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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):82-87
收稿日期 ：2014-11-05
基金项目 ：国家高技术研究发展计划“863”项目（2012AA101106）
作者简介 ：熊鹤雯，女，硕士研究生，研究方向 ：大豆分子遗传育种 ；E-mail ：344356549@qq.com
通讯作者 ：郭蓓，女，教授，研究方向 ：植物分子遗传育种 ；E-mail ：guobeibac@tom.com
产量一直是大豆育种最重要的性状之一。大豆
产量是一个综合性状，其遗传基础复杂，研究与产
量密切相关的性状或产量因素，是揭示产量性状遗
传基础的有效途径。大豆产量主要影响因素可归为
三类 ：（1）光合生理有关性状 ：生物量累积与分配、
叶部性状等；（2）产量因子：收获指数、百粒重、荚数、
节数及分枝性状等 ；（3）倒伏性［1］；前二者是产量
决定因素，后者是高产限制因素。目前对这三类产
量主要影响因素的分子遗传基础研究尚需加强。
有研究报道，水稻中的 GW2 基因负责编码一个
环形 E3 泛素连接酶，是调控水稻粒宽和粒重的主效
基因［2］。GW2 功能的缺失使得泛素不能被转移到靶
大豆基因 GmGW2 的克隆与转化
熊鹤雯1  吴志慧1  段思宇2  谢皓1  秦玉涛2  郭蓓2，3
（1. 北京农学院植物科学技术学院，北京 102206 ；2. 北京农学院生物科学与工程学院，北京 102206 ；3. 农业部都市农业 ( 北方 ) 重点开放
实验室，北京 102206）
摘 要： GW2 编码一个环型 E3 泛素连接酶，位于细胞质中，通过将其底物锚定到蛋白酶体进行降解，从而负调节细胞的分裂。
之前有文献报道 GW2 位点突变可导致水稻籽粒大小的改变。根据水稻中 GW2 基因序列，在 GenBank 中找到与之同源的大豆基因
序列 GmGW2，克隆目的片段并进行了生物信息学分析。构建转化载体 pCAMBIA1300∷GmGW2∷EYFP，并对大豆品种中黄 10 进
行转化。利用含有重组载体的农杆菌 EHA105 侵染萌发 24 h 的中黄 10 幼胚。当外植体长出 3 片复叶后，提取基因组 DNA，对报
告基因 EYFP 进行 PCR 检测。得到的阳性株在激光共聚焦显微镜下观察，EYFP 蛋白含量显著增加，实验结果显示目的基因已转
化成功。序列分析表明 GW2 基因与苜蓿，鹰嘴豆中的 GW2 基因具有较高的同源性。
关键词 ： GmGW2 ；大豆 ；系统进化树 ；遗传转化 ；EYFP
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.012
Cloning and Transformation of Gene GmGW2 in Soybean
Xiong Hewen1 Wu Zhihui1 Duan Siyu2 Xie Hao1 Qin Yutao2 Guo Bei2，3
（1. College of Plant Science and Technology，Beijing 102206 ；2. College of Biological Science and Engineering，Beijing University of
Agriculture，Beijing 102206 ；3. Key Laboratory of Urban Agriculture（North）of Ministry of Agriculture China，Beijing 102206）
Abstract: GW2 encodes a previously unknown RING-type protein with E3 ubiquitin ligase activity, which is located in cytoplasm. It is
known to function in the degradation by the ubiquitin-proteasome pathway. Loss of GW2 function increased cell numbers. It was reported that
the mutation of GW2 lead to change the size of rice seeds. According to rice GW2 gene sequence, blast in the NCBI, we found a soybean GW2
gene which is homologous. We cloned the target gene and carried on bioinformatics analysis, then we constructed a over-expression vector
pCAMBIA1300∷GmGW2∷EYFP, and transformed into soybean named zhonghuang10 by Agrobacterium-mediated method. Seeds were
germinated on sterile moistened paper towels in Petri dishes for 24 h then infected the immature embryo by Agrobacterium EHA105 which
obtained recombining vector. When the explants have 3 compound leaves, we extract the genome DNA and PCR identified the report gene EYFP.
The content of EYFP is enhanced in PCR positive plant was observed by LSCM. It is demonstrated the transformation of target gene is successful.
The sequence analysis showed that the target gene have higher homology with those of Alfalfa and Gram.
Key words: GmGW2 ；soybean ；phylogenetic tree ；transformation ；EYFP
2015,31(8) 83熊鹤雯等：大豆基因 GmGW2的克隆与转化
蛋白上，因而导致本应降解的底物不能被特异识别，
进而激活颖花外壳细胞的分裂，增加颖花外壳的宽
度，另一方面，灌浆速率也间接地得到了提高，胚
乳大小随之得到了增加，最终谷壳的宽度、粒重以
及产量都得到了增加［3，4］。
目前，除了在水稻中对 GW2 基因进行了较深入
的研究外，在大麦［12］、小麦［13，14］、玉米［15］中也
有少量的研究，但至今未见在大豆中的研究报道。
本实验针对大豆中的 GW2 基因开展了初步的研究，
期望能够发现 GmGW2 是否与大豆产量相关，为将
来利用基因工程技术手段培育出高产的新型大豆品
种进行有益的尝试。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用的大豆品种为中黄 10，由中国农业
科学院作物科学研究所提供，并在北京农学院试验
地进行繁育。克隆载体 pMD18-T 购自 TaKaRa 公司。
农 杆 菌 菌 株 EHA105， 表 达 载 体 pCAMBIA1300∷
EYFP 由本实验室留存。
1.2 方法
1.2.1 目的基因克隆与转化载体构建 根据之前文
献中报道的水稻基因 GW2 的序列，在 GenBank 中
与大豆基因组进行序列比对，找到同源基因 GmGW2
（1 287 bp），其位于大豆基因组 15 号染色体上。根
据 GmGW2 的 mRNA 序列设计引物。提取大豆品种
中黄 10 的总 RNA，反转录为 cDNA，利用设计引
物进行 PCR 扩增，得到目的片段。将目的片段亚
克 隆 到 pMD18-T 载 体 进 行 测 序， 然 后 用 Kpn I 与
EcoR I 双酶切 T 载体，将切下的目的片段连入载体
骨 架 pCAMBIA1300∷EYFP 中， 构 建 出 重 组 载 体
pCAMBIA1300∷GmGW2∷EYFP。
1.2.2 利用农杆菌介导法侵染大豆幼胚 将含有目
的片段的重组质粒热激转化到农杆菌 EHA105 感受
态细胞中，并做 PCR 鉴定，挑取阳性菌落进行扩大
培养至 OD600 为 0.8 左右。
挑选数粒表面光滑无菌斑的成熟的大豆中黄 10
种子，置于干净的培养皿中，喷洒 75% 酒精进行表
面消毒，置于通风橱中吹干，再用 1% 次氯酸钠溶
液喷洒种皮，再次置于通风橱中吹干。将消毒后的
种子放在干燥器中，使用氯气灭菌法（100 mL 次氯
酸钠溶液加入 4 mL 浓盐酸）［5］灭菌 24 h。将灭菌
后的大豆种子用无菌水冲洗，去除表面离子，放入
盛有湿润滤纸的培养皿中，暗培养 24 h，培养温度
25-28℃，光照强度为 150 μmol×m-2×s-1［6］。将萌
发的大豆种子除去种皮，并分开两片子叶，去掉其
中的一片，剩下的子叶要保留完整的胚。轻轻地去
掉一片真叶，并在胚轴，子叶节处划几道伤口，以
备侵染［7］。将外植体浸泡在之前制备的农杆菌菌液
中，15 min 之后将外植体置于共培养基上，于培养
室中暗培养 3 d。培养结束后将外植体上的农杆菌洗
净，栽植到花盆中，前期用保鲜膜覆盖表面。后期
定时浇水，每 2 周浇灌一次营养液［8］。
1.2.3 转基因植株的 PCR 检测 使用 CTAB 法提
取转基因植株幼嫩叶片的 DNA 进行 PCR 检测。反
应体系（20 mL）：ddH2O 13.5 mL，10×buffer 2 mL，
2.5 mmol/L dNTPs 2 mL，10 mm 引 物 各 0.5 mL， 模
板 DNA 1 mL（50-100 ng），Taq 酶 0.5 mL（5 u/mL）。
反应程序 ：95℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，58℃
退火 30 s，72℃延伸 1 min，30 个循环 ；72℃延伸
10 min ；4℃保温。反应产物用 1% 的琼脂糖凝胶电
泳检测。用于检测 EYFP（增强型黄色荧光蛋白）基
因的引物为：EYFP-F：5-GTGAGCAAGGGCGAGGAG-
CT-3 ；EYFP-R ：5-TTACTTGTACAGCTCGTCCA-3，
扩增片段为 717 bp。
1.2.4 激光共聚焦显微观察 激光共聚焦显微镜是
以激光为光源，对观察的样品进行断层扫描和成
像［9］，可以用于检测荧光标记。选择 PCR 鉴定阳
性的转基因植株，摘取新鲜的叶片，制作徒手切
片，在激光共聚焦显微镜（Leica，TCS SP5）下观察
EYFP 的荧光信号。以野生型大豆中黄 10 为对照。
1.2.5 生物信息学分析 将克隆基因的测序结果
在 NCBI 上进行核酸序列和蛋白序列比对及 CDD
（Conserved domain database）分析［10］；GENSCAN 扫
描核酸序列上的编码序列号，翻译成蛋白序列 ；将
蛋白序列与其他物种进行比对，形成系统进化树。
2 结果
2.1 目的基因克隆与载体构建
以 大 豆 中 黄 10 cDNA 为 模 板 进 行 PCR 扩 增
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.884
（图 1），经对亚克隆载体测序，扩增出的 GmGW2
基 因 序 列 相 比 于 GenBank 中 预 测 序 列 的 相 似 度
为 96.03%。将目的片段回收后，连接至经酶切的
pCAMBIA1300∷EYFP 载体上。将连接产物热激转
化到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，37℃倒置培养
12 h，挑取单克隆进行 PCR 鉴定。图 2 显示，在 8
个候选的克隆中有 6 个扩增出了目标条带，表明重
组表达载体 pCAMBIA1300∷GmGW2∷EYFP 已成功
转化大肠杆菌细胞。
液，培养至开花。其间摘取新鲜叶片，制作徒手切片，
放至激光共聚焦显微镜下观察（图 5），激发光波
长为 514 nm［11］。比较野生型和转基因中黄 10 的叶
片组织，可以明显看到在转基因植株叶片上有强烈
的 YFP 荧光信号，而野生型叶片上并未出现荧光信
号。由此进一步证实了目的基因已成功转入受体植
株中。
1000
bp
M - 1 2
M ：DL2000 marker ；- ：空白对照 ；1，2 ：目的片段 GmGW2
图 1 以大豆中黄 10 的 cDNA 为模板扩增 GmGW2
1000
bp
M + 1 2 3 4 5 6 7 8
M ：DL5000 marker ；+ ：阳性对照 ；- ：空白对照 ；1-8 ：8 个转化子
图 2 重组质粒菌落 PCR 鉴定
2.2 转基因植株PCR鉴定
将构建好的重组载体 pCAMBIA1300∷GmGW-
2∷EYFP 热激转化到农杆菌 EHA105 感受态细胞中，
挑取 PCR 检测阳性菌落扩大培养至 OD600 约为 0.8，
将上述菌液浸泡外植体，置于共培养基中黑暗培养
3 d 后转入土培。2-3 周后，提取幼嫩叶片基因组
DNA，PCR 鉴定出阳性植株（图 3），结果表明已将
目的基因转到大豆中黄 10 中。
2.3 激光共聚焦显微镜观察
将 PCR 鉴定阳性的大豆中黄 10 转基因植株与
野生型一起进行盆栽培养（图 4），每 2 周浇灌营养
M + 1 2 3 4 Wt
750
bp
M ：DL2000 marker ；+ ：阳性对照 ；1-4 ：分别为中黄 10 转基因植株 ；
Wt ：野生型
图 3 PCR 鉴定转基因大豆植株
ᐖ˖GW2-2 ਣ˖wildtype
图 4 转入盆栽培养的转基因植株与野生型中黄 10 植株
0 100μm 0 100μm
A B
A ：野生型大豆中黄 10 叶片 ；B ：PCR 鉴定阳性植株叶片
图 5 激光共聚焦显微镜下切片观察
2015,31(8) 85熊鹤雯等：大豆基因 GmGW2的克隆与转化
2.4 序列分析
对 GmGW2 测序结果分析表明，该基因具有完
整的 CDS 区，长度为 1 287 bp。利用 GENSCAN 扫
描核酸序列上的编码序列号，翻译成蛋白序列（图
6）。利用推测的蛋白序列检索 NCBI 的 CDD 数据
库，发现翻译蛋白从第 50-100 个氨基酸中含有一个
RING 型结构域（图 7）。进一步证明此基因是一个
编码新型 E3 泛素连接酶的基因。
图 6 GW2 蛋白序列
Zoom to residue levelGraphical summary
Query seq.
Specific hits
1 75 150 225 300 375 428
Superfanilies
Local query sequence
RING
RING superfamil
Conserved domains on [lcl|local_MGNKL GRRRQ]
hide extra options Show site featuresĸ Horizontal zoom: x 1 Update graph ?
图 7 特异片段蛋白的保守结构域
将 GmGW2 氨 基 酸 序 列 在 NCBI 上 进 行 Blastx
分析，并利用 DNAMAN 软件将其氨基酸序列与其他
物种中编码 GmGW2 的氨基酸序列进行多重比对（图
8），构建系统进化树（图 9），进行聚类分析。结果
表明 GmGW2 氨基酸序列与苜蓿（XP_003622248.1）
XP_007022166.1
XP_006442243.1
XP_002316792.2
XP_006348374.1
XP_002887736.1
XP_002277570.1
XP_006416737.1
XP_004964811.1
Consensus
gw2㳻ⲭᒿࡇ.seqEMS51545.1EEC72814.1AGS15004.1ACL93316.1AFW65938.1EEC80040.1ABO31101.1AFU88755.1AFU88754.1ADQ00387.1
EYU27226.1
EXB52699.1
CAN66658.1
CBI32926.3
和 鹰 嘴 豆（XP_004488643.1） 的 GW2 分 别 有 62%
和 84% 的相似性。
3 讨论
实验过程中我们发现，大豆在无菌水中萌发的
时间比较关键，以 24 h 左右为宜，时间过长将会使
图 8 GmGW2 基因多重序列比对结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.886
胚芽从子叶上脱离 ；时间太短，胚芽过分幼嫩不利
于操作。农杆菌侵染的时间以 15 min 为宜，时间过
长对外植体伤害较大，使种子萌发率明显下降，时
间过短则不利于农杆菌侵染，影响转化率。制备侵
染菌液时加入了 silweet-77，实验中增加了共培养环
节，这些有助于农杆菌的生长及进入外植体，以提
高转化率。
通过对转基因植株 T0 代表现型的初步观察发
现，植株呈现矮小，生育期提前等特点，分析认为，
出现这种情况可能是因为外植体经过了农杆菌侵染
后受到一定程度伤害，长势与野生型植株相比较差。
为能够比较准确地看到转基因植株的表型变化，需
要进一步繁殖转基因后代，获得相对稳定遗传个体，
以便判断 GmGW2 过量表达对受体的影响。
本研究将目的基因与 pCAMBIA1300∷EYFP 载
体连接，利用载体上具有的增强型报告基因 YFP，
使转基因阳性植株的鉴定更加快捷方便，同时黄色
荧光蛋白可以很好地排除植物的绿色背景干扰，使
转基因的检测结果更加直观，明显。与此同时，我
们还将克隆的目的基因进行了一系列的生物信息学
分析，发现该基因编码 E3 泛素连接酶，且与其他物
种（苜蓿，鹰嘴豆）中的 GW2 基因具有比较高的同
源性。有关该基因的相应功能有待进一步验证。
4 结论
本 研 究 利 用 已 发 表 的 水 稻 GW2 基 因 序 列，
在 GenBank 中 找 到 与 之 同 源 性 较 高 的 大 豆 基 因
GmGW2，克隆测序结果表明与 GenBank 中预测序
列相似度达到 96.03%。用克隆片段构建出重组表
达载体 pCAMBIA1300∷GmGW2∷EYFP，并通过萌
发种子的方法转化至大豆品种中黄 10 中。对阳性
的植株进行激光共聚焦显微镜观察，可见转基因植
株中报告基因 YFP 的表达量极明显地增加。通过对
GmGW2 基因进行生物信息学分析，发现其编码 E3
泛素连接酶，具有保守的环形结构，进化树分析显
示其与苜蓿和鹰嘴豆的同源性较高。
参 考 文 献
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100
91 Cicer arietinum
Medicago truncatula
Glycine max
Cucumis sativus
Populus trichocarpa
Theobroma cacao
Vitis vinifera
Solanum tuberosum
Solanum tuberosum
Triticum aestivum
Zea mays100
58
61
19
42
99
0.05
图 9 GmGW2 基因进化树
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（责任编辑 李楠）