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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-12-02
作者简介 : 黄莹 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 酶工程 ; E-mail: ivyying@yahoo.cn
通讯作者 : 丁庆豹 , E-mail: bioxianleid@163.com; 欧伶 , E-mail: ouling@ecust.edu.cn
大肠杆菌酸性磷酸酶基因克隆表达及应用
黄莹1 丁庆豹1 欧伶1 魏晓琨2 许彦梅2 张春艳2 王 2
（1 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237 ；2 上海斯贝生物科技有限公司，上海 200237）
摘 要： 将大肠杆菌 K-12的酸性磷酸酶（AphA）完整基因和去信号肽基因分别克隆到 pET-28a（+）载体上，并转化入大
肠杆菌 BL21（DE3）中。经诱导检测，重组菌均能表达出高活性的可溶性酶蛋白，去信号肽表达更稳定。对重组菌的活性研究表
明，相对于野生菌，重组菌酶活力得到大幅度提高，同时，以 pNPP、肌苷为底物进行磷酸转移催化反应，在 pH4.0-6.0、反应温
度 37℃条件下，约有 30%的肌苷可转化为 IMP，但随着反应的进行所形成的 IMP又被该酶降解，向反应液中加入 EDTA即可明显
抑制酶的水解活性，减缓 IMP的降解速率。
关键词： 大肠杆菌 酸性磷酸酶 IMP
Cloning，Expression and Application of Acid Phosphatase from
Escherichia coli K-12
Huang Ying1 Ding Qingbao1 Ou Ling1 Wei Xiaokun2 Xu Yanmei2 Zhang Chunyan2 Wang Yue2
（1State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Technology，Shanghai 200237；
2Shanghai SCIBEST Technology Co. Ltd，Shanghai 200237）
Abstract: Gene（AphA）from E. coli K-12, which had full-length sequence or part-length sequence that initialization segment
encoding signal peptide was cut off, was cloned into plasmid pET-28a（+）and expressed in E. coli BL21（DE3）individually. The two kinds
of recombinant strain can express soluble enzyme protein under the induction of IPTG, but the aimed protein amount in pET-28a-dAphA was
stable than that in pET-28a-AphA through identification by SDS-PAGE and Zymogram detection. The recombinant strain both had higher
phosphorylysis activity than original strain. Meantime, 30% inosinic acid could be formed from pNPP and inosine at pH4.0-6.0 and 37℃ , howe-
ver, the product was soon degraded. EDTA can inhibit the hydrolytic activity of the enzyme, thus the product IMP can remain a period of time
without degradation.
Key words: Escherichia coli Acid phosphatase IMP
大肠杆菌酸性磷酸酶（AphA）属于非特异性酸
性磷酸酶 B 类的一种，该酶由 4 个约为 26 kD 的同
源亚基构成［1］。这种类型的酶广泛存在于肠道细菌
中，如鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）的非
特异性酸性磷酸酶II类［2， 3］和摩氏摩根菌（Morganella
morganii）酸性磷酸酶（NapA）［4］。这类酶不但具
有磷酸水解酶活性，可以将各种磷酸单酯类化合物
脱去磷酸，而且此酶在适当条件下也具有磷酸转移
酶活性，可以将磷酸单酯的低能磷酸基团转移到不
同有机物的合适的羟基上。
核苷酸通常作为食品添加剂和医药中间体，其
中 5IMP 和 5GMP 因为具有更明显的助鲜效果，可
广泛应用于食品加工领域。目前主要有两种方法生
产核苷酸，一种是化学合成法，利用菌体发酵产生
肌苷，再用 POCl3 磷酸化［5］，副产物较多，提纯困难；
另一种方法是利用大肠杆菌肌苷激酶［6, 7］磷酸化肌
苷，此过程需要 ATP 的参与，而 ATP 需要通过产氨
杆菌发酵再生，限制了酶法合成的应用。酸性磷酸
酶具有的磷酸转移活性，仅需要加入廉价低能的磷
酸基团供体和肌苷等核苷作为受体，即可催化产生
2012年第5期 111黄莹等 ：大肠杆菌酸性磷酸酶基因克隆表达及应用
核苷酸，因其反应简便高效且条件温和而受到各国
研究者的重视。
本研究通过基因工程手段将大肠杆菌酸性磷酸
酶（AphA）完整基因和去信号肽基因分别克隆到
pET 载体上，构建出重组子 E-AphA 和 E-dAphA，
并对酶的磷酸水解活性以及对肌苷的磷酸转移活性
进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒 大肠杆菌 K-12（Escherichia co-
li）、DH5α（Escherichia coli）、BL21（DE3）、pET-28a
（+）载体为本实验室保存。
1.1.2 主要试剂和培养基 限制性内切酶、T4 DNA
连接酶购自上海皓嘉科技发展有限公司的 TaKaRa
产品 ；2×Taq PCR Master Mix 购自天根生化科技
有限公司 ；DNA 回收试剂盒购自上海捷瑞生物工
程有限公司 ；PCR 引物合成由上海捷瑞生物工程
有限公司合成 ；测序由上海美吉生物技术有限公
司进行。
LB 培养基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，
NaCl 10，pH7.0。固体培养基中添加 1.5％的琼脂。
固体、液体 LB 培养基使用时按需要分别添加氨苄
青霉素（Amp，终浓度 100 μg/mL）和卡那霉素（Kan，
终浓度 50 μg/mL）。
1.1.3 主要仪器 美国 Agilent Technologies 1200 系
列高效液相色谱仪，英国 TECHNE TC-412 PCR 仪，
北京六一仪器厂 DYCZ-24D 电泳仪、DYCP-31 水平
电泳槽和 DYCZ-24D 垂直板电泳槽，宁波新芝生物
科技有限公司 JY92-II 型超声破碎仪，上海第三分
析仪器厂 752 紫外光栅分光光度计。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌 K-12 酸性磷酸酶基因的 PCR 扩
增 大肠杆菌 K-12 基因组 DNA 抽提方法参照细菌
基因组 DNA 的微量提取法［8］。根据 GenBank 中已
报道的大肠杆菌酸性磷酸酶（AphA）基因的序列（GI：
315134697）设计了以下引物（表 1）， 引物 AphA（+）
和 AphA（-）为扩增酸性磷酸酶完整基因的上下游
引物，引物 dAphA（+）和 dAphA（-）为扩增去除
信号肽基因的上下游引物。
PCR 扩增程序 ：94℃预变性 5 min ； 94℃变性
30 s，57-62℃退火 30 s，72℃延伸 1 min， 共循环 30
次 ；最后 72℃延伸 5 min。PCR 产物经 0.9％（W/V）
的琼脂糖凝胶电泳后，用 DNA 回收试剂盒回收。
表 1 本研究中所用引物序列
引物 序列（5-3） 酶切位点
AphA（+）
AphA（-）
dAphA（+）
dAphA（-）
GGAATCCATATGCGCAAGATCACAC
CGGGGATCCTCAGTATTCTGAATTG
ATTGCGGATCCCTGGCCTCATCTC
GCGGAAGCTTTCAGTATTCTGAATTGACG
NdeⅠ
BamH Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
1.2.2 克隆载体和表达载体的构建 将回收后的
PCR 产物连接到 pMD18-T 载体上，连接产物转化到
E. coli DH5α 中，筛选氨苄抗性的阳性克隆，克隆子由
上海美吉生物技术有限公司测序鉴定。再将经测序
正确的重组 T 载体和表达载体 pET-28a（+）分别用
相应的酶双酶切后，由 T4 DNA 连接酶连接，并转化
入 E. coli BL21（DE3）中，筛选卡那抗性的阳性克隆。
1.2.3 目的基因的诱导表达及酶谱检测 挑取含重
组表达载体的阳性克隆菌株于 50 μg/mL 卡那霉素的
LB 培养基中，37℃培养至 OD600 达到 0.6 时，加入
IPTG 至终浓度 1 mmol/L，28℃诱导 6 h，转速为 175
r/min。培养结束后，收集培养液经 4 000 r/min 离心
20 min 后，用 50 mmol/L Tris-HCl（pH7.1）重悬菌体，
重悬液经超声破碎，12 000 r/min 离心 10 min，沉淀
水洗两次后，用同样体积的 Tris-HCl 溶液重悬，各
部分处理后进行 SDS-PAGE［9］（分离胶浓度为 12%）
分析。
为了检测酶的活性，在 SDS-PAGE 后，将电泳
胶在 37℃的复性缓冲液中温育 24 h，复性缓冲液为
50 mmol/L Tris-HCl（pH7.1），含有 5 mmol/L MgSO4
和 1%（V/V）Triton X-100（曲拉通）。经过复性处理
后，将电泳胶置于 50 mmol/L 含有 5 mmol/L MgSO4
的醋酸 - 醋酸钠缓冲液（pH5.0）中 37℃温育 1 h。
将电泳胶置于 50 mmol/L 含有 5 mmol/L pNPP（对硝
基苯磷酸钠）的醋酸 - 醋酸钠缓冲液（pH5.0）中
37℃温育 30 min 做进一步处理。用双蒸水洗涤两遍，
最后将处理后的电泳胶置于新鲜制备的显色反应液
中 42℃温育 30 min，显色反应液为 6 倍体积酸处理
的钼酸铵溶液（4.2 g/L 钼酸铵，28.6 mL/L 硫酸）以
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期112
及 1 倍体积 10%（W/V）的抗坏血酸［10］。
1.2.4 酸性磷酸酶磷酸水解活性测定 1 mL 反应体
系，2%（V/V）重悬菌体作为粗酶液，1 mmol/L 的
pNPP，50 mmol/L pH5.0（醋酸 - 醋酸钠）的缓冲液
体系，37℃下反应 10 min，反应后立即加入 0.1 mL 5
mmol/L 的 NaOH 终止并测定 A405nm。通过 405 nm 值
的变化计算水解产生的 pNP （对硝基苯酚）含量［11］，
酶活力单位（U/mL）定义为 ：37℃、pH5.0 条件下
每分钟催化产生 1 μmol/L 磷酸水解产物 pNP 的量。
1.2.5 不同反应条件对肌苷酸生成的影响 1 mL 反
应体系，2%（V/V）的重悬菌体作为粗酶液，以
1 mmol/L 肌苷和 5 mmol/L pNPP 作为底物，50 mmol/L
不同 pH 值（pH3.6-5.8 醋酸 - 醋酸钠，pH6.6-8.0
磷酸二氢钾 - 氢氧化钠）的缓冲液体系，一定温度
下反应一段时间，测定转化率。肌苷转化率 = 肌苷
酸含量 / 肌苷含量 ×100%。
最终所得的反应结果用高效液相色谱仪（HPLC）
分析， HPLC 条件为 ： Hypersil SAX 5 μm （4.6 mm×
250 mm），60 mmol/L pH3.0 磷酸 - 磷酸二氢铵缓冲
液为流动相，流速 ： 1 mL/min，检测波长 ： 254 nm，
柱温 ： 25℃。
2 结果
2.1 重组质粒pET-28a-AphA/dAphA的构建与鉴定
以大肠杆菌 K-12 基因组 DNA 为模板，PCR 扩
增 dAphA 和 AphA，分别得到一条 600 bp 和 700 bp
左右大小的特异性条带（图 1），其大小与理论预
期（645 bp 和 714 bp）一致。回收基因片段与表达
载体 pET-28a（+）连接，构建出重组质粒 pET-28a-
dAphA 和 pET-28a-AphA，对重组质粒测序表明，与
GenBank 上公布的大肠杆菌的酸性磷酸酶基因相比
完全一致，将各质粒转入到大肠杆菌 BL21（DE3）中，
分别构建出重组菌 E-AphA 和 E-dAphA。
2.2 酸性磷酸酶的诱导表达
SDS-PAGE 结果表明，经 IPTG 诱导后，酸性磷
酸酶在宿主菌 E. coli BL21（DE3）中有较为明显的
表达（图 2 泳道 2），将去信号肽表达的蛋白分子命
名为 dAphA，其大小约为 24 kD，由于带有 pET-28a
（+）自身的标签蛋白，所以表达的蛋白分子量理论
估计值为 29 kD。未去信号肽基因表达的蛋白分子
命名为 AphA，AphA 因为含有一段信号肽序列，因
此分子量略大，约为 31 kD，若信号肽在胞内被切除，
则大小约为 25 kD。去信号肽蛋白表达与预期结果
一致， 28℃诱导 6 h 后，目的蛋白主要以可溶性蛋白
形式存在（图 2 泳道 2），离心后的沉淀中仅检测出
极少量的目的蛋白条带（图 2 泳道 4），以完整基因
构建的重组菌相对于空载则未观察到明显的蛋白表
达（图 2 泳道 3）。
M. DNA Marker ； 1. dAphA PCR 产物 ；2. AphA PCR 产物
图 1 PCR扩增 AphA/dAphA
M. 蛋白 Marker；1. BL21（DE3）（pET-28a）诱导后全菌 ；2. BL21（DE3）
（dAphA）破碎上清；3. BL21（DE3）（AphA）破碎上清；4. BL21（DE3）
（dAphA）破碎沉淀 ；5. BL21（DE3）（AphA）破碎沉淀
图 2 重组菌中酸性磷酸酶的表达结果
2.3 酸性磷酸酶的酶谱分析
为了进一步研究信号肽序列对于酶活性的影响，
将 SDS-PAGE 胶复性后，对其进行了酶谱检测，结
果如图 3 所示。BL21（DE3）（pET-28a）空载菌未见
明显的酸性磷酸酶水解活性，去信号肽蛋白 dAphA
在其对应条带处显示出酸性磷酸酶的水解活性，未
去信号肽蛋白在 25 kD 处具有酸性磷酸酶水解活性，
2012年第5期 113黄莹等 ：大肠杆菌酸性磷酸酶基因克隆表达及应用
与信号肽序列被切割后的酶蛋白大小相符，经酶谱
检测证实，重组菌均能表达出一定量的活性蛋白。
对酶的水解活力影响，各种离子浓度均为 1 mmol/L，
EDTA浓度为 5 mmol/L，不加任何金属离子作为对照，
结果如图 5 所示。
M. 蛋白 Marker ；1. BL21（DE3）（pET-28a）全菌 ；2. BL21（DE3）（dAphA）
破碎上清 ；3. BL21（DE3）（AphA）破碎上清 ；4. BL21（DE3）（pET-28a）酶谱；
5. BL21（DE3）（dAphA）酶谱 ；6. BL21（DE3）（AphA）酶谱
图 3 重组菌 E-dAphA和 E-AphA的酶谱分析
2.4 工程菌的水解活性
2.4.1 不同酶类型的活性 对相同浓度的 3 种不同
类型的重悬菌体、重悬菌体破碎液进行酶活测定（图
4），可以看出，重组菌酶活力远高于野生菌，并且
重悬菌体破碎液也要高于未破碎的菌体，结果表明
去掉信号肽的 BL21（DE3）（dAphA）破碎液的酶活
最高，可能是因为同样条件下，去信号肽工程菌表
达了更多的活性蛋白所致，因此以去信号肽工程菌
重悬菌体作为粗酶液进行后续研究。
图 4 不同类型酶源的活力比较
2.4.2 金属离子对酸性磷酸酶磷酸水解活性的影
响 参照方法 1.2.4 测定酶活力，研究二价阳离子
图 5 不同二价阳离子对酶水解活性的影响
2.5 工程菌的磷酸转移酶活性
2.5.1 不同酶源类型对肌苷酸生成率的影响 催化
反应体系参照方法 1.2.5，利用不同的酶源类型在
37℃、pH5.0 的条件下进行催化反应，每隔一段时
间取样，液相色谱分析肌苷酸的生成量（图 6）。从
图 6 可以看出，全菌和细胞破碎液作为转化反应的
酶源都有较好的活性，都比较适合作为反应酶源，
可以使肌苷酸的最大产率达到 30% 左右，由于酸性
磷酸酶的水解活性，其后转化率又逐渐下降，全菌
的转化率仅略低于菌体破碎液和上清液，因此，从
工业简便来说，全菌应为最佳的酶源。
图 6 不同类型酶源对肌苷酸的转化率影响
酶源种类
离子种类
2.5.2 pH 对肌苷酸生成率的影响 利用重悬菌体作
为酶源，在 37℃、不同 pH 条件下进行催化反应（图
7）。从图 7 可以看出，酶在酸性条件下（pH4.0-6.0）
活性处于一个较高的水平，并且变化幅度不大，都
能达到 30% 左右的转化率。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期114
2.5.3 温度对肌苷酸生成的影响 利用重悬菌体作
为酶源，在 pH5.0、不同温度下进行催化反应（图 8）。
由图 8 可以看出，在 37℃条件下，肌苷能达到最
大的转化率，随着温度的升高转化率逐渐下降，在
37℃-45℃之间，生成的肌苷酸能保持一段时间不被
快速降解。在高温下，酶的水解活性很高，产物又
被迅速降解，因此，37℃可作为转化反应的最佳温度。
2.5.5 EDTA 浓度对肌苷酸生成的影响 为了进一
步研究 EDTA 对肌苷酸生成的影响，利用重悬菌体
作为酶源，向反应液中加入一定浓度的 EDTA，不
加任何金属离子作为对照，在 pH5.0、37℃下进行
催化反应（图 10）。通过向反应液中加入不同浓度
的 EDTA 进行转化反应发现，当加入的 EDTA 浓度
大于 5 mmol/L 时，随着时间的增加，肌苷转化率基
本维持不变，溶液中加入 EDTA 的转化率略低于未
加 EDTA 的情况，在实际应用中可通过加入 EDTA
来减缓肌苷酸的水解速率。
图 7 pH对转化率的影响
2.5.4 二价阳离子对肌苷酸生成的影响 在 Mn2+、
Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Co2+ 以及 EDTA
存在下测定其对肌苷酸生成的影响，各种离子浓度
均为 1 mmol/L，EDTA 浓度为 5 mmol/L，不加任何
金属离子作为对照，利用重悬菌体作为酶源，在
pH5.0、37℃下进行催化反应（图 9）。从图 9 可以
看出，不加任何二价金属阳离子的条件下，肌苷转
化率最高，生成的肌苷酸可以保持一段时间不被降
解，而二价金属阳离子的添加提高了酸性磷酸酶的
水解活性，所以影响了肌苷酸的转化率。在二价金
属阳离子对酶的磷酸水解活性影响测定中发现，加
入 5 mmol/L 的 EDTA 可以部分抑制酶的水解活性，
使得酶对肌苷酸的水解速率放缓。
图 8 温度对转化率的影响
图 9 金属离子对转化率的影响
3 讨论
核苷酸及其衍生物在抗病毒、抗肿瘤以及用作
食品添加剂等方面都起着重要的作用，以 5IMP 和
5GMP 为代表的呈味核苷酸与谷氨酸钠混合使用将
使食品鲜味提高数倍，具有非常明显的助鲜效果，
因此，作为新型的食品添加剂受到各国研究者的重
视。传统方法生产核苷酸步骤繁多、不易纯化分离，
且由于使用的一些试剂具有毒性而极易对环境造成
污染，利用酶法合成核苷酸，因其反应简便、特异
图 10 EDTA浓度对转化率的影响
2012年第5期 115黄莹等 ：大肠杆菌酸性磷酸酶基因克隆表达及应用
性好、对环境更温和等特点，具有独特的优势。目
前国内外研究者都在致力于改进核苷酸的生产工艺，
但尚未见大规模生产的报道。
本研究通过基因工程手段，构建出含有酸性磷
酸酶的工程菌，高效表达可溶性酶蛋白，通过对酶
的活性分析表明，重组菌相对于野生菌酶活力大幅
度提高，二价金属阳离子的添加提高了酶的水解活
性，导致生成的产物又易被降解，而添加一定浓度
EDTA 可抑制酸性磷酸酶的水解活力，暗示大肠杆
菌的酸性磷酸酶可能是金属离子结合蛋白［13, 14］。
以 pNPP 和肌苷为底物进行催化反应发现，酶
催化的最适 pH 为 pH 酸性条件，跟文献中报道的酸
性磷酸酶最佳活性［12］一致。分析表明，利用重组
菌完整菌体作为粗酶液具有 30% 左右的转化率，仅
略低于菌体破碎液，传质效果及产物透过性较好，
可适用于工业中进一步放大发酵，但由于酸性磷酸
酶磷酸化核苷的反应是可逆反应，生成的产物易被
降解且未达到很高的转化率，后续研究可通过基因
突变，使酶的磷酸转移酶活性进一步提高，水解活
性降低，从而提高对肌苷的转化率。
4 结论
本研究通过克隆大肠杆菌酸性磷酸酶基因，构
建了含酸性磷酸酶的基因工程菌，并成功实现了酶
蛋白的高效表达。利用酶催化肌苷酸的合成发现，
37℃为最适的催化反应温度，酶反应的最佳 pH 范
围为 4.0-6.0 酸性条件，一定浓度的 EDTA 可部分
抑制酸性磷酸酶的水解活性，向反应液中添加 5
mmol/L EDTA 可使转化率维持不变，从而使得生成
的产物肌苷酸保持长时间不被降解，为产物的分离
纯化提供一定的时间。
参 考 文 献
［1］ Rossolini GM, Thaller MC, Pezzi R, et al. Identification of an
Escherichia coli periplasmic acid phosphatase containing a 27 kDa-
polypeptide component. FEMS Microbiol Lett, 1994, 118 ：167-174.
［2］ Uerkvitz W, Beck CF. Periplasmic phosphatases in Salmonella
typhimurium LT2 . A biochemical, physiological, and partial genetic
analysis of three nucleoside monophosphate dephosphorylating
enzymes. J Biol Chem, 1981, 256 ：382-389.
［3］ Uerkvitz W. Periplasmic nonspecific acid phosphatase II from
Salmonella typhimurium LT2. Crystallization, detergent reactivation,
and phosphotransferase activity. J Biol Chem, 1988, 263 ： 15823-
15830 .
［4］ Thaller MC, Lombardi G, Berlutti F, et al. Cloning and characteriza-
tion of the NapA acid phosphatase / phosphotransferase of Morganella
morganii： identification of a new family of bacterial acid-phospha-
tase-encoding genes. Microbiology, 1995, 141 ：147-154.
［5］ Yoshikawa M, Kato T, Takenishi T. Studies of phosphorylation.III.
Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull Chem Soc
Jpn, 1969, 42 ：3505-3508.
［6］ Mori H, Iida A, Teshiba S, et al. Cloning of a guanosine-inosine
kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified
gene product. J Bacteriol, 1995, 177 ：4921-4926.
［7］ Mori H, Iida A, Fujio T, Teshiba S, et al. A novel process of inosine
5-monophosphate production using over expressed guanosine/
inosine kinase . Appl Microbiol Biotechnol, 1997, 48 ：693-698.
［8］ Sambrok J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Clone ：A Laboratory
Manual ［M］. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989.
［9］ Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of
the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227 ：680-685.
［10］ Ames BN. Assay of inorganic phosphate, total phosphate and
phosphatases. Methods Enzymol, 1966, 8 ：115-118.
［11］ Li HC. Phosphoprotein phosphatases. Curr Top Cell Regul, 1982,
21 ：129-174.
［12］ Mihara Y, Utagawa T, Yamada Y, et al. Acid phosphatase/phospho-
transferases form enteric bacteria. J Biosci Bioeng, 2001, 92 ：50-
54.
［13］ Passariello C, Forleo C, Micheli V, et al. Biochemical characteriza-
tion of the class B acid phosphatase（AphA）of Escherichia coli
MG1655. Biochimica et Biophysica Acta, 2006, 1764 ：13-19.
［14］ Leone R, Cappelletti E, Benvenuti M, et al. Structural insights into
the catalytic mechanism of the bacterial class B phosphatase apha
belonging to the DDDD super family of phosphohydrolases. J Mol
Biol, 2008, 384 ：478-488.
（责任编辑 李楠）