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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
联合使用低剂量环磷酰胺有效增强热休克
蛋白 gp96免疫佐剂功能
刘振 1, 2 　崔玉东 1 　孟颂东 2
(1 黑龙江八一农垦大学 ,大庆 163319; 2 中国科学院微生物研究所 病原微生物与分子免疫中心院重点实验室 , 北京 100101)
　　摘 　要 : 　前期研究发现热休克蛋白 gp96作为分子伴侣 ,能特异结合乙肝病毒 (HBV )表位肽 ,并将结合的多肽交叉呈递
给 MHCⅠ类分子 ,从而激活病毒特异性 CD8 + T细胞 (CTL )。在此基础上 ,研究 BALB /c小鼠模型联合低剂量环磷酰胺 ( cy2
clophospham ide, CTX)对热休克蛋白 gp96免疫佐剂功能的影响。以 gp96或其 N端片段 (N355)与 H22Kd限制的乙肝病毒核心
蛋白表位 HBcAg87295作为佐剂联合低剂量 CTX免疫 BALB /c小鼠。联合使用低剂量 CTX的试验组 CD8 + T细胞、IFN2γ+ CD8 +
T细胞、乙肝抗原特异 T细胞比例显著高于未使用 CTX的对照组 ( P < 0105) ,且联合使用 CTX的试验组 CD4 + CD25 +调节性 T
细胞 ( T Regulatory Cells , Treg )比例显著低于单独使用 gp96和 N355试验组 ( P < 0105) ,说明低剂量的 CTX能特异性抑制 Treg
从而导致 T细胞的增加。以上研究表明联合使用低剂量的环磷酰胺能有效增强 gp96免疫佐剂功能 ,这为进一步优化 gp96佐
剂疫苗的使用提供了依据。
关键词 : 　环磷酰胺 　热休克蛋白 gp96　N355　乙肝病毒表位
Enhanced Adjuvant Effect of Heat Shock Prote in gp96 by
Low2dose Cyclophospham ide Treatment
L iu Zhen1, 2 　Cui Yudong1 　Meng Songdong2
(1 Heilongjiang August First Land Reclam ation University, Daqing 163319; 2 Institute of M icrobiology, Chinese Academ y of Sciences , B eijing 100101)
　　Abs trac t: 　 In this study, the effect of low2dose cyclophospham ide (CTX) treatment on adjuvant function of gp96 in BALB /c m ice
model was investigated1 BALB /c m ice were vaccinated with an H22Kd restricted ep itope HBcAg87295 and gp96 or itsN2term inal fragment
(N355) as adjuvant along with low2dose CTX treatment1 There was a significantly higher number of pep tide2specific CTL and total
CD8 + T cells in CTX treated than untreated m ice ( P < 0105) 1Further studies showed that CTX treated m ice had lower frequencies of
CD4 + CD25 + regulatory T cells ( Tregs ) than untreated m ice, indicating that inhibition of Tregs by CTX treatment may lead to increase of
T cells1 The results suggested that adjuvant function of gp96 can be greatly enhanced by co2adm inistration of low2dose CTX, which may
p rovide basis for op tim ization of gp962based vaccines1
Key wo rds: 　Cyclophospham ide　Heat shock p rotein gp96　N355　Hepatitis B vivus ep itopes
收稿日期 : 2009203220
基金项目 :国家“863”项目 (2006AA02A241) , 国际合作课题 (2007DFC30240)
作者简介 :刘振 (19832) ,男 ,在读硕士研究生 ,从事乙肝病毒的细胞免疫研究 ; E2mail: liuzhentt@ yahoo1com1cn
通讯作者 :崔玉东 , E2mail: cuiyudong@yahoo1com , Tel: 01026819290;孟颂东 , E2mail: mengsd@ im1ac1cn, Tel: 010264807350　　热休克蛋白 ( heat shock p rotein, HSP)是一类高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质 [ 1 ]。gp96是内质网 HSP90家族的代表 ,与细胞质 HSP90高度同源 , gp96是膜型表达蛋白的伴侣分子 ,同时在天然和获得性免疫中也具有重要的作用。在获得性免疫中 , gp96通过抗原的交叉呈递作用诱发机体抗 原特异的细胞毒免疫应答 (CTL )。而在天然免疫中 ,gp96则通过刺激抗原呈递细胞 (DC)和 T细胞产生各种细胞因子激活免疫系统。本实验室多年来致力于研究热休克蛋白在乙肝病毒 (HBV )感染中的免疫机制研究。Meng等 [ 2 ]从感染乙肝的肝癌患者肝细胞中分离到了乙肝核心抗原相关的 7肽 YVNTNMG,这
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
启发进行 HBV慢性感染过程中 gp96免疫调节机制
的研究 [ 3 ]。L i等 [ 4, 5 ]的试验证明鼠源 gp96的 N端片
段能诱发 HBV特异 CTL并刺激 HBV抗体产生 ,具有
佐剂功能。
环磷酰胺 ( cyclophospham ide, CTX)是一种最常
用的化疗药物 ,广泛应用于多种癌症的治疗 [ 6, 7 ] ;同
时也是一种免疫抑制剂 ,可用于自身免疫病的治疗。
虽然 CTX具有免疫抑制作用 ,近来研究显示低剂量
的 CTX通过特异性的抑制调节性 T细胞 ( Treg )而发
挥其抗肿瘤功能 [ 8 ] ,但 CTX是否可增强机体抗原特
异的 T细胞免疫应答 ,特别是增强热休克蛋白 gp96
的免疫佐剂功能方面目前国内外研究甚少。因此 ,
本研究采用低剂量 CTX和热休克蛋白 gp96及其 N
端片段联合使用免疫 BALB /c小鼠 ,观察 CTX对热
休克蛋白 gp96免疫佐剂功能的影响 ,探讨热休克蛋
白 gp96作为天然免疫佐剂 ,为进一步优化以热休克
蛋白 gp96为佐剂的 HBV治疗提供依据。
1　材料和方法
111　材料
11111　菌株和质粒 　用 pET30a2hgp96全长质粒由
Srivastava PK博士惠赠。GST融合表达载体 pGEX2
6p21,大肠杆菌 DH5α、BL21 (DE3)本室保存。GST
融合的鼻病毒 3C蛋白酶 (以下简称 GST23C,与 Pre2
ScissionTM蛋白酶识别相同的氨基酸序列 )由 Hudson
K和 Heat J博士惠赠。
11112　主要试剂 　CTX为江苏恒瑞医药股份有限
公司产品 ,蛋白纯化试剂系列试剂 (略 ) ,蛋白质鉴
定试剂 (略 ) ,多肽 HBcAg87295 SYVNTNMGL 由上海
吉尔生化公司合成 ; PerCP2Cy5152anti2CD3; F ITC2an2
ti2CD8; APC2anti2IFN2γ; PE2Cy72anti2CD4; PE2anti2
CD25均购自 eB ioscience公司。羊抗兔 gp96单克隆
抗体购自 Santa Cruz公司。其它试剂购自 Sigma公
司。流式细胞仪为 BD公司产品。
112　方法
11211　gp96的制备及 W estern blot鉴定 　小鼠肝
组织标本 ,参照 Meng等 [ 9 ]的三步提取 ,纯化 ,最终
提纯出目的蛋白。用此方法获得较纯的分子量为
96 kD 的蛋白质。同时用 gp96 单抗进行 W estern
blot鉴定。
11212　表达载体的构建 　根据 GenBank ( gi: 1503
0323)中鼠 gp96全长基因序列设计引物 , PCR扩增
N2末端 22～377 aa的肽段 ,引物设计中两端分别加入
酶切位点 B am H I、Xho I,待克隆之用。用菌落快速鉴
定法和双酶切法初步鉴定阳性克隆。所得阳性克隆
最后经 DNA测序 ,序列完全正确 ,重组质粒命名为
pGEX2N355。根据 DNA star软件设计引物 ,上游引
物 : 5′2CGC GGA TCC GAC GAT GAA GTT GAT GTG
GAT23′;下游引物 : 5′2 CCG CTC GAG TTA AGT AAA
GTG AAT ATA AGC CATG23′。
11213　融合蛋白的表达 ,纯化及 W estern blot鉴定
　DNA测序后将正确的重组质粒 pGEX2N355分别
转化大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞 , 在 37℃条
件下培养至 OD600值 016～110时加入终浓度为 1
mmol/L的 IPTG, 25℃诱导 6 h后收集菌体。超声破
碎后 ,收集上清在 4℃下流经 Glutathione2Sepharose
4B亲和层析柱 ,得到的融合蛋白 GST2N355用 GST2
3C蛋白酶切 ,并通过 Glutathione2Sepharose 4B亲和
层析柱去除 GST。得到较纯的约 48 kD蛋白 ,同时
进行 W estern blot鉴定。
11214　小鼠免疫和淋巴细胞的制备 　北京大学医
学部动物实验中心提供 BALB /c小鼠 ,雌性 , 6～8
周龄。按每组 6只随机分成 5组 : PBS与多肽组 ,
gp96与多肽免疫组 , CTX与 gp96及多肽免疫组 ,
N355与多肽免疫组 , CTX与 N355及多肽免疫组。
小鼠皮下注射 CTX ( 4 mg/m l) , gp96 ( 10μg) , N355
(10μg)和多肽 (10μM ) ,经免疫 3次。在最后一次
免疫后第 7 d分离脾脏细胞。脾脏用注射器芯研磨
分散成单细胞 ,并将细胞悬液经细胞筛滤过。红细
胞用 0183%的氯化铵裂解液裂解。脾脏细胞洗涤
后 ,重悬在细胞培养基 RPM I1640中。脾脏细胞在
含有 10% FCS,巯基乙醇和抗生素的 RPM I21640培
养基中用多肽刺激 7 d。
11215　流式细胞仪分析 　脾脏细胞中加入荧光标
记抗体 ,用 Cell Quest软件在流式细胞仪上分析 ,收
集 1 ×105 个细胞。
11216　Tetramer的制备和流式细胞仪分析 　Refold2
ing试验参照 Ogg和 A tlman [ 10, 11 ]描述的方法。简言
之 , 小鼠 MHC重链 H22Kd 和轻链 (β2 2m icroglobulin,
β2M) 在应用原核表达系统在大肠杆菌中表达 (pET;
R&D System s, Inc1, M inneapolis, MN ) ,从包含体中
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2009年第 6期 　　　　刘振等 :联合使用低剂量环磷酰胺有效增强热休克蛋白 gp96免疫佐剂功能
纯化两种蛋白 ,其中重链分子的羧基端添加了生物素
化位点。蛋白和多肽用透析的方法共折叠。应用
FPLC分离纯化得到 45 kD产物 , B irA酶将生物素连
接到 refolding产物上 ,按 1∶4的摩尔比将连接有 PE
的亲和素与生物素化的 refolding产物混合。将 Tet2
ramer产物浓缩到 1 mg/m l,在脾脏细胞中加入 3μl
孵育 30 m in, 然后加入 FITC2anti2CD8 和 PerCP2
Cy5152anti2CD3。用 Cell Quest软件在流式细胞仪上
分析。淋巴细胞限定在分析 CD3+ 、CD8 +和 Tetram2
er
+的细胞群 ,收集大于 1 ×105 的细胞。
11217　统计分析 　实验为独立重复 3次的结果 ,并
且每组 6只小鼠 ,使用 t检验计算组间差异 , P <
0105为显著性差异。
2　结果
211　SDS2PAGE及 W estern blot鉴定纯化的 gp96及
其氨基端片段 N355
用 10% SDS2PAGE分析显示蛋白大小为 96 kD
和 48 kD (图 1) ,并且用羊抗兔 gp96单克隆抗体鉴
定条带为 gp96及 N355蛋白。
A　1～41收集的 gp96洗脱峰进行 SDS2PAGE凝胶电泳 ; 51W estern
blot结果
B　11收集的 N355洗脱峰进行 SDS2PAGE凝胶电泳 ; 2:W estern blot
结果
图 1　热休克蛋白 gp96及其 N2末端 ( N355)蛋白的鉴定
212　流式分析小鼠脾脏 CD8 + T细胞
免疫后小鼠脾脏细胞用 F ITC2anti2CD8和 Per2
CP2Cy5152anti2CD3抗体染色 (图 2)。图 2中数字
代表 CD8 + T细胞在脾细胞中的比例。PBS与多肽
组 , gp96与多肽免疫组 , CTX与 gp96及多肽免疫组
(图 22A ) , N355与多肽免疫组 , CTX与 N355及多肽
免疫组 (图 22B )脾脏 CD8 + T细胞占脾细胞百分比
分别为 ( 13192 ±1189 ) %、( 17129 ±1101 ) %、
(22171 ±0173 ) %、( 15152 ±0193 ) %、( 19139 ±
1116) %。联合使用低剂量 CTX与热休克蛋白试验
组 CD8 + T细胞显著高于单纯使用热休克蛋白 gp96
为佐剂试验组 ( P < 0105) (图 22C)。
A1gp96与多肽混合物免疫 BALB /c,脾脏细胞中 CD8 + T细胞数量 ;
B1N355与多肽混合物免疫 BALB /c,脾脏细胞中 CD8 + T细胞数量 ;
C1CTX处理组脾脏细胞 CD8 + T细胞变化 ( P < 0105)
图 2　低剂量环磷酰胺与 gp96佐剂疫苗联合
使用时 CD8 + T细胞数量变化
213　流式分析小鼠脾脏 IFN2γ+ CD8 + T细胞
图 3　CTX处理组脾脏细胞 IFN2γ+ CD8 + T细胞变化
免疫后小鼠脾脏细胞用 APC2anti2IFN2γ, F ITC2
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
anti2CD8和 PerCP2Cy5152 anti2CD3抗体染色。图 3
中数字代表 IFN2γ+ CD8 + T细胞在 T细胞中的比
例。PBS与多肽组 , gp96 与多肽免疫组 , CTX 与
gp96及多肽免疫组 , N355与多肽免疫组 , CTX与
N355及多肽免疫组脾脏分泌 IFN2γ+细胞占 T细胞
百分比分别为 ( 0103 ±0116) %、( 0146 ±0108) %、
( 0195 ±0109 ) %、 ( 0123 ±0104 ) %、 ( 0157 ±
0107) % ,联合使用低剂量 CTX的试验组 IFN2γ+
CD8 + T细胞比例显著高于单独使用 gp96和 N355
的试验组 ( P < 0105) (图 3)。
214　小鼠脾脏 Tetramer+的 T细胞数目变化
A1gp96与多肽混合物免疫 BALB /c,脾脏细胞中 Tetramer+ T细胞数
量 ; B1N355与多肽混合物免疫 BALB /c,脾脏细胞中 Tetramer+ T细
胞数量 ; C1CTX处理组脾脏细胞中 Tetramer+ T细胞变化 ( P < 0105)
图 4　环磷酰胺对 gp96佐剂疫苗引发的病毒
特异 T细胞反应的影响
免疫后小鼠脾脏细胞用 Kd /β2 m /92mer tetram2
er、F ITC2anti2CD8 和 PerCP2Cy5152anti2CD3 抗体染
色。图 4中数字代表 Tetramer+的 T细胞在 T细胞
中的比例。PBS与多肽组 , gp96与多肽免疫组 , CTX
与 gp96及多肽免疫组 (图 42A ) , N355与多肽免疫
组 , CTX与 N355及多肽免疫组 (图 42B )脾脏 Tet2
ramer
+的 T细胞数目占 T细胞百分比分别为 (0103
±0102 ) %、( 0187 ±0106 ) %、( 218 ±0119 ) %、
(0152 ±0110) %、( 1150 ±0109) % ,热休克蛋白免
疫组脾脏 Tetramer+的 T细胞数目显著高于对照组
( P < 0105) ,联合使用低剂量 CTX的试验组 Tetram2
er
+的 T细胞比例显著高于单独使用 gp96和 N355
的试验组 ( P < 0105) (图 42C)。
215　小鼠脾脏 CD4 + CD25 + Treg细胞数量变化
A1gp96与多肽混合物免疫 BALB /c,脾脏细胞中 Treg细胞数量 ;
B1N355与多肽混合物免疫 BALB /c,脾脏细胞中 Treg细胞数量 ; C1
低剂量 CTX处理组脾脏细胞中 Treg变化 ( P < 0105)
图 5　低剂量环磷酰胺对 Treg影响
免疫后鼠脾细胞用 PE2Cy72anti2CD4和 PE2anti2
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2009年第 6期 　　　　刘振等 :联合使用低剂量环磷酰胺有效增强热休克蛋白 gp96免疫佐剂功能
CD25抗体染色。图 5中数字代表 CD4 + CD25 + Treg
细胞在 T细胞中的比例。PBS与多肽组 , gp96与多
肽免疫组 , CTX与 gp96及多肽免疫组 (图 52A ) ,
N355与多肽免疫组 , CTX与 N355及多肽免疫组
(图 52B )脾脏 CD4 + CD25 +数目占 T细胞百分比分
别为 ( 4160 ±0147 ) %、( 3147 ±0128 ) %、( 2171 ±
0134) %、( 3188 ±0117) %、( 2186 ±0170) % ,联合
使用低剂量 CTX的试验组 CD4 + CD25 + Treg细胞比
例显著低于单独使用 gp96和 N355的试验组 ( P <
0105) (图 5)。说明低剂量的 CTX能有效降低小鼠
Treg的数量。
3　讨论
MHC I类分子限制性的多肽表位可以增强抗原
特异的 CTL反应 ,如果没有佐剂 ,单独的多肽表位
免疫原性较低 [ 12 ]。目前 ,铝盐仍是临床上广泛使用
的佐剂 ,研究表明尽管铝盐佐剂能有效激发体液免
疫 ,提高抗体产生水平 ,但并不能有效激发 T细胞
免疫应答。而 T细胞免疫在抗病毒感染中发挥关
键作用。目前 ,以肽疫苗免疫时所使用的 T细胞佐
剂或者剂量大 ,或者毒性高 ,以至于人难以接受。因
此本研究用组织提取的 gp96及原核表达的其 N端
片段与多肽分别免疫 BALB /c小鼠 , gp96可以促进
HBV表位特异的 CTL产生 , gp96的 N端也具有类
似的佐剂功能。此外 ,打破 CD8免疫耐受 ,不仅需
要成熟 DC,还需要 Toll样受体配体持续刺激 DC细
胞克服 CD4 + CD25 + Treg介导的免疫抑制 [ 13 ]。最近
研究表明 ,对于 Toll样受体发挥免疫功能起关键作
用 [ 14 ]。基于 gp96的免疫学特点 ,它为抗病毒感染
的免疫治疗提供了更加有效的途径。
近年研究显示高剂量的 CTX可以通过影响免
疫系统的功能而发挥其免疫抑制作用 ,广泛应用于
自身免疫病和移植排斥反应的治疗 ;但低剂量的
CTX却可增强机体免疫功能 [ 15, 16 ]。本研究结果发
现 ,联合使用低剂量的 CTX和 gp96及其末端片段
N355能够明显增强小鼠机体的 CTL s的产生 ,而
CTL s数量会明显增强。利用流式细胞仪分析小鼠
脾脏 CD4 + CD25 + Treg细胞 ,发现联合使用低剂量
CTX试验组 CD4 + CD25 + Treg细胞数目比例显著低
于较单独使用 gp96及其末端片段组 ,因此认为低剂
量 CTX引发的 CD4 + CD25 + Treg细胞下降是导致
CTL功能增 ,为更有效地治疗乙肝及肿瘤提供强有
利的理论依据。
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