全 文 ：·综述与专论· 2014年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
异源表达系统目前已成为分子生物学实验室的
基础研究工具，对蛋白质功能研究具有深远影响。
大肠杆菌表达系统是蛋白表达技术中发展最早、应
用最广泛的，现已成功开发了许多表达质粒和相应
的宿主菌。目前，蛋白质数据库中（http ：//www.
rcsb.org/）收录的蛋白大多数是由大肠杆菌表达系统
表达的。随着复合体结构和功能研究趋势的日益增
加，原核表达系统在大分子量蛋白亚基的表达、翻
译后修饰，以及多个蛋白亚基同时表达等方面存在
缺陷。因此，有必要利用功能更强大的真核表达系
统来表达蛋白质复合体，该系统能够满足结构研究
收稿日期 ：2013-8-18
基金项目 ：浙江省重大科技专项（2011C13027-1）
作者简介 ：万婧，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物与食品安全 ；E-mail ：wanjing9687@126.com
通讯作者 ：周向阳，男，高级工程师，研究方向 ：微生物与食品安全 ；E-mail ：zxy@zs.ziq.gov.cn
杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达
应用中的研究进展
万婧1  相兴伟2  江玲丽1  周向阳1
（1. 舟山出入境检验检疫局，舟山 316000 ；2. 浙江省海洋开发研究院，舟山 316000）
摘 要 ： 真核细胞大部分生命活动是通过复合体催化的。因此，系统了解这些复合体的生物学功能，将在健康和疾病方面
具有重要意义。由于内源性复合体存在低丰度和异质性特点，因而直接提取复合体存在一定的困难。杆状病毒-昆虫细胞表达系统
可成功表达复合体，为研究复合体的结构和功能提供新的手段。综述近年来利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行蛋白质复合体结
构和功能研究的进展。
关键词 ： 杆状病毒-昆虫细胞表达系统 复合体 晶体结构 功能
Advances on the Baculovirus Expression Vector System for Protein
Complex Production
Wan Jing1 Xiang Xingwei2 Jiang Lingli1 Zhou Xiangyang1
（1. Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan 316000 ；2. Zhejiang Marine Development Research Institute，
Zhoushan 316000）
Abstract:  Most essential functions of eukaryotic cells are catalyzed by complex built of many subunits. To well understand their biological
function in the process of health and disease, it is imperative to study these complexes. The low abundance and heterogeneity of many essential
complexes have limited their extraction from native source material. The baculovirus expression vector system（BEVS）, specifically tailored for
multiprotein complex production, has been proven itself to be uniquely suited for overcoming this impeding bottleneck. Here we highlight recent
major achievements in multiprotein complex structure research which were catalyzed by this versatile recombinant complex expression tool.
Key words:  Baculovirus expression vector system Complex Crystal structure Function
所需数量和质量的复合体。
杆状病毒-昆虫细胞表达系统是将外源目的基
因插入杆状病毒载体中，转染入昆虫细胞中对单个
蛋白或者蛋白复合体进行高量表达的真核表达系统。
该系统自问世以来应用广泛，在过去几年中成为了
结构生物学研究的主流。进行复合体结构生物学研
究需要考虑样品的制备、实验条件的优化、蛋白复
合体表达的成本以及所需的时间等。目前通过改造
杆状病毒基因组提高蛋白质复合体的表达、开发多
基因组装的新质粒、建立细胞培养、病毒传代、病
毒感染和重组蛋白生产的标准操作程序，使杆状病
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期8
毒-昆虫细胞表达系统成为结构生物学研究中易于使
用的常规操作工具［1］。MultiBac 是一种杆状病毒表
达系统，是在 Bac-to-Bac 的基础上通过改造转移载
体和 Bacmid，实现真核多蛋白复合体或者单个基因
多拷贝在昆虫细胞中表达的有力工具，由 2 个供体
载体 pFBDM 和 pUCDM 和改造过的受体 Bacmid 组
成。目前，已利用 MultiBac 杆状病毒-昆虫细胞表达
系统成功表达多种蛋白质复合体并进行相关结构和
功能研究。如酿酒酵母转录中介复合体的头部模块、
酵母细胞分裂后期启动复合体 APC/C 和人转录因子
TFIID 核心支架复合体等。本文将从这几种复合体
阐述杆状病毒-昆虫细胞表达系统在结构生物学研究
领域中的应用。
1 酿酒酵母转录中介复合体的头部模块
转录中介复合体是由多个在进化过程中高度保
守的亚基组成的蛋白复合体。在基因转录过程中，
转录中介复合体分别与基因特异的转录因子和 RNA
聚合酶 II 相互作用，是真核生物基因转录的中央控
制器［2-4］。于酿酒酵母中首次发现转录中介复合体，
其由 21 个亚基构成，分子量超过 1 MD［5，6］。研究
证明，转录中介复合体个别亚基的突变，可导致神
经系统疾病和癌症［7-14］。因此，阐明转录中介复合
体的功能是一个重大的生物医学科学研究课题。但
由于转录中介复合体的大分子量、高复杂性和低丰
度的特点阻碍了其生物化学和结构的研究。
单粒子电子显微镜首次呈现了转录中介复合体
的结构，与 RNA 聚合酶 II 的结构不同，其是紧凑型
的球状结构。酵母中的转录中介复合体由头部、中
部和尾部 3 个模块构成［15，16］。结构学、遗传学和生
物化学研究证明每个模块由 7-9 个单独的亚基构成
（图 1-a）。转录中介复合体参与细胞内的多种细胞活
动，每个模块执行各自相应的功能［17］。例如，头部
模块的亚基与 RNA 聚合酶 C 端区域相互作用［18，19］，
而中部和尾部模块的亚基直接与转录调控因子发生
相互作用［4，20-23］。因此，可通过分别研究各个模块
的功能，以期进一步阐明整个复合体的结构和功能，
这种策略明显降低了研究整个转录中介复合体结构
和功能的复杂性。
1.1 在昆虫细胞中生产转录中介复合体的头部模
块
转录中介复合体的头部模块由 7 个亚基构成，
分别为 Med17、Med6 和 Med8，Med11、Med22、Me-
d18 和 Med20，分子量为 223 kD。起初采用杆状病
毒共同感染的方法，即将 7 种不同的重组病毒（每
种编码一种亚基）共同感染昆虫细胞［24］。然而，这
种方法的试验流程和操作步骤是极其漫长的，而且
使得 7 种重组病毒的滴度保持平行是非常困难的。
此外，进行 X-射线晶体学研究，需要在尽可能短的
时间内生产大量的复合体。因此，利用 MultiBac 杆
状病毒-昆虫细胞表达系统，在同一个杆状病毒中同
时表达转录中介复合体头部模块的亚基将会从根本
上解决上述问题。MultiBac 杆状病毒-昆虫细胞表达
系统通过串联重组技术极大方便了多个基因盒的快
速串联重组拼装［1］。通过串联重组将编码转录中介
复合体头部模块亚基的所有基因组合到单个杆状病
毒结构中（图 1-b）［25，26］，显著降低了试验的复杂
性。将多基因结构整合到 MultiBac 杆状病毒的基因
组中，能有效的减少蛋白质的水解并延长宿主细胞
的裂解，有助于提高重组蛋白复合体的质量［1］。最
后将重组病毒感染昆虫细胞，在细胞中表达转录中
介复合体的头部模块（图 1-b）。
1.2 重组转录中介复合体头部模块的结构
重组复合体生产的简化推动了头部模块晶体结
构的测定，消除 MED17 和 MED18 的柔韧区可获得
良好有序的单晶结构，这有利于衍射数据的收集（图
1-c）。此外，在重组产生的蛋白样品中加入硒基-L-
甲硫氨酸有助于结构的测定。转录中介复合体头部
模块晶体结构的测定，揭示了这一具有组件结合稳
定性以及转录调节灵活性的重要复合体是如何组建
的，为其他转录因子结构的测定提供了一个平台［26］。
值得注意的是，头部模块中的 5 个亚基同时存在于
一个紧凑的结构单元，将其命名为颈部区域。该区
域通过形成一个新的多螺旋束，使得转录中介复合
体具有稳定性和完整性（图 1-c）。
2 后期促进复合体（APC/C）
APC/C 是遍在蛋白连接酶复合体，由多个亚基
2014年第2期 9万婧等 ：杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展
构成，通过蛋白酶体依赖式水解细胞周期调节蛋白，
调节细胞周期进程［27-29］。APC/C 至少由 13 种不同
的蛋白亚基构成，APC 激发 E2-遍在蛋白复合体同
有丝分裂周期蛋白破坏框结合，然后激发遍在蛋白
Med7
Med8
Med17Med18
Med20 Med22
Med11
Med6
Med1
Med14
Med4
Med19
Med21
Med31
Med10
Med9
Med2
Med3
Med5
Med15
Med16
Med7
Med8
Med17Med18
Med20
Med17
Progenitor constructs
Mediatora
b
c
Tail
Middle
Head
Single multigene construct
Med11
Med22
Med18
Med20
Med20 Med18
Med22
Med17
Med11 Med17 Med22
Med20 Med18
Med17
Tn7L
Tn7L Tn7R
Tn7R
MultiBac
Tn7 transposition
lacZ
Med18
Med20
Med11
Med22 Med11 Med17 Med22 Med8 Med6 Med20 Med18
Neck
Fixed jaw
Movable jaw Med22
Med11
Med8
Med17Med6
Med6
Med8
Med8 Med6
Med11
Med8 Med6
Med8
Med6
Med22
Med11
Med6
Med1
Med14
Med4
Med19
Med21
Med31
Med10
Med9
Med2
Med3
Med5
Med15
Med16
（a）转录中介复合体的亚基组成。头部模块的亚基用蓝色表示，中部模块的亚基用绿色表示，而尾部模块的亚基用赭色表示 ；（b）编码头
部模块的基因组合到单个多基因表达结构中，通过 Tn7 介导的转座，将基因插入杆状病毒基因组中，转染昆虫细胞，获得重组表达的转录
中介复合体；（c）重组转录中介复合体头部模块的 X-射线晶体结构，Med17（蓝色），Med11（紫色），Med22（绿色），Med6（黄色），Med8（红
色），Med18（蓝绿色），Med20（橙色）。头部模块包括 3 个不同的区域：固定爪、活动爪和颈部区域，其中颈部区域形成一个新的多螺旋束［26］
（颜色标识见电子版）
图 1 酿酒酵母转录中介复合体
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期10
同破坏框 C 末端的赖氨酸残基结合，此过程不断循
环使遍在蛋白多聚化。真核生物中 APC/C 是高度保
守的，由于某些蛋白亚基具有两个拷贝。因此，整
个 APC/C 由 18-19 个亚基组成，分子量范围在 1-1.2
MD 之间［30］。
2.1 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统生产重组
APC/C
APC/C 大部分亚基分子量较大，遗传操作性难
度高，内源性丰度低，这些因素限制了 APC/C 的结
构和生化研究。近年来发展的基于 MultiBac 杆状病
毒-昆虫细胞表达系统，可以重组产生酿酒酵母以及
人的 APC/C，这极大地推动了 APC/C 的结构学、生
化学和生理学的发展［30，31］。利用 MultiBac 杆状病毒-
昆虫细胞表达系统重组表达了酿酒酵母的 APC/C，
即通过构建两种分别编码 5 个亚基和 8 个亚基的重
组病毒进行共表达。利用重组共表达系统生产的
完整 APC/C 的产量是内源性的 200 多倍，达到 0.5
mg/L。通过结构生物学比较分析酿酒酵母的内源性
和重组 APC/C，发现重组表达的复合体是正确组装
的（图 2-a 和图 2-b）。而且在激活剂存在的条件下，
以一种 D box 和 KEN box 依赖的方式实现有丝分裂
细胞周期蛋白的泛素化［30］。利用重组的 APC/C 能
够重塑内源性 APC/C 的催化和调节功能，而且明确
了酿酒酵母 APC/C 的分子组成，对全面系统的了解
APC/C 具有重要意义。
2.2 解析重组酵母的APC/C
重组表达整个和部分 APC/C，得以精确测定
APC/C 的质量。质朴分析含有 8 个亚基的 APC/C 部
分复体，测定的分子量为 698.8 kD，与所有亚基的
化学计量法所得的结果是一致的［30］。根据 APC/C 的
结构图重组产生了 APC/C 的部分复体，明确了三维
APC/C 中每个亚基的分子边界。例如，Cdc16-Cdc26
的差异密度密切对应 Cdc16-Cdc26 异源四聚体的晶
体结构，通过差异密度可比较两个 APC/C 部分复合
体的差异（图 2-c）。通过亚基删除策略，可以系统
的调配 APC/C 的大部分亚基。通过整合 APC/C 单个
亚基同源模型的晶体结构，利用冷冻电子显微镜在
10 Å 的分辨率下重塑 APC/C Cdh1.D-box 三元复合体［32］，
解析了高分辨率的 APC/C 亚基组成和原子模型［30， 32］
（图 2-d）。亚基删除策略可精确界定 APC/C 亚基的
分子边界，相较于 N 端和 C 端标记粗略定位亚基的
方法，该策略使得亚基原子模型的对接更准确可靠。
2.3 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达人的整
个APC/C
近期，两个研究团队利用昆虫 / 杆状病毒表达
系统表达和重构人的 APC/C［31，33］。其中一个研究
团队利用 MultiBac 的 pFBDM 和 pUCDM 载体构建了
多基因表达载体［34］，并利用 USER 连接依赖式的克
隆方法［35，36］将所有的 14 个基因插入两个重组病
毒［31］。而另一个研究团队构建了 14 种重组病毒，
每种重组病毒表达单个 APC/C 亚基，然后将所有的
重组病毒共同感染昆虫细胞进行生化研究［33］。通过
此种方法，明确 Apc15 和 Apc16 也为人 APC/C 的组
分。在鉴定 Apc16 之前，尝试构建完整组装的人重
组 APC/C 无法获得成功［31］。这表明 Apc16 定位于
TPR 部分复合体中［37］，是人 APC/C 精确组装所必
需的。因此，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统可重
构正确组装的人 APC/C，表明 APC/C 发挥功能所必
需的所有亚基都得到了鉴定（图 2-e 和图 2-f）。
2.4 有丝分裂期检验点复合体（MCC）的X-射线
结构
染色体分离的过程由一种被称为纺锤体检验
点 的 系 统 控 制， 通 过 MCC 抑 制 APC/C， 以 确 保
子 细 胞 获 得 正 确 数 目 的 染 色 体［38］。MCC 组 分 包
括 ：APC/C 共激活剂 Cdc20 以及检验点蛋白 Mad2、
Mad3（BubR1）、Bub3 和 激 酶 Bub1，Mph1（Mps1）
和 Aurora B。利用 MultiBac 杆状病毒-昆虫细胞表达
系统表达酿酒酵母 MCC，其晶体结构表明 Cdc20，
Mad2 和 Mad3 组装成为三角形的异源三聚体（图
2-g）［39］。Mad3 通过与 Mad2 和 Cdc20 形成许多亚基
内的相互作用协调整个复合体，其 N 端区域的螺旋-
环-螺旋模体可同时结合 Mad2 和 Cdc20。
3 人通用转录因子 TFIID
RNA 聚合酶 II（Pol II）启动转录需步进式组装
的前起始复合体，该复合体由 Pol II、TBP 及通用转
录因子 TFIIA、B、D、E、F 和 H 构成［41-43］。其中
TFIID 是启动子识别复合体，是前体复合体组装的基
石，作为共激活剂介导信号的传递。人的 TFIID 由
2014年第2期 11万婧等 ：杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展
14 个蛋白亚基构成，由 TATA-box 结合蛋白（TATA-
box binding protein，TBP） 和 TBP 协 同 因 子（TBP-
associated factors）在体内装配为复合体，分子量约
为 1.6 MD。TFIID 可识别和结合核心启动子，指导
其他通用转录因子参与组装［43］。
目前，对 TFIID 的精细分子模型、在细胞中的
组装，与染色质和其他因子互作的机制还了解甚少。
研究 TFIID 在转录中的作用，有助于进一步理解基
因表达调控。利用透射电镜解析人类和酵母 TFIID
的整体形状，都为类似于分子钳的非对称三裂结
构［43］。细胞中内源性 TFIID 的水平非常低且复合体
分子量大，阻碍了研究人员在分子细节上破译其结
构和功能。
目 前， 关 于 TFIID 内 亚 基 拷 贝 数 的 共 识 是 ：
TAFs 的 子 集（TAF4、TAF5、TAF6、TAF9 和
TAF12）含有两个拷贝，而 TBP 和剩余的 TAFs 含
有一个拷贝［41］。由于人类和酵母 TFIID 复合体的进
化保守性以及形状的整体相似性，推测所有物种的
该复合体的亚基组成是类似的。研究人员利用 RNAi
技术敲除体外培养的果蝇组织的 TFIID 特异亚结
构［44］， 发 现 TAF4，TAF5，TAF6，TAF9 和 TAF12
组成一个稳定的 TFIID 核心支架复合体，对维持复
合体稳定性起到关键性作用。TFIID 核心支架复合
体存在两个对称的拷贝，而剩余的 TAFs 和 TBP 作
为外围亚基，这暗示了 TFIID 在组装过程中可能发
生了一个对称到非对称的过渡。此外，利用冷冻电
子显微镜研究酵母的 TFIID，也观察到相对较小的
对称结构［45］。这些结果表明，对称 TFIID 核心支架
复合体的存在对整个复合体的完整性和组装是至关
重要的。最近，研究人员通过单颗粒冷冻电子显微
镜，发现 TFIID 转录因子有两种不同的结构状态并
存（标准态和重排态）。这一结构转换能够起始转录，
将 DNA 的遗传学信息转录到 RNA 中以便进行蛋白
合成，展示了转录因子组合调控基因表达水平从而
增加多样性的机制［46］。
利 用 MultiBac 杆 状 病毒-昆 虫 细 胞 表 达 系 统、
冷冻电子显微镜、X-射线晶体学和同源模型分析方
法，解析人类 TFIID 核心支架复合体由 10 个亚基组
成，分别为两个拷贝的 TAF4、5、6、9 和 12［48］（图 3）。
起初，通过单个杆状病毒构建多基因表达盒，表达
TFIID 核心支架复合体［34］，与酿酒酵母转录中介复
合体头部模块的研究方法是相似的［26］。然而，单个
亚基的表达水平差异很大，导致整个重组复合体的
产量明显降低。相对于含有所有亚基的正常组装的
Cdc27
Cdc26
Cdc16
Cdh1
Cdc16
Cdc23
Mad3
Mad2
D box
mimic
100 Å
KEN motif
Cdc20
β-hairpin
Apc10
Apc11 N
Apc2
PlatformApc1, 4, 5
e f g
a b c d
（a）酿酒酵母重组 APC/C 的三维结构；（b）酿酒酵母内源性 APC/C 的三维结构；（c）Cdc16 二聚体的定位；
（d）酿酒酵母 APC/C 的原子结构［30］；（e）人内源性 APC/C 的三维结构［40］；（f）人重组 APC/C 的三维
结构［31］；（g）酵母 MCC 的结构［39］
图 2 APC/C 和 MCC 的结构
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期12
复合体的表达水平，单个亚基的表达水平是很高的。
利用亲和标签标记低表达量的亚基，可提高 TFIID
核心支架复合体的产量。然而，电子显微镜分析发
现小标签的存在干扰复合体的结构。
解决这一瓶颈的方法来自于研究如冠状病毒等
某些病毒时所采用的策略。当病毒复制时，可以表
达长的开放式阅读框而形成多聚蛋白，这些多聚蛋
白经过高度特异性蛋白酶的加工成为单个功能性多
肽。MultiBac 杆状病毒-昆虫细胞表达系统就应用这
一策略，将编码烟草蚀纹病毒 NIa 蛋白酶的基因以
及相应的识别和切割序列插入到长的开放式阅读框
的 5 端［1，49］。为了便于观察和定量多聚蛋白的表
达，在 ORF 的 3 端插入编码绿色荧光蛋白的基因
（图 3-a）。结果表明烟草蚀纹病毒 NIa 蛋白酶可有效、
特异地加工多聚蛋白，而且通过绿色荧光的强度可
以定量多聚蛋白的表达水平。通过这一策略获得了
极其丰富的、正确装配的 TFIID 核心支架复合体（包
含 10 个亚基），并利用电子显微镜和 X 射线晶体学
数据进行高分辨率分析（图 3-b 和图 3-c）。TFIID 核
心支架复合体的结构是对称的，而 TAF8 和 TAF10
的结合破坏了 TFIID 核心支架复合体原有的对称结
构，通过吸收剩余的 TAFS 和 TBP，使得整个 TFIID
复合体的结构是非对称的［48］。
4 结语
研究人员首先利用 MultiBac 杆状病毒-昆虫细
胞表达系统成功表达酿酒酵母转录中介复合体的头
部模块，然后利用冷冻电子显微镜和 X-射线晶体学
成功解析酿酒酵母转录中介复合体头部模块的晶体
结构 ：其由 Med17、Med11、Med22、Med6、Med8、
Med18 和 Med20 组成，包括固定爪、活动爪和颈部
3 个区域，其中颈部区域形成一个新的多螺旋束［26］。
按照同样的思路，成功解析细胞分裂后期启动复合
体 APC/C 和人转录因子 TFIID 核心支架复合体的晶
体结构。可见，MultiBac 杆状病毒-昆虫细胞表达系
统已成为复合体结构生物学研究中的强有力工具。
进行蛋白质晶体学研究需要大量高丰度的均一
化样品，才能得到高分辨率的晶体结构信息。电子
显微镜、单粒子分析和质谱分析不需要高丰度蛋白
样品，但对样品的均一化程度要求较高［47］。同样，
蛋白的功能研究和药物应用同样需要高度均一化的
蛋白样品。细胞大部分生命活动通过蛋白质复合体
实现，而对复合体的结构和功能的详尽研究主要依
赖于重组表达。然而，内源性复合体存在低丰度和
异质性特点，因而直接提取复合体存在一定的困难。
利用 MultiBac 杆状病毒-昆虫细胞表达系统可以明确
界定复合体的亚基组成，增加蛋白样品的产量和均
150
100
75
50
37
25
60K x
20
15
MultiBac TALON MonoQ SECS6 GraFIX
SV40polyA
Tn7R
TAF9
TAF5
TAF12
TAF6
TAF4
tcstcstcstcs
GOl1
TEV Nla
polh
Tn7L
a c
b
GOl2 GOl3 GOl4
tcs
TAF5
TAF6
TAF9
TAF12
（a）采用多聚蛋白策略平衡复合体亚基的表达水平。GOI 代表感兴趣的基因，在杆状病毒强启动子（polh）下启动烟草蚀纹病毒 NIa 蛋白酶
基因和绿色荧光蛋白基因的表达［47］；（b）人 TFIID 核心支架复合体多聚蛋白的表达和纯化。利用 SDS-PAGE 和负染色电镜评判蛋白样品的质量；
（c）纳米级分辨率下 TFIID 核心支架复合体的结构［48］。
图 3 TFIID 核心支架复合体
2014年第2期 13万婧等 ：杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展
一化。此外，加工和突变特定的亚基可明确其在复
合体中的功能和精细定位，这对全面了解复合体的
生物学功能至关重要。
利用杆状病毒真核表达系统表达真核生物的复
合体，能够符合结构晶体学研究所需的质量和数量。
近年来，真核表达技术获得了长足发展，为其他关
键复合体结构和功能的研究提供了新的思路，也为
结构晶体学的进一步发展奠定了基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）