 63.72 64.57 63.92 64.074
2 64.19 65.37 62.85 63.78 66.02 64.442
3 62.34 64.55 63.35 64.23 65.22 63.938
4 63.55 64.68 64.78 66.27 65.13 64.882
5 64.18 64.52 65.38 66.08 63.46 64.724
6 64.55 65.14 63.56 65.45 62.81 64.302
7 61.61 62.97 63.13 62.31 62.67 62.538
8 63.03 61.55 61.89 63.38 62.86 62.542
差异源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 F crit
组间 29.111 7 4.159 4.64 0.001 2.31
组内 28.695 32 0.897
总计 57.806 39
通过对突变株 Lactic UVC-02 和 Lactic UVD-05
的遗传稳定性比较表明，Lactic UVC-02 的稳定性
A ：出发菌株 ATCC 8041 ；B ：突变株筛选 ；C ：突变株 LacticUVC-02
图 8 出发菌株和突变株菌落形态
A B
C
表 4 出发菌株紫外诱变结果
突变情况 总数 无明显差异 负突变 正突变
菌落数 90 35 26 29
突变率（%） 100 38.89 28.89 32.22
表 5 突变株发酵复筛结果
菌株编号 乳酸产量（g/L） 提高率（%）
出发菌株 54.12±0.15 -
Lactic UVA-14 61.86±0.05 14.30
Lactic UVB-02 61.75±0.08 14.09
Lactic UVB-11 62.41±0.11 15.32
Lactic UVC-02 64.17±0.14 18.57
Lactic UVC-04 62.92±0.19 16.26
Lactic UVC-13 63.01±0.09 16.43
Lactic UVD-05 64.32±0.25 18.84
Lactic UVD-09 62.13±0.12 14.80
2.5 突变菌株的遗传稳定性
将突变株 Lactic UVC-02 进行传代培养，传代
2014年第11期 185王义强等：戊糖乳杆菌发酵产乳酸及高产菌株诱变选育
优 于 Lactic UVD-05， 故 确 定 突 变 株 Lactic UVC-02
为一株高产乳酸突变株，命名为戊糖乳杆菌 Lactic
UVC-02，由中国典型培养物保藏中心保存，注册号
为 CCTCC M 2013209。该突变株 Lactic UVC-02 经葡
萄糖发酵后，乳酸产量达到 64.17 g/L，比出发菌株
（54.12 g/L）提高 18.6%，为进一步利用木质纤维发
酵产乳酸提供了研究基础。
3 讨论
在发酵工业中，发酵培养基的优化对发酵水
平的提高有着重大作用，而合理的试验设计及统计
方法的选择在探索最佳发酵培养基的过程中尤为重
要［19］。Plackett-Burman（P-B） 法 是 一 种 以 不 完 全
平衡块为原理的试验设计，它能够从众多的过程变
量中快速、有效地筛选出最为重要的几个因素，为
进一步研究提供基础。响应面分析法是 1951 年 Box
Wilson 开发的用于研究多因子系统中因子交互作用
达到最大响应值时所对应的最佳条件，结合数学方
法和统计分析，通过对重要因子响应过程变量进行
数学建模分析，定向优化响应因子［21］。国内外很
多学者通过 P-B 设计和响应面分析法在乳酸发酵培
养基优化方面取得了很好的成就［22-27］。本研究通
过 P-B 设计快速有效地从 7 个影响乳酸产量的发酵
培养基组分中筛选出 3 个显著性影响组分 ：葡萄糖、
酵母浸粉和碳酸钙，然后利用响应面分析法中 Box-
Behnken 设计得出最佳培养基组合：葡萄糖 93.11 g/L、
酵母浸粉 5.19 g/L、碳酸钙 29.43 g/L、蛋白胨 10 g/L、
Na2HPO4·12H2O 5 g/L、MgSO4 0.2 g/L、MnSO4 50
mg/L。在最佳培养基组合下，乳酸产量达到 54.11 g/L，
与预测值拟合较好。说明运用响应面法优化戊糖乳
杆菌 ATCC8041 发酵产乳酸是合理可靠的。
微生物诱变育种是指利用各种诱变剂处理微生
物细胞，以提高其基因突变频率，再通过适当的筛
选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法，诱变
育种的速度快、成本低、耗时短、方法简便，是一
种高效的菌株选育方法。其中的紫外线辐射方法更
具有操作简便，经济实惠，对实验室条件要求低，
且出现正突变的几率较高，诱变的效果好，是一种
非常实用的诱变剂［28］。在微生物发酵产乳酸方面，
利用紫外诱变筛选优良菌株也取得了良好的效果。
仲松等［29］以干酪乳杆菌 ZZ-L 为出发菌株，对其原
生质体进行紫外诱变，筛选得到一株比原始菌株乳
酸产量高 20.7% 的高产突变菌株 ZZ-06。吴慧昊等［30］
使用紫外照射和亚硝基胍复合诱变的方法选育出一
株在低温下生长良好、遗传性状稳定的菌株 Q1-4-6。
Yin 等［31］采用紫外和亚硝基胍复合诱变的方法得到
突变株 Rhizopus oryzae LA-UN-1，乳酸产量达到 59.5
g/L，比原始菌株提高 54.5%。本研究以能同时利用
六碳糖和五碳糖的戊糖乳杆菌 ATCC 8041 为出发菌，
制备了原生质体，并对其原生质体悬液进行紫外诱
变，期望获得能利用木质纤维水解液发酵产乳酸的
高产突变株。突变体经过初筛、复筛等一系列过程
筛选出乳酸产量较高的 2 个菌株 ：Lactic UVC-02 与
Lactic UVD-05，对其进行了 8 代继代培养检测其遗
传稳定性，其中突变株 Lactic UVC-02 遗传稳定性较
好，各代之间无显著差异。突变株菌落形态与原始
菌株也出现一定程度的差异，引起这种差异的原因
还需进一步在分子水平进行分析研究。由于木质纤
维原材料处理过程复杂且周期较长，目前我们已初
步得出突变株 Lactic UVC-02 能利用杨木水解液发酵
产乳酸，但暂时还未能完全验证该突变株是否能高
效利用木质纤维水解液发酵产乳酸，这也是我们下
一步工作的研究重点。
4 结论
戊糖乳杆菌 ATCC 8041 发酵产乳酸的最佳发酵
培养基和发酵条件组合为 ：葡萄糖 93.11 g/L、酵母
浸粉 5.19 g/L、碳酸钙 29.43 g/L、蛋白胨 10.00 g/L、
Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO4 0.20 g/L、MnSO4 50
mg/L ；最佳发酵条件为温度 37℃、pH6.5、接种量
6%、装液量 80%。进一步对戊糖乳杆菌 ATCC8041
进行原生质体诱变得到高产突变株 Lactic UVC-02，
保存在中国典型培养物保藏中心（注册号 ：CCTCC
M 2013209），其乳酸产量达到 64.17 g/L，比原始菌
株产量提高了 18.6%。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）