全 文 ：收稿日期:2007-09-30
基金项目:863计划(2006AA10Z126)、国家自然科学基金(30770347,30671488)、新世纪优秀人才支持计划(NCET-05-0882)
作者简介:伍国强(1976-),男,在读硕士,研究方向:牧草逆境生理及分子生物学
通讯作者:王锁民(1965-),男,教授,博士生导师,研究方向:植物逆境生理与分子生物学;E-mail:smwang@lzu.edu.cn,Tel:0931-8910983
肌动蛋白(actin)是真核生物中普遍存在的一种重要的蛋白质,是构成细胞骨架和肌肉肌小节的主要
成分,执行着重要的生理功能,如参与细胞分裂、细胞运动、细胞形状变化、胞内物质运输以及细胞内信号
传导等[1~3]。由于 Actin基因在各种组织中恒定表达,因而常被作为一种重要的看家基因以比较不同来源的
目的基因表达量的差异。迄今为止,已在许多高等植物,如拟南芥(AY096397)、水稻(AY212324)、白杨
(EF418792)、玉兰[4]、谷子[5]、花生[6]、水花生[7]等中克隆到了 Actin基因。高等植物的 Actin都是由多基因编
码[8]。这些基因高度相似,通过多轮复制由一个基因祖先进化而来[9],这暗示着 Actin基因在进化过程中承
受着较大的选择压力,在生物体内执行着重要的生物学功能。
霸王作为一种典型的荒漠多浆旱生植物,已成为目前人们研究的热点[10]。然而,有关霸王 Actin基因的
研究尚未见报道。鉴于此,研究拟以霸王幼苗为材料,用 RT-PCR方法克隆霸王 Actin基因片段,以此基因
为内标参照,为研究其他基因在霸王的表达和调控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
植物材料为 4周龄的霸王(Zygophylumxanthoxylum)幼苗,种子采自内蒙古阿拉善左旗巴彦浩特。E.
coli.DH5α菌株由本实验保存。
多浆旱生植物霸王Actin基因片段的克隆及序列分析
伍国强 席杰军 包爱科 王锁民
(兰州大学草地农业科技学院,兰州 730000)
摘 要: 根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以霸王叶片总RNA为模板,采用 RT-PCR
的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T载体。阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,序列分析结果表明:该片段长
598bp,编码198个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的Actin基因序列的同源性均在82%以上,与其他肌动蛋白的氨
基酸序列的同源性达91%以上。
关键词: 霸王 Actin基因 克隆 序列分析
CloningandSequenceAnalysisofActinGeneFragmentfrom
theSucculentXerophyteZygophylumxanthoxylum
WuGuoqiang XiJiejun BaoAike WangSuomin
(SchoolofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730000)
Abstract: Degenerateprimersweredesignedbasedontheconservedsequencesoftheactingenesfromotherplants.Total
RNAwasextractedfromtheleavesofZygophylumxanthoxylum.Actingenefragmentwasobtainedbyreversetranscription
polymerasechainreaction(RT-PCR)andclonedintoPUCm-Tvector.ThepositivecloneidentifiedbyPCRwassequenced.The
sequencingresultrevealedthattheactingenefragmentfromZygophylumxanthoxylumcontains598bp,encodingaproteinof198
aminoacids.HomologycomparisonwithotherplantsactingenesequencesintheGenBankshowsthatitsharesover82%
nucleotidesequencehomologyand91%aminoacidsequencehomologywithotherplantsactins.
Keywords: Zygophylumxanthoxylum Actingene Cloning Sequenceanalysis
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告·
生物技术通报Biotechnology Bulletin2008年第2期
1.2主要试剂
MMLV第一链 cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒,UNIQ-10柱式 DNA胶回收试剂盒、PCR产物克隆
试剂盒等均购自上海生工,DNAmarker购自北京天根,其他生化试剂均为进口或国产分析纯。
1.3实验方法
1.3.1总 RNA的提取 取 4周龄霸王幼苗的叶片提取总 RNA,提取方法参考 Chomczynski和 Sacchi(1987)
的方法[11]。
1.3.2引物的设计与合成 通过对桑树 (DQ785808)、陆地棉 (AY305732)、红云杉 (AF172094)、白杨
(EF418792)、玉兰(AF281323)等几种植物 Actin基因的核苷酸序列进行同源性比较,找出高度保守的区
段,根据同源性高和简并性低的原则,利用 DNAMAN和 Primer 5.0生物软件设计一对简并引物 P1、P2,用
于扩增霸王 Actin基因片段,推测目的片段的长度为 598 bp。引物由上海生工合成。
P1:5-GTGGTCGTACAACWGGTATTGTG-3
P2:5-GAHCCTCCAATCCAGACACTG-3
其中 W=A、T,H=A、C、T。
1.3.3 RT-PCR扩增 cDNA第一链的合成按照试剂盒操作说明进行。
PCR扩增反应体系:10×PCR Buffer 5μl,25mmol·L-1MgCl23μl,2mmol·L-1dNTP 5μl,10μmol·L-1P1
1μl,10μmol·L-1P2 1μl,Taq DNApolymerase(5 U·μl-1)0.5μl,cDNA1μl,加水至 50μl。反应条件:94℃预变
性 2min;94℃变性 30s、56℃退火 45s、72℃延伸 90s,30个循环;最后 72℃延伸 10min。
PCR扩增产物用 1.2%琼脂糖凝胶检测,目的片断的回收和纯化按照试剂盒操作说明进行。
1.3.4阳性克隆的筛选与鉴定 回收的 PCR产物连接到 PUCm-T载体,转化感受态大肠杆菌,用含有
50μg·ml-1氨苄青霉素的 LB固体培养基进行蓝白斑筛选,阳性克隆经质粒 PCR鉴定确认后,送至上海生
工测序。
1.3.5序列的生物信息学分析 序列的比较、翻译等在 DNAMAN生物软件上进行,Blast搜索在 NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)网
站上进行。
2 结果与分析
2.1总 RNA的提取
以霸王叶片为材料提取的总
RNA经甲醛变性凝胶电泳检测
结 果 显 示 28S rRNA、18S rRNA
条 带 清 晰 (图 1),紫 外 测 定
OD280nm/OD260nm平均值为 1.92,表明所提取的 RNA完整性好、
纯度高,可以用于 RT-PCR扩增。
2.2 RT-PCR扩增
以总 RNA反转录所得到的第一链 cDNA为模板,用
Actin基因的简并性引物 P1、P2进行 PCR扩增。扩增产物经
凝胶电泳检测发现约在 600 bp处有一条亮带,且上下无杂
带,与目的片断的大小一致(图 2),推测可能是 Actin基因片
断,有待进一步鉴定。
2.3阳性克隆的鉴定
将回收纯化的目的片段连接到 PUCm-T克隆载体上,转化 E.coli.DH5α。从转化的平板上随机挑取 6
图 2 RT-PCR产物凝胶电泳图
图 3 阳性克隆的 PCR鉴定
M:DNA marker
1.2:PCR products of Actin gene fragment
M:DNA marker 1.2.3 Positive clones
102
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个阳性克隆。随后从这些克隆中任选 3个提取质粒,进行 PCR扩增,得到的扩增片段大小约为 598bp(图
3),与 RT-PCR结果一致,表明这些克隆为阳性克隆,可以进行测序。
2.4 测序结果及序列分析
由图 4可见,阳性克隆测序得到一段 598bp的序列,编码 198个氨基酸。将该片段进行 Blast比较,结
果显示:与其他植物的 Actin基因核苷酸序列的同源性均在 82%以上,其中同源性性最高的是梨 PcACT
(89%);而与氨基酸序列的同源性达 91%以上。表明所克隆到的片段为 Actin基因片断。将该基因命名为
ZxACT,并在 GenBank注册,登录号为 EU019550。
将推测的霸王 Actin基因的氨基酸序列片断和其他植物 Actin基因的氨基酸序列进行多重比较 (图 5),
结果发现它的保守氨基酸多达 185个,而非保守氨基酸仅有 13个。这表明我们克隆的片段为 Actin基因的
高度保守区域。另外,由图 6可见,它与陆地棉 GhACT11和白杨 PtACT同源性最高(98%)、水稻 OsACT次
之(97%)、而红云杉 PrACT和玉兰 MdACT最低(96%),进一步证明了 Actin是一种高度保守的蛋白。
图 4 霸王 Actin基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
注:加框表示引物 P1、P2序列
图 5 ZxACT氨基酸序列片段与其他植物 Actin基因的氨基酸序列多重比较
注:ZxACT:Zygophylumxanthoxylum,GenBankaccessionno.EU019550;GhACT11:Gossypiumhirsutum,GenBankaccessionno.AY305732;
PtACT:Populustrichocarpa,GenBankaccessionno.EF418792;OsACT:Oryzasativa,GenBankaccessionno.AY212324;PrACT:Picea
rubens,GenBankaccessionno.AF172094;MdACT:Magnoliadenudate,GenBankaccessionno.AF281323
伍国强等:多浆旱生植物霸王 Actin基因片段的克隆及序列分析 103
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
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3 讨论
植物肌动蛋白是单一多肽链的球状蛋白,由 375~377个氨
基酸组成,分子量为 42kDa[12]。众多研究表明,Actin基因不论在
核苷酸还是氨基酸水平上都具有高度的保守性和同源性,这暗
示了 Actin作为看家基因在植物生命活动过程中起着非常重要
的作用。实验得到的霸王 Actin基因片段与其他植物 Actin基因
核苷酸序列的同源性均在 82%以上,而与氨基酸序列的同源性
则在 91%以上。由此可见,高等植物的 Actin是一种高度保守的
看家基因。无疑,实验结果再次证明了这一点。
生长在荒漠的多浆旱生植物霸王具有极强的抗逆性,可能
蕴藏着丰富的抗逆基因资源。而实验室已在霸王中成功地克隆
到了 2个耐盐抗旱功能基因的全长 cDNA。要深入研究这些基因的表达模式及调控机制,往往需要内标参
照,而 Actin基因是植物重要的内标之一。但是在 GenBank数据库中未能搜索到有关多浆旱生植物如霸王、
白刺、梭梭等的肌动蛋白基因序列,因此本研究结果填补了这方面的空白,同时丰富了肌动蛋白研究的资
料库,为进一步利用 RT-PCR方法,以 Actin基因为内标参照,研究其他基因 mRNA的表达奠定了基础。
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