全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-31
基金项目:863计划(2001AA214021)和973计划(2001CB108904)资助项目
作者简介:刘伟(1978-),男,博士生,研究方向:微生物基因工程
通讯作者:林敏,研究员,E-mail:linmin57@vip.163.com
引言
水稻是重要的粮食作物,随着人口的不断增长,耕地面积日益减少,提高单位面积产量,是当今水稻生
产的重要课题。除了品种改良以外,以化肥运筹为中心的各种栽培技术,是提高单产的有效途径[1]。然而大
斯氏假单胞菌A1501物质代谢及能量生成相关基因的分析
刘伟 1 燕永亮 1 杨剑 2 平淑珍 1 陈立宏 2
陆伟 1 张维 1 陈明 1 林敏 1
(1中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081;2中国疾病预防控制中心病毒基因工程国家重点实验室,北京 100176)
摘 要: 斯氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)A1501是一株分离自中国南方水稻根际土壤的联合固氮菌。该菌在
无氨和微好氧条件下可将空气中的氮气转化为植物可以直接利用的铵。A1501基因组测定工作已经完成,根据A1501菌
基因组的功能注释对该菌的中心代谢、能量合成及环境适应性等方面进行了生物信息学分析。结果发现,A1501菌的物质
代谢途径具有多样性,除不能利用 EMP途径代谢己糖外,该基因组含有几乎所有编码Entner-Doudorf途径(ED)、磷酸
戊糖途径(HMP)、糖酵解途径(EMP)、三羧酸循环(TCA)以及乙醛酸途径中关键酶类的基因。此外,基因组分析鉴定了
252个与能量产生相关以及3套编码电子传递复合体(1个Nqr和2个Rnf复合体)的基因簇。为进一步研究A1501菌的
碳代谢调控及C-N偶联机制提供了重要的理论依据。
关键词: 斯氏假单胞菌A1501 生物固氮 中心代谢 能量生成
AnalysisoftheGenesInvolvedinCentralMetabolism and
EnergyProductioninPseudomonasstutzeriA1501
LiuWei1 YanYongliang1 YangJian2 PingShuzhen1 ChenLihong2 LuWei1
ZhangWei1 ChenMing1 LinMin1
(1BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081;2StateKeyLaboratoryfor
MolecularVirologyandGeneticEngineering,ChineseCDC,Beijing100176)
Abstract: PseudomonasstutzeriA1501,isolatedfrom ricepaddysoilinSouth-China,canbeabletofixenitrogen
undermicroaerobicconditionsinfree-livingstate.Theammonia,productionofnitrogenfixation,canbedirectlyabsorbed
byhostrice.GenomesequencingofA1501wascompleted,whichbringsthechancetoinvestigatemechanismsoffixation
nitrogen,materialmetabolism andenergyconversion.BioinformaticsanalysisofA1501genomesequenceon central
metabolicpathways,energyproductionandenvironmentaladaptationwasperformed.TheresultsimpliedthatA1501has
diversitymetabolicpathways.GenesinvolvedinthecompleteEntner-Doudoroffpathway,pentosephosphatepathwayand
tricarboxylicacidcyclewereidentified.A1501straincannotuseEmbden-Meyerhof-Parnaspathwayforhexoseutilization
owingtoabsenceof6-phosphofructokinase.A1501encodes252genesthatarebeingresponsibleforenergyproduction
andconversion.Onesetofnqrandtwosetsofrnfclusterencodingforputativeelectrontransportcomplex,was
identifiedin A1501.Analysisofmetabolicandenergyproduction pathwayswilprovidetheoreticalbasisforthe
improvementoffixationnitrogeneficiencyandstudiesoncarbon-nitrogenregulatorymechanism.
Keywords: PseudomonasstutzeriA1501 Nitrogenfixation Centralmetabolismpathway Energyproduction
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量地使用化学肥料,不仅消耗大量的能源,引起严重的环境污染,而且造成土壤严重板结,破坏生态平衡。
如何解决这些问题是全世界所关切的。生物固氮是解决这些问题的有效办法之一。生物固氮是指某些种类
的原核生物利用体内的固氮酶将空气中的氮气还原为氨的过程。固氮微生物种类繁多,主要是原核生物的
真细菌和古细菌,包括厌氧、兼性厌氧和好氧微生物[2],根据其固氮方式又分为自生固氮、联合固氮和共生
固氮[3]。联合固氮菌可与豆科以外的其它单子叶或双子叶植物,尤其是禾本科作物,如水稻等形成紧密的联
合体系进行固氮作用。生物固氮的生化反应式为 N2+(6+2n)H++(6+2n)e-+(12+4n)MgATP→2NH3+nH2+
(12+4n)MgADP+(12+4n)Pi(n≥1),从公式可以看出固氮过程是个极其耗能的过程,一分子氮的固定需要
消耗 16分子的 ATP[4]。对这种耗能反应,固氮菌必然具有一套相应的调节系统,以对各种环境变化做出反
应,从而最大限度地节省自身的能量。目前,对联合固氮菌的代谢途径研究较少。通过对 A1501菌基因组序
列进行分析,找出其物质代谢和能量生成的途径,从而为整体上把握联合固氮菌的遗传背景、代谢网络以
及固氮机制奠定基础。
斯氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)A1501是 20世纪 80年代分离自中国南方水稻根际土壤,最初定
为粪产碱菌[5]。该菌为革兰氏阴性,细胞呈杆状,大小为 0.4～1.0×1.0～1.2μm。胞内含聚-β-羟基丁酸(PHB)
颗粒。葡萄糖 D/F测定为氧化产酸。氧化酶、接触酶皆阳性,以单极鞭毛运动。菌落圆到不规则凸起、有光
泽、乳酪色、半透明、不产水溶性荧光色素、能利用葡萄糖作为惟一碳源、不产精氨酸双水解酶、明胶液化阴
性、能产淀粉酶、具反硝化作用、不利用海藻糖。该菌为微好氧固氮菌,能在无氮的半固体培养基上生长和
固氮良好,乙炔还原活性可达 500～700nmol/ml·h[6]。每消耗 1g碳源可固定 40mg氮[7]。
斯氏假单胞菌 A1501具有多种生物学特异性,是研究水稻联合固氮的重要菌株。本实验室在该菌的固
氮[8],反硝化[9],细菌和寄主的相互作用[10]等多个方面进行了深入的研究。Desnoues等[11]克隆了 A1501菌的
固氮酶结构基因和固氮调控基因 nifLA,发现大部分的 nif基因以基因簇形式存在于染色体上,并且受
NtrBC,NifLA和 RpoN等氮代谢调控蛋白的调控。解志红等[12]对 A1501菌株的固氮调节基因 nifLA的表达
调控机制进行了研究,并采用酵母双杂交技术研究了正调控蛋白 NifA和负调节蛋白 NifL之间的互作。作
为一株根际微生物,该菌在长期进化中形成了独特的代谢特征,比如该菌不仅能够在土壤中生存,而且可
以定植于植物根表,利用 Dct系统获取植物根部分泌物进行生长等[13]。因此,从基因组角度了解该菌的代
谢多样性具有非常重要的科学意义。
1 材料与方法
1.1 菌株与载体
斯氏假单胞菌 A1501菌株为中国农业科学院生物技术研究所微生物研究室试验用菌株,该菌 1980年
分离自中国南方水稻土壤。
1.2 序列分析
序列分析采用使用 Bioedit,VectorNT1等软件。代谢途径分析参照京都基因和基因组百科全书 KEGG
(htp:/www.genome.jp/kegg/pathway.html)。
1.3 核酸序列登记号
斯氏假单胞菌 A501基因组序列已提交 GenBank,登记号为:CP000304。
2 结果与分析
A1501基因组全长 4567418bp,编码 4146个 ORFs,G+C含量为 63.8%,有 4套 16S/23S/5SrRNA操纵
子。将 4146个 ORFs按照 COGs库进行分类,划分为 25个功能组。对这些功能组的基因进行初步分析发
现,在长期的自然进化过程中,A1501菌形成了一套与自身环境高度适应的系统,如该菌的物质代谢途径
多元化,可以多种氮源和碳源生长,具有大量的物质转运系统编码基因及能量代谢合成基因,如糖类和氨
基酸等物质的利用及厌氧和好氧条件下的呼吸与能量合成途径。
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2.1 中心代谢
A1501在氨同化作用或者固氮条件下可以利用广谱碳源进行生长。该菌拥有中心代谢途径包括
Entner-Doudorf途径(ED),磷酸戊糖途径(HMP),糖酵解途径(EMP),柠檬酸循环(TCA)和乙醛酸途径的大
部分基因。与其它假单胞菌属代谢一样[14],尽管缺少 EMP途径的 6-磷酸果糖激酶,不能利用 EMP途径,但
在基因组发现了包含几乎全部编码 Entner-Doudorf途径所需酶的基因,表明在该菌中,ED途径是主要的
葡萄糖利用途径。在 TCA循环中,催化苹果酸转化为草酰乙酸的苹果酸脱氢酶在其它假单胞菌属中普遍
存在,而在斯氏假单胞菌 A1501基因组中却未曾发现。在基因组中发现编码苹果酸:醌氧化还原酶[15]mqoB
基因(PST1102),该酶催化苹果酸转化为草酰乙酸,补偿 TCA循环中的关键中间体-草酰乙酸,使 TCA循环
变得完整。
2.1.1 ED途径 ED途径在革兰氏阴性菌中分布较广,是少数 EMP途径不完整的细菌,如一些假单胞菌
(Pseudomonasspp.)和一些发酵单胞菌(Zymomonas
spp.)等所特有的利用葡萄糖的替代途径。其特征
反应为 2-酮-3-脱氧-6磷酸葡萄酸裂解为丙酮酸和
3-磷酸-甘油醛,该反应的特征酶为 2-酮-3-脱氧-6
磷酸葡萄酸醛缩酶。基因组分析表明,在 A1501菌
中存在完整的 ED途径酶系。这些基因包括(见表
1):2个编码葡萄糖激酶的基因 glk(PST2443和
PST3499),两者氨基酸序列一致性为 63%;3个编
码 葡 萄 糖-6-磷 酸 脱 氢 酶 的 基 因 zwf(PST0182、
PST2329和 PST3497),这 3个基因之间氨基酸序列
的一致性达到 52%以上;2个磷酸葡萄糖酸内酯酶
的基因 pgl(PST2328和 PST3496)通过 Blast比对,两者氨基酸一致性为 70%,一个葡萄糖磷酸变位酶基因
edd(PST2444)和一个 2-酮-3-脱氧-6磷酸葡萄酸醛缩酶的基因 eda(PST2327)。序列分析表明 eda、pgl、zwf
在染色体上成簇排列,且转录方向相同,可能位于同一个操纵子。
2.1.2 HMP途径 磷酸戊糖途径是细胞产生还
原力 NADPH的主要途径,而且是细胞内不同结构
糖分子的重要来源,并为各种单糖的相互转变提
供条件,主要特征性酶为转酮酶和转醛酶。在
A1501中编码这 2个蛋白酶的基因分别为 epd
(PST3919)和 tktA(PST3920),(表 2)。在 A1501菌
中这两个基因紧密连锁且转录方向相同,可能位
于同一转录单元。
2.1.3 EMP途径 在 EMP途径中有 3步酶促反应是不可逆[16]。第 1个反应是已糖在 6-磷酸-已糖激酶催
化作用下形成 6-磷酸-葡萄糖,第 2个反应是 6-磷酸-果糖在磷酸果糖激酶催化作用下形成 1,6-二磷酸果
糖,第 3个反应是磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶催化作用下形成丙酮酸。在 A1501菌中没有发现磷酸果
糖激酶,只发现了编码果糖-1,6-二磷酸酶的基因 fbp(PST0324)(表 3),该酶可以催化 1,6-二磷酸果糖变
成 6-磷酸果糖。说明了斯氏假单胞菌 A1501不能利用 EMP途径进行葡萄糖的发酵。在 A1501菌中发现有
3个编码 3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因,这些基因的编码蛋白的氨基酸序列一致性达到 56.3%。
2.1.4 乙酰辅酶 A和草酰乙酸的生成 丙酮酸进入三羧酸循环途径之前需要转变为乙酰辅酶 A。乙酰辅
酶 A是许多物质生物合成的前体,它在微生物细胞内过剩时会积累转变成聚 β-羟基丁酸(PHB)。乙酰辅
表 1 A1501菌中参与 ED途径的基因
表 2 A1501中参与 HMP途径的基因
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酶 A聚合成为 PHB需要 3个关键酶的催化,在 A1501基因组中这 3个酶的编码基因分别是 phaA
(PST0684)、phaB(PST0685)和 phaC(PST0683)。phaA基因编码乙酰辅酶 A乙酰基转移酶,催化乙酰辅酶 A
转变成乙酰乙酰辅酶 A;phaB基因编码 3-氧酰基[酰基载体蛋白]还原酶,催化乙酰乙酰辅酶形成羟丁酰辅
酶 A,该产物在 phaC编码的聚羟基脂肪酸酯酶作用下,生成 PHB。A1501菌中 phaA、phaB和 phaC编码在
同一条链上,转录方向相同,可能位于同一个操纵单元。基因组序列分析还发现了编码磷酸烯醇式丙酮酸
羧基激酶的基因 pckA(PST0293),其产物可以催化磷酸烯醇丙酮酸直接变成草酰乙酸,草酰乙酸还可以在
基因 accC-2(PST0186)编码的差向异构酶作用下催化丙酮酸生成草酰乙酸。草酰乙酸和乙酰辅酶 A在柠
檬酸合成酶 gltA(PST1870)、prpC(PST2035)作用下,生成柠檬酸,进入 TCA循环。
2.1.5 TCA循环 A1501菌中 TCA循环的酶系不完整,缺乏催化苹果酸生成草酰乙酸的苹果酸脱氢酶
(表 4)。但是,A1501基因组中发现了一个编码苹果酸:醌氧化还原酶的基因 mqoB(PST1102)。该基因被认
为可参与 TCA循环中草酰乙酸的合成[15]。在乙酸存在条件下,A1501还可利用乙醛酸途径代谢乙酸,该途
径的关键酶苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶编码基因在中分别由基因 glcB(PST0435),glcB(PST3898)和
PST2311所编码。
表 4 A1501菌中参与 TCA循环的相关基因表 3 A1501菌中参与 EMP途径的基因
中心代谢途径具有分解代谢和合成代
谢的双重性。许多物质的生物合成都可利用
代谢途径的中间代谢产物作为前体来源。如
图 1所示,6-磷酸-果糖为色氨酸、酪氨酸、苯
丙氨酸和泛醌的合成提供了前体;磷酸戊糖
途径中的 5-磷酸核糖-α-焦磷酸为嘌呤、嘧
啶、组氨酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、叶酸及核
黄素合成提供前体;丙酮酸为丙氨酸、缬氨
酸和亮氨酸的合成提供了前体;3-磷酸-甘油
醛为丝氨酸、甘氨酸及半胱氨酸的合成提供
了前体。TCA循环中代谢产物谷酰胺和延胡
索酸分别为蛋氨酸、精氨酸和天冬酰胺、赖
氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸的合成提供了前体
物质。
图 1 A1501菌中心代谢途径模式图
箭头表示反应的方向,相应的酶的编码基因用该基因的编
号表示。虚线箭头表示该基因在 A1501菌中没有发现
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2.2 能量代谢
与 A1501菌的能量产生与转化相关的基因共有 252个。在 A1501菌的基因组上,发现了完整的呼吸酶
系统,参与能量产生与转化基因主要是氧化酶、脱氢酶和氧化还原酶类,包括 F0-F1型 ATP合成酶基因簇、
细胞色素 C氧化酶、黄素蛋白、NADH脱氢酶、泛醌还原酶、电子传递复合体蛋白、铁硫蛋白、细胞色素 b、
细胞色素 c;脱氢酶类主要包括:乙醇脱氢酶、醛脱氢酶、琥珀酸盐脱氢酶、琥珀酸半醛脱氢酶、3-磷酸甘油
脱氢酶等。另外,在 A1501菌基因组中,还发现该菌在厌氧环境下的一种电子呼吸传递系统-反硝化系统,
该系统在厌氧环境下以硝酸盐或者亚硝酸盐为电子受体,经一系列氧化还原反应产生电位梯度,最终产生
能量。
2.2.1 电子传递和氧化磷酸化 伴随电子从底物到氧的传递,ADP被磷酸化形成 ATP的酶促过程即是氧
化磷酸化作用。ATP的合成是由一个酶的复合体系完成的。这个符合体系称为 ATP合酶由 2个主要的单
元构成。起质子通道作用的 F0单元和催化 ATP合成的 F1单元。在斯氏假单胞菌基因组发现了编码完整的
ATP合成的 F0-F1蛋白通道的基因,分别为 atpC、atpD、atpG、atpA、atpH、atpF、atpE、atpB和 atpI(PST4190-
4198),这些基因成簇的排列,物理间距只有十几个到几十个核苷酸,可能为同一个转录单元。
呼吸链主要有 4部分蛋白质复合体组成,分别为 NADH-Q还原酶,琥珀酸-Q还原酶,细胞色素还原酶
和细胞色素氧化酶。呼吸链传递体传递电子载体及其顺序为:代谢物→NAD→NADH-Q还原酶→FADH2
(琥珀酸-Q还原酶)→UQ→细胞色素还原酶→细胞色素 C→细胞色素氧化酶→O2。NADH-Q还原酶的编码
基因为 ndh(PST3635、PST4206和 PST4209),完整的琥珀酸-Q还原酶包括了琥珀酸脱氢酶,编码该蛋白的
基因为 sdhA(PST1873)、sdhB(PST1874)、sdhC(PST1871)和 sdhD(PST1872)。A1501菌中存在完整的细胞色
素还原酶系和氧化酶系,编码还原酶系基因包括细胞色素还原酶 b基因 petB(PST1064),细胞色素 c1基因
petC(PST1065)和铁-硫簇基因还原酶基因 petA(PST1065),而编码细胞色素氧化酶 C的基因包括 coxB
(PST4163)、coxA(PST4164)、ctaG(PST4165)、coII(PST4166)、ccoP-1(PST1837)、ccoO-2(PST1839)、ccoP-1
(PST1841)、ccoO-2(PST1842)和 coxA(PST1850)。
此外,序列分析还发现在 A1501基因组中存在 3套紧密排列成簇的编码电子传递复合体(1个 Nqr和
2个 Rnf复合体)的基因,这些基因的功能未知,推测可能在固氮等特殊条件下起电子传递作用[17]。
2.2.2 无氧条件下呼吸作用-反硝化途径 斯氏假单胞菌 A1501是一种微好氧固氮菌,在无氮的半固体培
养基上生长和固氮良好[18]。此外,斯氏假单胞菌 A1501除了具有明显的固氮活性以外,在厌氧条件下该菌
还可以以乳酸为碳源,NH4+为惟一氮源进行反硝化作用,NO-为最终电子受体,接受无氧呼吸链传递的末端
电子,经 NO-等氮氧化物最终还原为 N2[19]。反硝化作用指在微生物作用下将化合态的氮转变为游离态氮气
的过程,从细胞的生物能学角度来讲反硝化作用是指细菌在无氧状态下进行呼吸作用的一种方式。在此过
程中氧化态的氮替代氧作为细胞膜上的电子传递受体,在一系列氧化还原酶的作用下,产生电位梯度,最
终将硝酸盐转变为氮气[20]。在好氧和厌氧条件下,低浓度的 N-对 A15菌的生长具有一定抑制作用,但 NH4+
的存在并不抑制细菌对 NO2-的利用,A15菌在厌氧条件下还具有需硝酸盐的固氮酶活性,当氧存在或者
NO2-代替 NO3-时,固氮活性均受到抑制。反硝化作用产生的 N2能为微好氧条件下的 A15菌所重新固定。燕
永亮[21]等人曾在 A1501基因组上鉴定了 4个反硝化相关的基因簇为 nar,nir,nor和 nos,共 40个基因。固氮
与反硝化是氮循环过程中截然相反的 2个现象,这种情况说明在 A1501的基因组中同时存在着固氮以及
反硝化 2套系统,这 2个系统的相互作用机制值得深入研究。
3 结论
截至目前,越来越多的微生物基因组被公布,其中已经由 14株假单胞菌的全基因组测序完成[15,22~28],
在固氮菌基因组研究方面,已经公布了 11株共生固氮菌[29~32],2株内生固氮菌[33~34]全基因组。斯氏假单胞菌
A1501是目前惟一一株完成基因组测序的联合固氮菌。迄今为止,水稻等禾本科作物尚不能像豆科植物那
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样进行自主固氮,联合固氮作用是解决禾谷类作物部分氮素来源的途径之一。斯氏假单胞菌 A1501基因组
的完成,为联合固氮的开发利用带来了光辉的前景,而利用斯氏假单胞菌 A1501基因组的注释来分析该菌
的中心代谢和能量合成途径,对于从整体上全面认识该菌的遗传、代谢网络以及固氮机制提供了最全面的
材料,为进一步开发利用固氮工程菌株提供最原始的数据。基因组学的研究,能帮助人们更好地了解生物
体中各种复杂的相互作用,生物对环境变化的响应;同时为进一步探索固氮菌与植物之间的互作机理,最
终能够开发一套高产低耗的微生物-植物互作的耕作体系提供理论依据。
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