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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):207-213
辅酶 Q（CoQ）是一种脂溶性醌类衍生物，呼
吸链上的电子传递体［1］。人体中主要以 CoQ10 的形
式存在［2］，具有抗氧化、保护细胞膜完整、消除心
血管治疗中他汀类药物导致的副作用等良好的生物
学功能［3，4］，已成功地应用于线粒体相关的多种疾
病的治疗、预防保健和化妆品等领域［5-11］。较之合
成或提取法，微生物发酵法制备的 CoQ 生物活性高、
无原材料限制、成本低无污染，成为 CoQ 生产的理
想途径［12，13］。但目前生产菌株缺乏，成为发酵生产
的瓶颈，因此构建 CoQ 高产菌株是实现 CoQ 发酵生
产的必由之路［14］。
目前微生物发酵法选育 CoQ 高产菌株主要通过
诱变育种和代谢工程育种实现。诱变育种包括基因
诱变［15］和抗终产物结构类似物诱变［16］。运用诱变
手段虽然可使菌株发生突变，但目标性不明确，需
要无数次的变异才能达到目的，周期比较长，而且
容易发生回复突变。Red 同源重组技术是代谢工程
育种的一种新兴技术，可将一段抗性片段导入宿主
收稿日期 ： 2015-06-10
基金项目 ：吕梁市科技计划项目（GG201330-2）
作者简介 ：刘永青，男，硕士，研究方向 ：分子微生物 ；E-mail ：liuyongqing07@163.com
大肠杆菌 menA 敲除对 CoQ 积累的影响研究
刘永青1，2  任琳1  张子锋1
（1. 吕梁学院，离石 033000 ；2. 西安交通大学生命科学与技术学院，西安 710049）
摘 要 ： 通过同源重组敲除大肠杆菌的 menA 基因，增加菌体 CoQ 合成量，用于构建 CoQ 高产菌株。以 pKD4 质粒为模板，
PCR 扩增 kanr 片段 ；在 pKD46 的辅助下，kanr 片段转化大肠杆菌，利用抗生素筛选和 PCR 验证重组子 ；以紫外诱变菌为对照，发
酵 menA 基因敲除菌株，分析 CoQ 种类和产量变化。成功获得 menA 基因敲除菌株，CoQ 种类不变，产量增加约为 38%。首次敲除
menA 基因，改良株 CoQ 产量得到提高，达到预期目标。
关键词 ： 大肠杆菌 ；基因敲除 ；menA 基因 ；CoQ ；同源重组
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.030
The Influence of Knockout of menA Gene in Escherichia coli on the
Accumulation of CoQ
Liu Yongqing1，2 Ren Lin1 Zhang Zifeng1
（1. Lüliang University，Lishi 033000 ；2. College of Life Science and Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710049）
Abstract: Knocking out menA gene of Escherichia coli by homologous recombination increases the synthetized amount of CoQ, which is
used for constructing the strains of high-yield CoQ. Using pKD4 plasmid as template, the kanr fragments were amplified by PCR. In the presence
of auxiliary plasmid pKD46, the kanr fragments were transformed into Escherichia coli, and the recombinant one was confirmed by antibiotic
screening and verification of PCR ；By contrast with uv-induced mutation, the strains with menA gene knocked out were fermented, and the types
of CoQ and the changes of CoQ yield were analyzed. The results showed that the strains with menA gene knockout were successfully obtained,
while the types of CoQ unchanged and the yield increased about 38%. In conclusion, this is the first time of knocking out menA gene, CoQ
production of mutant strains is improved, and the desired goal is achieved, which lays a foundation for the further construction of high-yield CoQ
strains.
Key words: Escherichia coli ；gene knockout ；menA genes ；CoQ ；homologous recombination
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12208
菌细胞，利用 λ 噬菌体 Red 重组酶的作用，使导入
细胞的线性 DNA 片段与染色体特定靶序列重组，靶
基因被标记基因置换下来。
本研究基于 Red 同源重组技术，经 L- 阿拉伯
糖诱导表达 λ 噬茵体的 3 个重组蛋白后 , 对 pKD46
介导的大肠杆菌 CoQ 合成旁路途径［17，18］的关键基
因 1，4-二 羟 基 -2- 萘 酸 八 异 戊 烯 基 转 移 酶 基 因
menA［19，20］进行敲除，阻断旁路途径、积累侧链前
体 IPP，搜寻能提高菌株 CoQ 含量的有效途径，为
日后构建 CoQ 高产菌株积累经验。
1 材料与方法
1.1 材料
大 肠 杆 菌 DH5α 由 本 实 验 室 保 存 ；pkD4、
pkD46 由军事医学科学院惠赠 ；10×PCR Buffer，10
mmol/mL dNTP，高保真 Taq 酶（10 U/μL），EB 指示
剂，6×loading buffer，DNA marker 等均购自西安沃
尔森；氨苄青霉素，卡纳霉素，罗红霉素，胰蛋白胨，
琼脂糖，无水氯化钙，Tris，EDTA，酵母膏，琼脂粉，
牛肉膏等均购自交大物资中心 ；快捷型琼脂糖凝胶
DNA 回收试剂盒，PCR 纯化试剂盒，质粒提取试剂盒，
基因组 DNA 提取试剂盒均购自大连宝生物。
1.2 方法
1.2.1 kanr 片段扩增 以 pKD4 质粒作为模板设计
带有 FRT 位点的 kan r 基因引物，扩增 kanr 片段用
于 menA 基因的敲除。上游引物为 GATGGGGCTGA
AAGGCCCCATTTTTATTGGCGCGTATTATGAGGAATT
AGCCATGGTCC，下游引物为 TTGTTAATTGATATTT
GTCAGTTATGCTGCCCACTGGCTTAGTAGGCTGGAGC
TGCTTC。PCR 扩增条件 ：94℃预变性 5 min ；94℃变
性 30 s，58℃退火 40 s，72℃延伸 1 min10 s，35 个
循环 ；72℃延伸 10 min。
1.2.2 menA 基 因 的 敲 除 活 化 大 肠 杆 菌 DH5α，
OD600=0.2-0.4 时 用 CaCl2 法 制 备 感 受 态 细 胞。 利
用热击法将 pKD46 转入感受态细胞，32℃复苏 45
min，涂布于含青霉素（50 μg/mL）的 LB 平板上，
32℃过夜培养。
挑选阳性克隆传代，加 L-阿拉伯糖（终浓度为
0.1%），继续培养至 OD600=0.5-0.6，无菌条件下操
作 ：冰浴 15 min，4℃，2 500 r/min 离心 10 min，弃
上清，分别用无菌水和 500 μL 10% 灭菌甘油冰上温
和清洗，重复前操作，溶于 500 μL 10% 灭菌甘油得
制备 DH5α（pKD46）感受态细胞。将 kanr 片段电转
化，电击参数为：25 μF，200 Ω，2.5 kV，5 ms。32℃
孵育 1 h，涂布于含青霉素（50 μg/mL）和卡那霉素
（50 μg/mL）的 LB 平板上，32℃过夜培养［21］。挑取
阳性单克隆，划线接种于含氨苄青霉素和卡那霉素
的 LB 平板上，转接 2 次，验证其遗传稳定性。
1.2.3 E.coli［menA］菌株的验证 分别以稳定传
代的 E.coli［menA］和 E.coli 原始菌株基因组为模
板，PCR 扩增验证 menA 基因是否被敲除。上游验
证 引 物 ：ATGGCAGGTGAACGAATC ；下 游 验 证 引
物 1 ：CCATTTCCCGCATCACAT，下游验证引物 2 ：
CAGTCATAGCCGAATAGC ；PCR 扩增条件同前，退
火温度改变为 56.9℃。
1.2.4 大肠杆菌中 CoQ 的提取纯化 制备流程 ：发
酵液→ 4 000 r/min 离心 20 min 收集菌体→真空冷
冻干燥后称重→ 90℃醇碱皂化 30 min，同时加入
焦性没食子酸防止 CoQ 被氧化→石油醚萃取 2 次→
超纯水洗至 pH7.0 →无水 Na2SO4 干燥→ -20℃冷冻
1 h →过滤除杂→旋转蒸发仪干燥→ 10 mL 无水乙醇
定容→低温保存待用。
1.2.5 menA 基因敲除对 CoQ 种类和含量的影响测定
1.2.5.1 CoQ10 标准曲线的绘制 CoQ10 标准曲线制
备过程如下 ：配制 0.2 mg/mL 的 CoQ10 标准品溶液，
分 别 稀 释 成 5、10、15、20、25 和 30 μg/mL 浓 度，
在 275 nm 处紫外检测其吸收值［22］。
1.2.5.2 HPLC 方法验证 CoQ 种类 为了检测基因敲
除后是否造成 CoQ 种类的改变，在 CoQ 提取纯化基
础上，对各菌株的提取液进行了 HPLC 检测，以大
肠杆菌 DH5α提取液作为 CoQ8 的保留时间标准对照。
实验参数［23，24］为 ：色谱柱为 Agilent XDB-C18（4.6
mm×150 mm）；流动相为 95% 无水乙醇 ：5% 甲醇 ；
流速 l mL/min ；检测波长 275 nm ；温度 25℃ ；进样
量 20 μL。
1.2.5.3 menA 基因敲除对 CoQ 含量的影响测定 实
验以 M9 培养基作为基础培养基，需要情况下加入
卡那霉素 50 μg/mL，培养至对数中期（13 h），提取
纯化 CoQ，采用紫外分光光度计法测定 menA 基因敲
除菌株 E.coli［menA］的 CoQ 含量，以出发菌株 E.coli
2015,31(12) 209刘永青等：大肠杆菌 menA敲除对 CoQ 积累的影响研究
为对照。
1.2.6 紫外线诱变对 CoQ 含量的影响
1.2.6.1 菌悬液制备 分别取 10 mL 培养至对数期
的发酵液于 6 个无菌离心管中，4 000 r/min 离心 10
min，弃上清，收集菌体，沉淀用 10 mL 生理盐水洗
涤离心 2 次。
1.2.6.2 紫外线诱变 紫外灯预热 15 min，取 6 组
菌悬液各 0.1 mL 注入 LB 平板中，涂布均匀。紫外
灯照射条件 ：15 W，30 cm，照射时间分别为 15、
30、45、60、75、90 s，整个过程在暗室中完成。未
经照射的平板作为对照，每组 3 个平行。照射后立
即取出，暗室中 37℃培养 24 h。将处理好的菌悬液
做适当稀释，将细胞浓度控制在 107-108 个 /mL。
1.2.6.3 初筛 根据致死率曲线，取对菌株致死率
为 70%-80% 的处理时间进行诱变［25］。吸取 0.1 mL
菌悬液涂布于罗红霉素筛选平板上，进行紫外照射。
挑选长势好的菌株进行复筛。
1.2.6.4 复筛 经初筛挑选的突变株，种子液中过
夜培养，按 2% 的接种量转入发酵培养液，37℃ 180
r/min 摇床培养至对数期，按方法 1.5 提取 COQ，采
用紫外分光光度计法测定突变菌株 CoQ 含量。
2 结果
2.1 kanr线性片段的扩增
设 计 kanr 基 因 的 扩 增 引 物， 以 pKD4 质 粒 为
模 板 进 行 PCR。 带 有 FRT 位 点 的 kanr 基 因 净 长
1 496 bp，加上两端外延部分及 menA 基因同源臂共
长 1 636 bp（图 1），凝胶电泳结果（图 2）显示扩
增产物与理论长度相符。
2.2 kanr线性片段重组结果
抗性筛选结果显示，对照组由于 kan r 基因未转
入，平板上没有菌株生长 ；而转入 kan r 基因的平板
上有单菌落出现。以初步认为此菌落是 kan r 基因重
组成功菌株。从上述平板 B 中挑取阳性菌落，将单
克隆接种于含氨苄青霉素、卡那霉素的 LB 培养基
上传代培养，发现其遗传稳定性良好。
将筛选到的目的菌株稀释涂布接种在卡那霉素
单抗培养基上，42℃过夜消除 pKD46。将 42℃下形
成的单菌落分别接种于卡那霉素单抗培养基和氨苄
青霉素、卡那霉素双抗性培养基上验证抗性，选取
在卡那霉素培养基上生长良好而氨苄青霉素、卡那
霉素双抗性培养基无法生长的菌种，视为 pKD46 消
除的 E.coli［△menA］候选菌株进行进一步验证。
2.3 E.coli［△menA］重组子验证
选取 pKD46 质粒消除的待验证 E.coli［△ menA］
候选菌株，提取基因组 DNA，用设计的两对引物
P3-P4 和 P3-P5 分别对 menA 基因敲除前后的菌株进
行 PCR 扩增，引物扩增到 762 bp 片段说明 menA 基
因被 kanr 敲除，若用 P3-P4 引物扩增到 1 082 bp 片
段说明 menA 基因未被敲除。
扩增产物电泳结果（图 4）显示，第 2-5 泳道
为 E.coli［△menA］候选菌株 PCR 结果，当用 P3-P4
引物扩增时，未能扩增得到理论上的 1 082 bp menA
基因片段，说明 menA 基因不存在。当用 P3-P5 引
物扩增时，获得了 762 bp 的片段，与理论上推测的
kanr 替换 menA 结果一致，说明敲除成功。对照组 E.coli
P1
H1
FRT pKD4 FRT
1496 bp
1636 bp
P2
H2
质粒 pKD4 中包含 FRT 位点的 kan r 基因，长 1 496 bp ；P1-P2 是线性 DNA
片段扩增引物 ；P1-P2 引物的阴影部分是与质粒 pKD4 上设计的与 kan r 基
因两侧序列互补的扩增引物，H1，H2 为两侧同源臂。用 P1-P2 预计扩增出
1 636 bp 大小的片段
图 1 kanr 基因片段扩增引物设计示意图
5000
bp
1 2 3
1636
bp
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
1 ：250 bp DNA Marker plus ；2，3 ：kan r 线性片段
图 2 kanr 线性片段扩增结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12210
菌株 PCR 结果（泳道 6-9）显示，P3-P4 引物可以
和 E.coli 菌株基因组模板特异结合，PCR 产物大小
为 1 082 bp（泳道 8，9）；而 P3-P5 引物扩增的结果
是无特异性条带生成（泳道 6，7）。通过 menA 基因
敲除前后菌株特异 PCR 产物的鉴定，认为实验构建
菌株即为 E.coli［△ menA］菌株，此构建工作已顺
利完成。
选单菌落保存于斜面培养基，摇床复筛，测定突变
株 COQ 产量。
2.5 menA基因敲除与紫外诱变对CoQ的影响测定
2.5.1 CoQ10 标准曲线的绘制 用无水乙醇配制不同
浓度的 CoQ10 标准品溶液，OD275nm 处检测其吸光值，
标准曲线如图 6。以 CoQ10 质量浓度（x）为横坐标，
吸光度（y）为纵坐标进行回归计算，得回归方程为
y=0.018x+0.008，相关系数 R2=0.998。
menA hsIU
hsIU
rraA
P4 P3
1082 bp
FRTkan
P5 P3
762 bp
FRTrraAyiiU
yiiU
menA 基因若未被敲除，用 P3、P4 将扩增出 1 082 bp 的片段 ；menA 基因若
被敲除，用 P3、P5 扩增出 762 bp 的片段
图 3 E.coli［△ menA］菌株 PCR 验证示意图
1082
762
5000
bp bp
1636
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 ：250 bp DNA Marker plus ；2，3 ：E.coli［△ menA］候选菌株 P3-P5 引物
PCR 结果 ；4，5 ：候选菌株 P3-P4 引物 PCR 结果 ；6，7 ：E.coli 原始菌株
P3-P5 引物 PCR 结果 ；8，9 ：E.coli 原始菌株 P3-P4 引物 PCR 结果
图 4 E.coli［△ menA］重组子 PCR 验证结果
2.4 紫外诱变
紫外诱变大肠杆菌的致死率曲线如图 5，随着
紫外照射时间延长，大肠杆菌致死率提高，当紫外
诱变时间为 60 s 时，致死率达到 78%。下一步对紫
外诱变 60 s 的正突变菌株进行研究。
取稀释好的菌悬液涂于初筛培养基平板上，紫
外处理 60 s，37℃培养 24 h，得突变菌落 17 株，挑
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 15 30 45 60 75 90 105ᰦ䰤/s㠤↫⦷
/%
图 5 紫外诱变大肠杆菌的致死率曲线
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
O
D
27
5n
m
੨ݹ٬A
0 5 15
CoQ10⎃ᓖ/μg·mL-1 2510 20 3530
y=0.018x+0.008
R2=0.998
图 6 CoQ10 标准曲线
2.5.2 menA 基因敲除与紫外诱变对 CoQ 含量的影响
测定 采用紫外分光光度计法分别测定 menA 基因
敲除菌和突变株的 CoQ 含量，结果如表 1 所示，紫
外诱变产生 2 株正突变株（编号为 D1，D2），CoQ 含
量都有不同程度的提高，但相比于 menA 基因敲除
菌，CoQ 含量提高不大，故选定 menA 基因敲除菌作
为候选菌株进一步研究。
测定结果表明，menA 敲除菌株在相同条件下，
比出发菌 CoQ 含量明显提高，提高幅度约为 38%。
2.5.3 CoQ 种 类 验 证 分 别 以 CoQ10 标 准 品 和 原
2015,31(12) 211刘永青等：大肠杆菌 menA敲除对 CoQ 积累的影响研究
始大肠杆菌 DH5α CoQ 提取液作为 CoQ8 对照，对
menA 基因敲除菌 CoQ 提取物进行了 HPLC 定性鉴定
（图 7）。从图 7 可以看出，CoQ10 标准品保留时间为
7.1 min，原始大肠杆菌 CoQ8 提取液保留时间为 5.6
min，根据保留时间可以判断大肠杆菌 menA 基因敲
除菌 CoQ 提取物中为 CoQ8。
3 讨论
维生素 K2 又称甲基萘醌，也是一种芳香族醌
类化合物，与 CoQ 拥有相同的底物分支酸和聚异戊
烯长链。大肠杆菌维生素 K2 的合成途径涉及到 6
个特定的基因，依次为 menA，menB，menC，menD，
menE和 menF。分支酸先在 menF 编码的分支酸异
构酶作用下变成异分支酸，然后在 menD、menC、
menB和 menE 基因编码的相应酶作用下生成 1，4-二
羟基 -2- 萘酸，最后在 menA 基因编码的 1，4-二羟
基 -2- 萘酸八异戊烯基转移酶作用下发生链环缩合，
1，4-二羟基 -2- 萘酸和聚异戊烯长链连接成维生素
K2。其中，menA 基因编码的酶是维生素 K2 合成过
程中的限速酶。大肠杆菌既产 CoQ 又产维生素 K2，
因此可在兼性厌氧条件下生长。维生素 K2 作为大
肠杆菌在厌氧条件下替代 CoQ 的电子传递载体，在
好氧条件下并非细菌正常生长所必需的物质。因此
敲除 menA 基因可以使维生素 K2 合成底物聚异戊烯
长链积累，使得 CoQ 合成前体增加，使反应向 CoQ
合成的方向流动。同时维生素 K2 和 CoQ 都是脂溶
性的膜定位活性物质，抑制维生素 K2 的合成还可
以留给 CoQ 更多的膜空间。加拿大学者 Corinne 在
加拿大工业微生物学会年会摘要中报道了与本研究
相似的大肠杆菌旁路基因敲除思路［20］，但尚未见研
究结果报道。本实验首次对 menA 基因进行了敲除，
并对其积累 CoQ 的能力进行了测定，与预期结果相
符，在丰富 CoQ 高产菌株的构建方面具有重要意义。
menA 基因敲除相较于紫外诱变方法稳定性好，无
回复突变，可短时间内定向改造菌种，提高目标产
物量。
在此基础上，可增加 COQ 合成过程中关键酶
的 表 达 提 高 COQ 产 量［26-28］。 华 东 理 工 大 学 叶 江
等［29，30］对大肠杆菌 UbiCA 强化表达来提高 COQ 合
表 1 menA 基因敲除和紫外诱变对 CoQ 含量的影响
菌株 mgCoQ/g 干细胞 /（mg·L-1）
E.coli 0.659±0.023 1.610±0.021
E.coli［△ menA］菌株 0.912±0.046 2.050±0.041
D1 0.744±0.025 1.803±0.028
D2 0.727±0.016 1.793±0.029
数据采用“x-±s”表示法 ；E.coli［△ menA］菌株加入 50 μg/mL 卡那霉素
统计结果来自 3 次独立实验，**P<0.01，menA 敲除对 CoQ 含量提高具有
显著性差异
2.00 4.00 6.00 8.00 10
2.00 4.00 6.00 8.00 10
2.00 4.00 6.00 8.00 10
A
B
C
7.122
5.677
5.667
A ：CoQ10 标准品 ；B ：原始大肠杆菌 CoQ 提取液 ；C ：E.coli［△ menA］CoQ
提取液
图 7 大肠杆菌 menA 基因敲除菌 CoQ 提取液的 HPLC 鉴
定图（保留时间 min）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12212
成能力。改变 COQ10 合成途径
［31］主要包括两个方
面 ：通过重组聚十异戊二烯合成酶使大肠杆菌合成
COQ10 ；将真核生物合成 IPP 的甲羟戊酸途径重组入
大肠杆菌，使 IPP 供应能力加强。将脱氮副球菌的
dps 基因重组入大肠杆菌，使其获得合成 CoQ10 的能
力 ；或将酵母合成聚十异戊二烯的 ispB 基因与大肠
杆菌的 ubiA 基因在大肠杆菌中共表达，使 CoQ10 产
量提高。华南理工大学李家洲等［32］将放射型根瘤
菌 ddsA 基因替换大肠杆菌 ispB 基因并强化 CoQ 合
成关键酶来提高 CoQ10 产量。要想获得理想的代谢
工程 COQ 生产菌株，应进行系统代谢通量分析，确
定修饰和改造的靶点，多点协同改造。Xu［33］、刘建
忠等［34，35］通过多基因策略、染色体工程改造大肠
杆菌高效生产 CoQ10 取得了一定的效果。
发酵工艺优化方面，有意识的控制培养基的溶
氧或氧化还原电位，或在培养基中添加抑制呼吸作
用的叠氮化合物，控制相对较高的 pH 值，都有助
于提高 COQ 的产量。另外采取边生产边萃取［36］的
方法有助于降低生产过程中 COQ 对自身合成的反馈
调节。江南大学金赛等［37］通过根癌土壤杆菌产辅
酶 Q10 的补料分批发酵工艺使 CoQ10 产量得到大幅提
高。总之，要实现 COQ 的工业化生产，应从多方面
入手 ：生物合成途径的探讨、高产 COQ 大肠杆菌的
构建、高产菌株的选育、发酵工艺的优化以及 COQ
提纯检测等下游技术的研究。
4 结论
首次成功敲除 menA 基因，大肠杆菌 CoQ 产量
增加约 38%，种类不变，达到预期目标。
参 考 文 献
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（责任编辑　李楠）