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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
吡 咯 喹 啉 醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）
是不同于烟酰胺嘌呤核苷酸（NAD/NADP）和黄素
核苷酸（FMN/FAD）的一种新型辅酶，被归类为 B
族维生素［1］。PQQ 分子中含有参与氧化还原反应的
邻醌类结构，可作为辅因子参与脱氢、氧化、水合
和脱羧等反应［2］。迄今，PQQ 主要发现于革兰氏阴
性细菌，如肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、
扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens）和绿脓
杆菌（Pseudomonas aeruginosa）等［3，4］。大肠杆菌
（Escherichia coli）不能合成 PQQ，但能合成以 PQQ
为辅因子的酶蛋白［5，6］。肺炎克雷伯氏菌的 PQQ 合
成基因为线性排列的基因簇 pqqABCDEF，包括 6 个
收稿日期 ：2013-11-25
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21076013），“973”项目（2012CB725200）
作者简介 ：孙继国，男，硕士研究生，研究方向 ：微生物代谢工程 ；E-mail ：mishiweilan@126.com
通讯作者 ：田平芳，男，博士，教授，研究方向 ：微生物基因工程 ；E-mail ：tianpf@mail.buct.edu.cn
基于重组大肠杆菌无细胞体系生产吡咯喹啉醌
孙继国1  韩增叶1  葛喜珍2  田平芳1
（1. 北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029 ；2. 北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023）
摘 要 ： 采用无细胞体系生产吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）。首先将肺炎克雷伯氏菌 PQQ 基因簇 pqqABC-
DEF 置于半乳糖苷酶启动子之下，构建表达载体，经转化筛选获得重组大肠杆菌。制备重组菌的细胞匀浆，体外反应后测定 PQQ
产量。结果显示，与活体重组菌相比，无细胞体系的 PQQ 产量提高约 30%，表明胞内存在 PQQ 合成的限速反应，而无细胞体系
可解除此限速反应。
关键词 ： 大肠杆菌 无细胞体系 吡咯喹啉醌 限速反应
Exploiting Cell-free System of Recombinant E. coli to Synthesize
Pyrroloquinoline Quinone
Sun Jiguo1 Han Zengye1 Ge Xizhen2 Tian Pingfang1
（1. College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029 ；2. College of Biochemical
Engineering，Beijing Union University，Beijing 100023）
Abstract:  In this study, cell-free system was developed to overproduce pyrroloquinoline quinone（PQQ）. The PQQ gene cluster from
Klebsiella pneumoniae was subcloned into vector harboring lac promoter and a recombinant Escherichia coli was acquired. Subsequently cell
homogenate was prepared which showed ~30% increase of PQQ yield compared with in vivo biosynthesis. Not only revealing the presence of
intracellular velocity-limiting reaction（s）that retards PQQ biosynthesis, this study also suggests that cell-free system can address this issue.
Hence, this study provides basis for further enhancement of PQQ production.
Key words:  E. coli Cell-free system Pyrroloquinoline quinine Velocity-limiting reaction
阅读框［7］，pqqA 负责前体的合成，其余基因产物参
与催化或转运。
在大肠杆菌中已成功表达乙酸钙不动杆菌和肺
炎克雷伯氏菌的 PQQ 基因簇，并检测到 PQQ 的合
成［8］。前者的 PQQ 合成量较低，后者培养基中的
PQQ 产量达到 230 nmol/L，推测是在胞质合成 PQQ，
然后运输释放到培养基中。乙酸钙不动杆菌的 PQQ
分泌能力较弱。作为辅因子，PQQ 参与多种反应，
较难在胞内高度积累，推测是因为存在限速步骤。
无细胞体系（cell-free system）是基于不完整细胞或
完全不依赖细胞生产目标产物的方法，常用于研究
多酶反应的限速步骤，或直接用酶进行体外催化［9］。
2014年第4期 165孙继国等 ：基于重组大肠杆菌无细胞体系生产吡咯喹啉醌
利用 T7 启动子在大肠杆菌中过表达葡萄糖酸杆菌的
pqqABCED 阅读框，但不能大量合成 PQQ［10］，推
测胞内存在 PQQ 合成的限速步骤。本研究用无细胞
体系验证限速步骤，旨在探索体外用细胞匀浆合成
PQQ。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒与培养条件 肺炎克雷伯氏菌（K.
pneumoniae DSM 2026），大肠杆菌 E. coli DH5α 及 E.
coli BL21，以及携带 PQQ 基因簇的表达质粒 pET-
PQQ 由本实验室保存。大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌
的通用培养基为 Luria-Bertani（LB），重组大肠杆菌
的培养基为高糖 M9 培养基，其葡萄糖浓度为 1.5%
（W/V）。上述两菌的培养温度分别为 37℃和 30℃
（肺炎克雷伯氏菌提供 PQQ 基因簇），转速为 200
r/min，抗生素为硫酸卡那霉素 50 mg/L。
1.1.2 主要试剂 PrimeStar 聚合酶、Ex Taq 聚合酶、
限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶购自大连宝生物公
司 ；PQQ 标品购自 Sigma 公司 ；其他试剂均为国产分
析纯。
1.2 方法
1.2.1 工程菌的构建 以 pET28a 质粒为骨架，选择
Bgl II 和 EcoR I 为上下游酶切位点，将其自身的 T7
启动子更换为半乳糖苷酶启动子 pLAC（以本实验室
构建的 pET-PQQ 为对照，PQQ 基因簇含自身原始启
动子）。设计引物如表 1 所示。PCR 克隆 pUC19 中
的 lac 启动子（用 Ex Taq 聚合酶，PCR 参数 ：95℃
5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共 30 个循环；
72℃延伸 10 min）。基于 T7 启动子前面的 Bgl II 位
点和多克隆位点的 EcoR I 位点，将 T7 启动子更换为
lac 启动子，得到重组载体 pET-pLAC。将去掉原始
启动子的肺炎克雷伯氏菌 PQQ 基因簇 pqqABCDEF
插入其下游。具体方法 ：以肺炎克雷伯氏菌基因组
DNA 为模板，PCR 扩增 5.5 kb 的 pqqABCDEF 基因簇。
根据 GenBank 报道序列设计引物。使用 PrimerStar
聚合酶，PCR 参数：98℃ 3 min；98℃ 15 s，60℃ 15 s，
72℃ 5 min，共 30 个循环。用 EcoR I 和 Hind Ⅲ双
酶切 pET-pLAC，将 5.5 kb 的 PQQ 基因簇插入 pET-
pLAC 质粒，构建由 pLAC 调控的 pqq 基因簇表达质
粒 pET-pLAC-PQQ。
表 1 试验所用引物
引物 序列（5-3） 酶切位点
pLAC-F GTACAGATCTAAACGCCAGCAACGC Bgl II
pLAC-R CCGGAATTCAGCTGTTTCCTGTGT EcoR I
PQQ-F CCGGAATTCATGTGGAAGAAACCTGCTTTTATCGAT EcoR I
PQQ-R CCCAAGCTTTAATCCCCTGTCGTGAACAGCACC Hind III
1.2.2 重组菌培养条件 以 LB 培养基为种子培养
基，高糖 M9 培养基（1.5% 葡萄糖）为发酵培养基。
大肠杆菌在 37℃下培养，转速 200 r/min。用种子培
养基活化重组菌，按 1% 菌量转接于发酵培养基。
当重组菌 E. coli（pET-pLAC-PQQ）的 OD600 值为 0.6
时加入诱导剂 IPTG，使其终浓度为 1 mmol/L。以 E.
coli（pET-PQQ）为对照，培养 72 h，测定 PQQ 产量（卡
那霉素终浓度为 50 mg/mL）。
1.2.3 无细胞体系的制备 工程菌经种子培养基过
夜活化，按 1% 菌量转接于发酵培养基。当 E. coli
（pET-pLAC-PQQ） 的 OD600 值 为 0.6 时， 加 入 IPTG
使其终浓度为 1 mmol/L，培养 24 h 后测 OD600。按
OD600=1 时 10 mL 菌 液 量（ 即 OD600×V=10），5 000
r/min 离心 10 min，加入裂解缓冲液，超声破碎细胞，
收集培养 24 h 的培养基，测 OD600 后按相同菌量离
心，弃上清，用 pH7.0 的 PBS 重悬，再次离心，弃
上清，以洗去残余培养基，离心后加入 15 mL（即
OD600×V 值的 1.5 倍）细胞破碎缓冲液，超声破碎，
4℃下经 5 000 r/min 离心 10 min，取上清，避光密闭
条件下 30℃孵育 3 h，测定孵育前后的 PQQ 产量（非
酶法测定）。无细胞体系反应条件 ：30℃，3 h。用
于超声破碎的缓冲液成分 ：pH7.0 磷酸缓冲液，0.1%
巯基乙醇，0.05% PMSF。超声条件 ：超声 2 s，间隔
3 s，功率 80 Hz，50 次。
1.2.4 PQQ 含量与生长速度测定 PQQ 含量用非酶
法测定［11］；用比浊法测定 600 nm 下的菌体吸光度，
绘制生长曲线。
2 结果
2.1 含LAC启动子载体的构建
超表达基因将造成过重的细胞负荷。因质粒
pET28a 携带 T7 强启动子，故需更换为半乳糖苷酶
启动子（pLAC，来自 pUC19 质粒）。PCR 产物经电
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期166
泳鉴定，符合预期（~500 bp），电泳结果见图 1。测
序结果表明启动子序列完全正确。
表 2 菌株及重组质粒
菌株和质粒 描述 来源
菌株 E. coli DH5α & BL21 Wild type 实验室保存
Klebsiella pneumoniae 同上 同上
质粒 pET28a
pET-pLAC
原始质粒
含 lac 启动子
实验室保存
实验室构建
pET-PQQ 自身 T7 启动子，PQQ 基因簇 同上
pET-pLAC-PQQ lac 启动子，PQQ 基因簇 同上
pUC19 lac 启动子 同上
2.3 PQQ基因簇的表达
因 PQQ 基因簇的原始启动子及半乳糖苷酶启动
子均非强启动子，且 PQQ 基因簇本身含有发卡转录
抑制结构，因此基因经转录和翻译产生的蛋白较少，
从 SDS-PAGE 难以辨认，故只能从 PQQ 产量来间接
体现基因的表达。
2.4 发酵液中PQQ产量
工程菌经种子培养基过夜活化，在高糖 M9 发
酵培养基中培养 72 h 后，向 E. coli（pET-pLAC-PQQ）
加入诱导剂 IPTG，用非酶法检测发酵上清液的 PQQ
含量。结果（图 3）表明，E. coli（pET-pLAC-PQQ）
与 E. coli（pET-PQQ）的 PQQ 产量基本一致，表明
这两种启动子对 PQQ 产量无明显差异。
600
bp
T7 Promoter
Bgl II
EcoR I
MCS
pLAC
500
400
300
200
100
左 ：LAC 启动子电泳图 ；右 ：LAC 替换 pET28a 中 T7 启动子示意图
图 1 LAC 启动子克隆及载体构建示意图
2.2 PQQ基因簇的克隆与重组载体构建
PCR 产物经电泳鉴定，符合目的条带大小（~5.5
kb）。
基于 EcoR I 和 Hind Ⅲ两个酶切位点，将 5.5 kb
的 PQQ 基因簇插入含 LAC 启动子的载体，提取质粒，
酶切，琼脂糖凝胶电泳结果（图 2）表明，不同启
动子的 PQQ 重组质粒构建成功。E. coli DH5α 为质
粒扩增宿主菌，E. coli BL21 为表达宿主菌，载体及
菌种见表 2。
1000
bp
1 M
bp
1 2 M
7500
5000
2500
1000
7500
5000
2500
A B
C
florigin
Kan
PQQ gene cluster
ori
pLAC
lac
K. pneumoniae
PQQ ABCDEF
A ：M ：λ-Hind Ⅲ Marker ；1 ：pET-pLAC-PQQ 质粒酶切 ；B ：M ：λ-Hind Ⅲ
Marker ；1 ：pET-pLAC-PQQ 质粒 ；2 ：pET-PQQ 质粒 ；C ：载体构建示意图
图 2 Lac 启动子载体的构建
pET-PQQ pET-pLAC-PQQ
E.coli
120
80
40
PQ
Q
ӗ䟿
nm
ol
/L

0
图 3 两种重组菌的 PQQ 产量
2.5 工程菌生长曲线
由生长曲线可知，携带 PQQ 基因的重组菌比对
照菌（含空载体 pET）提前 2 h 进入平稳期，系因
PQQ 基因表达导致了代谢负荷。若扣除该代谢负荷，
PQQ 的合成促进了菌体生长。进入平稳期后，重组
菌 E. coli（pET-pLAC-PQQ）的生物量略低于其他菌，
可能是添加 IPTG 造成了细胞毒性。总体来看，重组
2014年第4期 167孙继国等 ：基于重组大肠杆菌无细胞体系生产吡咯喹啉醌
菌 E. coli（pET-pLAC-PQQ）与其他菌的生物量基本
持平，表明生成的 PQQ 至少没有抑制大肠杆菌的生
长繁殖（图 4）。
的 PQQ 产量没有变化，但重组菌 E. coli（pET-pLAC-
PQQ）的 PQQ 产量却提高了约 30%，表明重组菌 E.
coli（pET-pLAC-PQQ）的细胞内存在瓶颈反应，从
而限制了 PQQ 的合成。细胞破碎后，其 PQQ 产量
明显增加，表明限速步骤被解除，PQQ 合成反应得
以继续。
0.35
0.25
0.15
0.05
0.00
0 2 4 6 8 10ᰦ䰤h 12 14 16 18
0.10
0.20
E.
c
ol
i O
D
60
0
0.30
pET
pET-pLAC-PQQ
pET-PQQ
图 4 重组大肠杆菌生长曲线
2.6 无细胞体系培养
2.6.1 无细胞体系破碎条件的确定 细胞破碎条件
是影响胞液中酶活的关键因素，因此对常用 4 种破
碎条件进行选择，经过无细胞反应体系后确定条件
1 为最佳破碎条件（图 5）。
200
150
100
50
0 ᶑԦ1
PQ
Q
ӗ䟿
nm
ol
/L

ᶑԦ ᶑԦ ᶑԦ
超声条件 1 参数 超声条件 2 参数 超声条件 3 参数 超声条件 4 参数
超声时间 2 s 超声时间 10 s 超声时间 3 s 超声时间 10 s
间隔 2 s 间隔 10 s 间隔 3 s 间隔 5 s
功率 80 Hz 功率 120 Hz 功率 60 Hz 功率 40 Hz
超声次数 50 次 超声次数 40 次 超声次数 50 次 超声次数 40 次
图 5 细胞破碎条件
2.6.2 无细胞体系孵育条件的确定 因缺乏无细胞
体系孵育条件的相关研究，因此研究了 PQQ 体外反
应最佳条件。最终确定反应条件为 30℃，避光密封
孵育 3 h（图 6）。
2.6.3 工程菌无细胞体系反应 按照上述方法对工
程菌进行无细胞体系反应，反应结束后测定 PQQ
产量。
测定结果（图 7）表明，细胞破碎前后对照菌
26.5
120
150
130
140
160
170
180
190
33.5 3730
৽ᓄ⑙ᓖć
1
0
150
50
100
200
3 4 52
৽ᓄᰦ䰤h
PQ
Q
ӗ䟿
nm
ol
/L

PQ
Q
ӗ䟿
nm
ol
/L

A
B
图 6 无细胞体系反应条件
21 pET-PQQ
pET-pLAC-PQQ
pET-PQQafter incubation
pET-pLAC-PQQafter incubation
14
7
PQ
Q
ӗ䟿
nm
ol
/L

0
after ultrasonic treatment after 3 h incubation
图 7 重组菌无细胞体系孵育前后的 PQQ 产量
3 讨论
无细胞体系是提高目标产物产量的重要策略，
其本质是解除活细胞内生化反应的限速步骤［9］。本
研究构建了合成 PQQ 的重组大肠杆菌，结果表明更
换启动子及优化培养基未能显著提高 PQQ 产量。考
虑到限速反应的存在，建立了无细胞体系。与活细
胞合成 PQQ 相比，重组菌 E. coli（pET-pLAC-PQQ）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期168
经无细胞体系反应后，其 PQQ 产量提高约 30%，表
明胞内存在瓶颈反应，无细胞体系可解除此瓶颈。
该结果证明了 PQQ 体外合成的可行性。此外，培养
条件、能量与还原力平衡、粗提液成分及酶活性均
影响 PQQ 产量。
本试验的 PQQ 增产幅度有待提高，表明细胞粗
提物无法达到最优效果。若对底物和酶进行纯化，
对反应条件进行优化，并充分考虑能量和还原力等
因素，可望进一步提高 PQQ 产量。由于 PQQ 生物
合成机理尚未完全阐明，通常会采用超表达其基因
簇或无细胞体系来提高其产量。由于 PQQ 是葡萄糖
脱氢酶的辅酶，推断 PQQ 通过参与葡萄糖代谢而促
进细胞生长。结果显示，PQQ 基因的表达导致了代
谢负荷，若扣除该代谢负荷，PQQ 的合成促进了菌
体生长。事实上，有文献［12］报道 PQQ 能刺激细胞
生长，推断 PQQ 与细胞生长之间存在耦合关系。因
此，共表达 PQQ 基因簇和葡萄糖脱氢酶基因可望促
进 PQQ 的积累。此外，由于 PQQ 参与多种代谢过
程以及其合成机制的复杂性，对 PQQ 生产菌进行
大规模基因组改造，然后进行高通量筛选，不失为
PQQ 高产育菌的有效策略［13］。随着 PQQ 合成机理
的阐明，其无细胞生产体系也将得以完善。
4 结论
构建了合成 PQQ 的重组大肠杆菌，结果表明更
换启动子及优化培养基未能显著提高 PQQ 产量。考
虑到限速反应的存在，建立了无细胞体系。与活细
胞合成 PQQ 相比，重组菌 E. coli（pET-pLAC-PQQ）
经无细胞体系反应后，其 PQQ 产量提高约 30%，表
明胞内存在瓶颈反应，无细胞体系可解除此瓶颈。
培养条件、能量与还原力平衡、粗提液成分及酶活
性均影响 PQQ 产量。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）