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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
平菇（Pleurotus ostreatus），又名糙皮侧耳，是
我国中原地区种植量最大的食用菌之一［1］。在平菇
菌种繁育、种植过程中会受到一些病毒侵染为害，
导致平菇子实体畸形，严重时造成不发菇，导致产
量和品质下降［2］。目前，对食用菌等真菌中病毒
的检测、鉴定、新病毒的发现等通常采用提取双链
收稿日期 ：2014-05-04
基金项目 ：2013 年食用菌创新团队岗位专家工作经费（PXM2013_036203_000055）
作者简介 ：王少杰，男，硕士研究生，研究方向 ：植物病毒 ；E-mail ：wangshaojiestrong@163.com
通讯作者 ：周涛，男，副教授，研究方向 ：植物病毒 ；E-mail ：taozhoucau@cau.edu.cn
师迎春，女，研究员，研究方向 ：蔬菜和食用菌病虫害 ；E-mail ：shiych@126.com
应用深度测序技术鉴定平菇球形病毒
王少杰1  王廿1  师迎春2  胡晓艳3  周涛1
（1. 中国农业大学植物病理学系，北京 100193 ；2. 北京市植物保护站，北京 100029 ；3. 北京市农业技术推广站，北京 100029）
摘 要 ： 旨在鉴定采集于北京顺义的畸形平菇样品中的病毒，提取总 RNA，构建小 RNA 库，对小 RNA 库进行深度测序。
测序结果表明，与平菇球形病毒（Oyster mushroom isometric virus，OMSV）基因组序列（NC_004560.1）匹配的小 RNA 共有 3 075 条，
分布在 OMSV 基因组的不同位置，形成一些热点区域。经拼接，获得了 3 条长度大于 500 个核苷酸的序列。根据其中覆盖 OMSV
外壳蛋白（Coat protein，CP）基因的序列（seq22）中相对保守区域，设计引物，利用 RT-PCR 扩增获得 cp 基因部分序列。序列
比对表明，其与 OMSV 相应区域序列相似度为 91%，证实了 OMSV 在畸形平菇样品中的侵染。同时，将深度测序结果与现有 4 种
siRNA 预测软件的预测结果进行比较，发现测序结果与软件预测结果之间存在差异，讨论了这一差异出现的原因。
关键词 ： 平菇 深度测序 平菇球形病毒 小干扰 RNA 重叠群
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.014
Identification of Oyster Mushroom Spherical Virus in Pleurotus
ostreatus by Deep Sequencing
Wang Shaojie1 Wang Nian1 Shi Yingchun2 Hu Xiaoyan3 Zhou Tao1
（1. College of Agriculture and Biotechnology，China Agriculture University，Beijing 100193 ；2. Beijing Plant Protection Station，
Beijing 100029 ；3. Beijing Agricultural Technical Extension Station，Beijing 100029）
Abstract: To identify viruses in malformed Pleurotus ostreatus samples collected in Shunyi district in Beijing, deep sequencing of small
RNA from total RNA was performed. Consequently, there were 3 075 small interfering RNAs（siRNAs）pairing to the complete sequence of
Oyster mushroom isometric virus（OMSV）（NC_004560.1）. These siRNAs were located in most regions on genome of OMSV, some of which
formed hot-spots. By putting these siRNAs together, three contigs with length more than 500 nucleotides were assembled. According to the
sequence of one of these contigs, seq22, a pair of primers was designed to amplify partial coat protein gene via RT-PCR. The results showed that
cloned sequence was similar to the reference sequence and to the contig with identities of 91% and 99%, respectively. These results confirmed
OMSV in the collected mushroom samples. Meanwhile, the related data acquired from deep sequencing was compared to the predicted siRNAs
obtained by four softwares, showing that they were different from each other. The difference was discussed.
Key words: Pleurotus ostreatus Deep sequencing Oyster mushroom spherical virus siRNA Contig
RNA（double strand RNA，dsRNA）的方法，该方法
所需样品多，过程复杂，需经反复试验和优化才能
获得高质量的 dsRNA 用于序列测定，限制了相关领
域的研究。
深度测序技术鉴定病毒是近几年快速发展起来
的一项技术［3］。运用深度测序技术鉴定病毒的理论
2014年第12期 87王少杰等：应用深度测序技术鉴定平菇球形病毒
基础是 RNA 干扰机制。20 世纪末，研究人员发现
生物体内某些 RNA 分子能够通过某一特定机制降低
相应基因的表达水平，这一特定机制为 RNA 干扰
机制［4］。RNA 干扰作为寄主的一种防御机制，广泛
地参与到寄主对抗各种病原物侵染的过程中。在寄
主与病毒的互作中，病毒复制过程中产生的 dsRNA
被寄主的某些特殊的内切核糖核酸酶切割成小干扰
RNA（small interfering RNA，siRNA）， 这 些 siRNA
引导寄主体内 AGRONAUTE 蛋白沉默与上述 siRNA
序 列 互 补 的 病 毒 RNA［5］。 参 与 沉 默 病 毒 RNA 的
这种 siRNA 被称为病毒衍生的小干扰 RNA（virus-
derived small interfering RNA，vsiRNA），vsiRNA 之
间在序列上有重叠，因此可以被组装成连续的片
段，这些连续的片段与相应病毒的序列相同或者相
似［6， 7］。将 vsiRNA 的上述特性与深度测序技术相结
合后，即可应用深度测序技术鉴定已知病毒及某些
新病毒了［8-10］。这一鉴定病毒的方法适用于多种生
物体内多种病毒的鉴定［8，11］。
平菇球形病毒（Oyster mushroom spherical virus，
OMSV）是一种侵染为害平菇的正单链 RNA 病毒，
于 2003 年首先被韩国科学家发现并分离［12］。OMSV
病毒颗粒为等轴球形，直径约为 27 nm，基因组全
长约为 5.7 kb，5-末端没有帽子结构，3-末端有多
聚腺苷酸尾巴，编码 7 个开放阅读框（Open Reading
Frame，ORF）。目前已知其中两个 ORF 的编码产
物，分别为病毒的外壳蛋白（Coat Protein，CP）和
RNA 依 赖 性 RNA 聚 合 酶（RNA-dependent RNA
polymerase，RDRP），其他 ORF 编码的氨基酸序列
与 GenBank 中已知的氨基酸序列没有同源性［2，12］。
平菇被 OMSV 侵染后，出现菌丝退化、菌柄短粗等
症状［12］，这些症状使平菇经济价值降低，从而导致
平菇种植业损失严重。检测鉴定平菇球形病毒，特
别是检测平菇菌种是否携带该病毒，对生产实践具
有重要意义。
本研究应用深度测序技术，鉴定子实体表现畸
形症状平菇样品中的 OMSV，并分析与 OMSV 序列
匹配的 siRNA 的分布规律和拼接序列与参比序列的
比对结果，旨在为其他种类的食用菌中的病毒检测
鉴定提供借鉴和参考，并为深入研究 OMSV 与平菇
的互作过程提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
平菇样品采集于北京市顺义区。样品表现症状
为菌柄短粗，菌盖褐化程度严重，子实体畸形变小，
生长受到阻滞（图 1）。
图 1 疑似被病毒侵染的平菇
1.2 方法
1.2.1 RNA 的 提 取 和 质 量 检 测 采 用 mirVanaTM
miRNA Isolation Kit（Ca#t. AM1560 Austin TX，US）
并根据说明书进行样品总 RNA 的抽提纯化，之后对
抽提纯化后的总 RNA 进行质量检测。
1.2.2 深度测序和序列拼接 委托上海伯豪生物技
术有限公司进行深度测序（illumina solexa，HiSeq
2500 System）。测序样本文库构建时，按照“TruSeq
Small RNA Sample Preparation Guide”对纯化后的样
品总 RNA 依次进行 3 端接头连接、5 端接头连接，
反转录、扩增、cDNA 纯化等步骤，从而完成测序
样本文库的构建。测序后，筛选出与病毒库序列匹
配的 siRNA，进行预处理，去除 siRNA 两侧接头序
列和低质量序列标签（reads）。随后使用软件 Clc
Genomics Workbench（CLC bio，版本 6.5）进行序列
拼接，软件运行时长度参数设置为 200，其他参数
均为软件默认值。siRNA 序列信息上传到 GenBank
数据库（序列号为 SRR1395331）。
1.2.3 拼 接 序 列 比 对 使 用 本 地 化 的 Blast 软 件
（ftp ：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/
LATEST，版本号 2.2.29），进行拼接序列的比对，序
列 比 对 时 所 使 用 的 数 据 库 为 从 NCBI 网 站（www.
ncbi.nlm.nih.gov）下载的病毒数据库（时间为 2014
年 3 月 2 日，共有 1 498 320 个条目，均以 FASTA
格式保存）。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期88
1.2.4 vsiRNA 及 拼 接 序 列 seq22 的 分 析 使 用
Microsoft office 软件，利用数理统计的方法，分析与
OMSV 序列（ID ：NC_004560.1）匹配的 siRNA 在病
毒基因组上的分布规律，以及拼接序列与 OMSV 序
列的比对结果。
1.2.5 PCR 验证 根据序列核酸比对结果，使用软
件 DNAMAN（ 版 本 6.0，LynnonBiosoft） 设 计 引 物
OMSV4910F ：5-TACCCCCCCAGGATCTCAAGCTTC-
T-3 和 OMSV5556R ：5-TGAAAGCGCGTCCATCAG-
AACCATTC-3，扩增 cp 基因部分片段，预期产物
大 小 为 646 bp。PCR 扩 增 程 序 为 ：95℃ 起 始 变 性
3 min ；95℃ 变 性 30 s，55℃ 退 火 35 s，72℃ 延 伸
40 s，35 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。PCR 产物
经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离。使用普通琼脂糖凝胶
DNA 回收试剂盒（北京天根生化科技公司）回收相
应大小的 PCR 产物。回收产物连接到 pMD18-T 载
体（大连宝生物工程公司），阳性克隆由北京华大基
因科技有限公司进行序列测定。使用 DNAMAN（版
本 6.0，LynnonBiosoft）对测序结果进行序列比对。
1.2.6 深度测序的结果与预测软件结果的比较 用
4 种 siRNA 预 测 软 件（siDESIGN Center，http ：//
www.thermoscientificbio.com/design-center/ ；DSIR，
http ：//biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html ；OptiRNA，
http ：//optirna.unl.edu/ ；WI siRNA Selection Program，
http ：//sirna.wi.mit.edu/）对 OMSV 基因组产生 siRNA
分布情况进行预测，并将深度测序数据中与 OMSV
匹配的 siRNA 分布情况与软件预测结果的分布情况
进行比较。
2 结果
2.1 平菇样品总RNA质量
提 取 的 平 菇 样 品 总 RNA 经 过 质 量 检 测，
A260/A280=2.08，符合分离小 RNA 和建立 cDNA 文库
的标准（表 1）。
表 1 平菇病害样品总 RNA 质检信息
浓度（μg/μL） 体积（μL） 总量（μg） A260/A280 28S/18S 结果
0.137 100 13.7 2.08 1.60 合格
2.2 与OMSV序列匹配的 siRNA分析
对 siRNA 测序结果进行分析，去除接头序列
和低质量标签（reads），使用本地化 BLAST 与病毒
基因库进行比对，发现与病毒序列匹配的 siRNA 有
5 409 条， 其 中 有 3 075 条 siRNA 与 OMSV 的 序 列
（ID ：NC_004560.1） 匹 配。 按 照 vsiRNA 的 来 源 进
行分析，发现由 OMSV 正链形成的 siRNA 有 2 029
条，占总数的 66% ；由 OMSV 互补链形成的 siRNA
有 1 046 条，占总数的 34%，即由病毒正负链产生
的 siRNA 比例接近 2∶1。
对 5 端起始核苷酸进行分析，发现以腺嘌呤
核糖核苷酸（A）为起始核苷酸的 siRNA 有 674 个，
占总数的 22% ；以胞嘧啶核糖核苷酸（C）为起始
核苷酸的 siRNA 有 1 073 个，占总数的 35% ；以鸟
嘌呤核糖核苷酸（G）为起始核苷酸的 siRNA 有 666
个，占总数的 22% ；以尿嘧啶核糖核苷酸（U）为
起始核苷酸的 siRNA 有 660，占总数的 21%（图 2）。
676њ
660њ
666њ
1073њ A 22%C 35%G 22%U 21%
图 2 5 端起始核苷酸不同的 vsiRNA 之间的比例
按照 OMSV 上 ORF 的分布情况进行分析（以
vsiRNA 的 5 端的起始位置作为分类标准），发现
有编码 CP 的区域产生了最多的 vsiRNA，是产生
vsiRNA 的热点区域（表 2）。
2.3 与OMSV序列匹配的拼接序列分析
使用 Clc Genomics Workbench 软件对与病毒序
列匹配的 siRNA 进行序列拼接，拼接序列经过本地
化的 blast 比对后，其中有 3 条拼接序列与 OMSV 序
列（ID ：NC_004560.1） 匹 配（ 表 3）， 与 OMSV 序
列匹配上的序列总长度为 5 096 nt，占 OMSV 序列的
88%。
选取长度最大的拼接序列 seq22 进行详细分析。
Seq22 长度为 2 747 nt，与 OMSV 序列（NC_004560.1）
的核酸序列相似度为 79.69%。按 ORF 的分布情况，
将 seq22 序列分成 4 个区域，这 4 个区域分别参与
2014年第12期 89王少杰等：应用深度测序技术鉴定平菇球形病毒
编码 RDRP、14.5 kDa、CP 和 23 kDa 4 种蛋白。
使用 DNAMAN（版本 6.0，LynnonBiosoft）软件
从核酸序列和氨基酸序列水平比对 seq22 和 OMSV
基因组序列（ID ：NC_00-4560.1）对应区域的相似
性（表 4）。比对结果表明，在编码 RDRP 和 CP 的
ORF 区域，seq22 与 OMSV 基因组参考序列核酸序
列之间相似性较低，但氨基酸序列之间相似性较
高 ；在编码 14.5 kD 蛋白和 23 kD 蛋白的 ORF 区域，
seq22 与 OMSV 基因组参考序列核酸序列之间和氨
基酸序列之间相似性均较低。
表 4 拼接序列 seq22 与 OMSV 基因组序列相应区域的核
苷酸和氨基酸相似性对比
区域 核酸序列相似度（%） 氨基酸序列相似度（%）
RDRP 区域 75.40 87.42
14.5 kD 蛋白区域 81.31 58.02
CP 区域 90.48 93.67
23 kD 蛋白区域 86.73 73.46
2.4 RT-PCR验证
根据序列拼接结果，设计引物 OMSV4910F 和
OMSV5556R，利用 RT-PCR 扩增 cp 基因部分序列（图
3）。经测序和序列分析，该 PCR 产物为 OMSV 的部
分 cp 序列，与 OMSV 标准序列（ID ：NC_004560.1）
的 cp 基因核酸序列相似度为 91%，与相应拼接序列
（seq22）的核酸序列相似度为 99%。
2.5 深度测序与预测软件分析siRNA分布的比较
将 深 度 测 序 数 据 中 与 OMSV 匹 配 的 siRNA
的 分 布 情 况 与 4 种 siRNA 预 测 软 件（siDESIGN
Center，http ：//www.thermoscientificbio.com/design-
center/ ；DSIR，http ：//biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.
html ；OptiRNA，http ：//optirna.unl.edu/ ；WI siRNA
Selection Program，http ：//sirna.wi.mit.edu/）的预测结
果的分布情况进行比较后发现，实际情况与预测结
果存在较大差异（图 4），预测结果表明编码 RDRP
的区域是 siRNA 产生的热点区域，而测序结果中编
码 CP 的区域是 siRNA 产生的热点区域。
表 2 vsiRNA 在病毒基因组上的分布
位置（nt） 编码产物 vsiRNA 总量 正链产生的 vsiRNA 互补链产生的 vsiRNA 正链与互补链产生的 vsiRNA 之间的比例
1-78 非编码区域 8 3 5 0.60∶1
79-4824 RDRP 640 474 166 2.9∶1
608-949 12 kD 35 31 4 7.8∶1
1802-2155 12.5 kD 5 5 0 -
3311-3883 21 kD 20 12 8 1.5∶1
4001-4396 14.5 kD 169 134 35 3.8∶1
4899-5612 CP 2383 1512 871 1.7∶1
5053-5685 23 kD 1665 1003 662 1.5∶1
5686-5784 非编码区域 0 0 0 -
表 3 拼接序列与平菇球形病毒基因组的匹配及相似度
序号 拼接序列长度（bp） 参比序列（ID） 拼接序列上相对应的位置（nt） 参比序列上相对应的匹配位置（nt） 相似度（%）
seq22 2747 NC_004560.1 2-2739 2959-5706 79.69
seq24 668 NC_004560.1 32-663 2341-2972 75.47
seq35 2048 NC_004560.1 16-1024 346-1354 74.07
seq35 2048 NC_004560.1 1279-1989 1561-2271 68.60
750
bp
M 1 2 3 4
500
M ：Trans2KTM Plus DNA Marker ；1，2 ：样品 PCR 产物条带 ；
3，4 ：健康对照
图 3 OMSV cp 基因 PCR 检测电泳图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期90
3 讨论
通过深度测序鉴定病毒是近几年来快速发展的
病毒鉴定新技术，已在多个物种中应用。与常规鉴
定病毒的技术（如 PCR）相比，应用深度测序技术
鉴定病毒的方法（以下简称深度测序）具有一些优
势，特别是在发现新病毒方面。深度测序可以病毒
序列等信息未知的情况下，只需提取总 RNA，分离
siRNA，构建文库后进行测序，经序列比对即可对
某一或一群生物体内的几乎所有病毒进行发现和鉴
定，灵敏度高，适用性强，获得的信息丰富 ；缺点
是操作过程复杂，技术要求高，成本高。而常规应
用 PCR 和 RT-PCR 检测和鉴定病毒的方法（以下简
称 RT-PCR）需要病毒的基因组部分序列，适用于研
究比较清楚的病毒，检测针对性强，一次反应仅能
检测一种至多种病毒，如果病毒序列变异大，极易
出现错误结果，优点是已经普及，成本低。
目前，对食用菌病毒研究相对较少，可以利用
的序列信息也较少。食用菌栽培生产中有多种不正
常生长表现，多为子实体畸形或者不发菇。利用常
规的分子生物学技术，如 RT-PCR 方法、酶联免疫
方法和提取双链 RNA 的方法对病毒进行检测，由于
序列特异性强、检测灵敏度低等缺点，难以对食用
菌病毒做到全面检测和鉴定，特别是尚未有报道的
病毒［13］。
由 OMSV 正链形成的 vsiRNA 与由 OMSV 基因
组互补链形成的 vsiRNA 之间的比例为 2∶1。鉴于
OMSV 为正单链 RNA 病毒，因此推测 OMSV 衍生出
的双链和自身单链均是 vsiRNA 的主要来源。这可能
是由于 OMSV 的正单链 RNA 自身形成了较多的发卡
等二级结构。同时，平菇中以碱基 C 为 5 端起始核
苷酸的 vsiRNA 数量明显多于其他 vsiRNA，这可能
是由于 RNA 干扰过程中，起相关作用的酶具有偏好
性的缘故。
经过分析 vsiRNA 在 OMSV 序列上的分布规律，
发现编码 CP 的区域是 siRNA 产生的热点区域。主
要原因可能是因为该区域产生的 siRNA 具有较高
的沉默效率，也有可能是因为其他未知因素。为了
证实这一推测，将深度测序数据中与 OMSV 匹配的
siRNA 的分布情况与 4 种 siRNA 预测软件的预测结
果的分布情况进行比较，结果表明软件预测 RDRP
区域为 siRNA 产生热点区域，与深度测序结果差异
较大。由于预测软件的算法是主要基于靶向序列的
一级结构［14-16］，因此可以推断编码 CP 的区域成为
热点区域的主要原因有可能是一级结构以外的其他
原因。这些原因有可能与功能有关，CP 是在病毒与
寄主互作中的重要因子，寄主的防御系统将沉默的
重点区域设定为编码 CP 的区域，有助于寄主抵御
病毒。除了功能原因以外，二级结构也有可能是形
成热点区域的重要原因［17，18］。
在分析拼接序列 seq22 的不同区域是否存在同
义突变时，发现了两个特殊区域，分别参与编码
14.5 kD 蛋白和 23 kD 蛋白。与 OMSV 编码 RDRP、
CP 区域不同的是编码 14.5 kD 蛋白和 23 kD 蛋白核
酸序列的变异直接导致氨基酸序列的改变，这种改
变有可能使得这些区域编码的产物功能发生变化。
因此这些区域编码的产物有可能在病毒与环境的互
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
wi siRNA selection
program
design of small interfering
RNA
optiRNA
sidesign center
deep sequencing
si
R
N
A
ঐᙫ䟿ⲴⲮ࠶∄%
OMSVᒿࡇкⲴ਴४ฏ
纵坐标为各区域产生的 1 ：5 非编码区域 ；2 ：RDRP 区域 ；3 ：12 kD 区域 ；4 ：12.5 kD 区域 ；5 ：21 kD 区域 ；6 ：14.5 kD 区域 ；
7 ：CP 区域 ；8 ：23 kD 区域 ；9 ：3 非编码区域
图 4 预测软件结果与深度测序结果的比较
2014年第12期 91王少杰等：应用深度测序技术鉴定平菇球形病毒
作中起重要作用［19，20］。但由于这两个区域编码的产
物功能未知，仍有待于进一步试验证明。
4 结论
本研究应用深度测序技术鉴定了平菇样品中
的平菇球形病毒（OMSV），并使用 RT-PCR 的方法
进行了验证 ；利用生物信息学技术初步分析了与
OMSV 有关的 siRNA 在病毒基因组上的分布情况。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）