全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
大豆花叶病毒 CP基因原核表达与抗血清制备
陈文华 1 　韦传宝 1, 2 　贾玉成 1 　祁伟 1
(1皖西学院化学与生命科学系 ,六安 237012; 2安徽省植物生物技术实训中心 ,六安 237012)
　　摘 　要 : 　根据已报道的大豆花叶病毒 ( SMV)序列设计引物 ,扩增 SMV的外壳蛋白 (CP)基因 ,序列同源性分析结果表
明 ,与目前已报道的 SMV不同分离物 CP基因核苷酸序列同源性为 85. 0% ～96. 8% ,相应推测的氨基酸序列同源性为
8719% ～9819%。将 CP基因插入原核表达载体 pSBET后在大肠杆菌 BL21 (DE3) Plys S中诱导表达。通过 12% SDS2PAGE
和 5% ～20%梯度 SDS2PAGE两次制备电泳纯化诱导产物 ,免疫家兔获得抗 CP血清 ,W estern blot分析对 CP具有高度特异
性。硫酸铵沉淀法与 Protein A2Red Sepharose亲和层析相结合提取 IgG,获得效价达 1∶3 800的一抗 ,可用于田间 SMV病样
检测。
关键词 : 　大豆花叶病毒 　CP基因 　原核表达 　抗血清制备
Prokaryotic Expression of SM V CP Gene and Preparation of
the Antibody Aga inst CP
Chen W enhua1 　W ei Chuanbao1, 2 　J ia Yucheng1 　Q i W ei1
(1 Departm ent of Chem istry and L ife Science, W estern Anhui University, L iuan 237012;
2 P lant B iotechnology Training Centre of Anhui P rovince, L iuan 237012)
　　Abs trac t: 　Specific p rimer was designed to amp lify SMV CP gene. The CP gene was then inserted into pSBET and exp ressed in
Escherichia coli BL21 (DE3) p lys S strain. It shared 85. 0% ～96. 8% nucleotide acids identities and 87. 9% ～98. 9% am ino acids i2
dentities with the sequences of CP genes isolates reported in the world. The object p rotein was purified by 12% SDS2PAGE firstly and
subsequently 5% ～20% gradient SDS2PAGE. The antiserum against the CP was raised in rabbit and its specificity was confirmed by
W estern blot analysis. IgG against SMV2CP was purified by ammonium sulfate sedimentation and p rotein A2Red Sepharose affinity
chromatography and antiserum with value of 1∶3 800 was obtained. The IgG p repared in this study could be suitable for SMV detec2
tion.
Key wo rds: 　Soybean m osaic virus　CP gene　Prokaryotic exp ression　Antiserum p reparation
收稿日期 : 2009204216
基金项目 :安徽省植物生物技术实训中心项目
作者简介 :陈文华 (19872) ,男 ,安徽安庆人 ,研究方向 :分子生物学 ; E2mail: chenwenhua0506@ sina. com
通讯作者 :韦传宝 (19612) ,男 ,副教授 ,博士 ; E2mail: weichuanbao@ sina. com　　大豆花叶病毒 ( S oybean m osa ic, SMV ) ,是马铃薯 Y病毒属 ( Potyvirus)成员。早在 1915年美国就对其病害进行了首次报道 , Gardner和 Kendrick于1921年将病原描述为 SMV [ 1 ] , Cho和 Goodman于1979年在美国首次鉴定了 SMV 7个株系 ( G1～G7) [ 2 ] ,我国已经完成了 SMV多个株系鉴定和区分 [ 3～8 ] 。该病毒在世界所有大豆产区普遍发生 ,会引起大豆植株矮化、叶片皱缩、花叶、顶枯、种粒斑驳等症状。我国 SMV病害也普遍发生 ,一般造 成病田减产 10% ～30% ,严重影响大豆的产量和质量 [ 9 ] 。SMV病毒基因组由单链正链 RNA 组成 ,长约 10 000个核苷酸 ,其编码的多聚蛋白经酶解后产生 10个成熟蛋白 ,从 N 端到 C端分别为 P1、HC2Pro、P3、6 K1、C I、6 K2、N Ia2V Pg、N Ia2Pro、N Ib和 CP[ 10 ] 。CP分子研究在马铃薯 Y病毒组中居多 ,一是可根据 CP基因的同源性来鉴定病毒或株系间的亲缘关系 ,另外利用病毒 CP进行抗病
2009年第 10期 陈文华等 :大豆花叶病毒 CP基因原核表达与抗血清制备
毒基因工程亦被认为是一最佳途径。本试验报
道 SMV六安分离物 CP基因的克隆与表达 ,制备
特异性抗 CP血清 ,为研制 SMV检测试剂盒打下
基础。
1　材料和方法
1. 1　材料和试剂
从六安市郊区采集有明显花叶病症的大豆
叶 ,置 - 80℃冰箱保存。大肠杆菌 ( Escherich ia co2
li) TG1菌株和表达用菌株 BL21 (DE3 ) pLys S为
Pharmacia产品 ; pGEM 2T、pSBET载体购自 Promega
公司 ; T4 DNA 连接酶、Ex Taq DNA聚合酶、N de I、
B am H I、R ibonuclease H ( RNase H )、R ibonuclease
Inhibitor、AMV Reverse Transcrip tase、DNA L igation
Kit ver. 2购自 TaKaRa公司 ; GeneRulerTM 1 kb DNA
Ladder购 自 MB I公 司 ; Protein A 2Red Sepharose
( H igh Capacity ) 购 自 B ioword 公 司 ; SDS2PAGE
M iddle Range Protein Molecular W eight Standards购
自 Gibco公司 ; 羊抗兔 IgG (碱性磷酸酶共价结
合 )、52溴 24 氯 23 吲哚磷酸 (BC IP) 和氮蓝四唑
(NBT)购自 Sigama公司 ;其它化学试剂均为分析
纯以上进口产品分装。引物合成与序列测定由上
海生工完成。
1. 2　病叶总 RNA提取与 cDNA合成
按照 RNeasy Plant m ini(Q IAGEN)试剂盒提供的
方法提取的 RNA置 - 80℃保存。逆转录采用禽源逆
转录酶体系 ,以其为模板 M42T(5′2GTT TTC CCA GTC
ACG AC (T) 1523′)为起始引物 , 20μl反应体系包括 :
10. 5μl模板 RNA (含 RNA 10 ng～1. 2μg) ; 2. 0μl
起始引物 (100μmol/L) ; 410μl 10 ×逆转录反应缓冲
液 ; 210μl 10 mmol/L dNTPs; 015μl Rnasin ( 40 U /
μl) ; 1μl AMV (5 U /μl)。42℃水浴合成 115 h后加
40μl灭菌水 ,振匀后存入 - 30℃备用。
113　原核表达载体的构建和外源基因的诱导表达
根据周雪平等 [ 11 ] 报道的 SMV CP 序列设计
SMV表达引物对。
SMV2CPe ( + ) : 5′2CATATGTCAGGCAAGGAGA2
AGGAA23′
SMV2CPe ( - ) : 5′2TTTATTACTGCGGTGGGC2
CCATGCC23′
为了便于 CP基因的克隆和基因表达 ,在 5′端
引物中引人了起始密码子 ATG和 N de I位点 ,预期
的目的片段长度为 850 bp左右。以病样第一链 cD2
NA为模板 , PCR 扩增采用 LA Taq DNA 聚合酶
( TaKaRa公司 ) ,反应体系参照厂家说明。 PCR扩
增分离物全长 SMV CP基因 ,预期大小的扩增产物
经 1% (w / v)琼脂糖凝胶电泳分离后 ,用 Q IAquick
Gel Extraction试剂盒回收 ,方法参照厂家说明。纯
化产物导入 pGEM 2T载体 ,转化 TG1菌 ,蓝白斑筛
选 ,提取阳性克隆质粒 , PCR 检测后测序。将含
SMV CP基因的质粒用 N de I和 B am H I双酶切后
插入到同样双酶切的原核表达载体 pSBET中 ,在
大肠杆菌 BL21 (DE3 ) p lys S菌株中用 IPTG诱导
表达目的基因 , SDS2PAGE后用考马斯亮蓝 G2250
染色检测蛋白表达情况。
114　抗血清的制备和 W estern blot分析
将能正确表达外源基因的大肠杆菌经裂解后与
2 ×SDS上样缓冲液按 1∶1 ( v / v)混合 ,煮沸变性后
用 12%的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ,电泳完毕
后用 0125 mol/L KCl溶液染色。切下的目的蛋白
条带用适量 1 ×SDS上样缓冲液匀浆后离心 ,上清
液用 5% ～20%梯度 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离 ,电泳完毕后用 0125 mol/L KCl溶液染色并切下
目的蛋白条带 ,将含目的蛋白的凝胶磨细后免疫家
兔 ,共免疫 4次 ,前 3次间隔 7 d,第 4次免疫 3 d后
断头取血。用提纯的病毒直接免疫家兔制备抗天然
SMV病毒颗粒血清 ,方法类似。W estern blot法检测
抗 CP血清的特异性 ,一抗为原核表达制备的抗血
清 ,二抗为羊抗兔 IgG (碱性磷酸酶共价结合 ) ,
BC IP /NBT显色 [ 12 ]。
115　 IgG纯化与抗体效价测定
先用 (NH4 ) 2 SO4沉淀法初步提取抗血清中 IgG,
然后使用 Protein A2Red Sepharose (H igh Capacity)进
一步提取的 IgG,具体操作按照说明书进行。亲和
层析洗脱后的 IgG经过浓缩、对 PBS透析、再浓缩后
与甘油按照 1∶1混合 , - 20℃保存。间接 EL ISA法
测定制备的抗 SMV CP一抗的效价 [ 13 ]。
116　田间样品的间接 EL ISA法检测
分别用原核表达制备的抗 SMV CP血清与采集
的大豆病叶进行间接 EL ISA检测 [ 14 ] ,被测样品孔吸
光度值 /阴性样品孔吸光度值 ( P /N ) ≥211判断为
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
阳性 ,比较两种抗血清检测结果的异同。
2　结果
211　SMV CP基因的克隆
用引物对 SMV2CPe ( + ) /SMV2CPe ( - )从病样
cDNA中扩增到 850 bp大小的预期片段 (图 1)。纯
化产物导入 pGEM2T载体 ,转化 TG1菌 ,测序并对序
列进行 B last分析表明克隆的基因为 SMV CP基因。
M. Marker DL 2000; 1. SMV2CP基因 RT2PCK扩增产物
图 1　SM V CP基因 RT2PCR扩增产物
琼脂糖凝胶电泳分析
212　序列分析
BLAST分析结果表明 , SMV六安分离物 CP基
因由 795个碱基组成 ,编码 265个氨基酸 ,与目前已
报道的 SMV不同分离物 CP基因核苷酸序列同源
性为 8510% ～9618% ,相应推测的氨基酸序列同源
性为 8719% ～9819%。
213　 SMV CP基因的原核表达
SMV CP经 B am H I和 N de I双酶切后插入到
pSBET原核表达载体 , 转化的大肠杆菌 BL21
(DE3) LysS菌经 IPTG诱导表达。 SDS2PAGE检测
表明 ,诱导产生 1个大小为约 33 kD的特异性表达
条带 ,与计算机推测的 SMV 2CP分子量大小基本一
致 (图 2)。
214　抗血清的 W estern blot检测
W estern blot分析表明 ,原核表达制备的抗血清
能与诱导产物起特异性反应 ,与菌体自身蛋白几乎
无反应 (图 3)。
215　 IgG提取与试剂盒的制备
每只家兔抗血清经过纯化制备约 7 m l一抗 ,与
甘油按照 1∶1混合获得效价 1∶3 800的一抗。试剂
盒中的二抗为分装的 Sigma公司生产的羊抗兔二抗
(效价 1∶5 000, IgG与碱性磷酸酶共价结合 )。将
015 m l一抗、20μl二抗和 500 mg 42硝基苯基磷酸
二钠盐 ( p2NPP)组成 SMV 检测试剂盒 ,可以检测
100个样品。
001
2009年第 10期 陈文华等 :大豆花叶病毒 CP基因原核表达与抗血清制备
3　讨论
病毒特异性抗血清制备最直接的方法是分离纯
化病毒 ,加佐剂后直接免疫动物。但侵染一种植物
的病毒往往有几种 ,且形态相似 ,导致分离的病毒往
往是几种病毒的混合物 ,制备的抗血清特异性较差。
通过纯化原核表达的外壳蛋白制备抗血清简便 ,而
且特异性强 ,但 SDS2PAGE制备电泳纯化外壳蛋白 ,
CP的空间结构被破坏 ,制备的抗体与抗原的结合是
序列特异性的结合 ,有时用此方法制备的抗体与病
毒粒子不能结合 ,导致不能用于间接 EL ISA检测。
本研究制备的抗血清检测病叶结果验证了能够与天
然病毒结合。
大豆花叶病毒是一种世界性大豆病害 ,尤其在
亚洲病害较重 ,严重影响大豆的产量和品质 ,选育大
豆无毒种子或者低感染率种子对提高大豆产量有现
实意义。从很多样本中才能筛选出个别无毒苗 ,如
果用 RT2PCR 的方法检测人力和物力的消耗都很
大 ,有了 SMV检测试剂盒可以方便、经济地对大量
样本进行筛选。
参 考 文 献
1　 GardnerMW , Kendrick JB1J Agr Res, 1921, 22: 123～1241
2　 Cho EK, Goodman RM. Phytopathol, 1979, 69: 467～470.
3　濮祖芹 ,曹琦 ,房德纯 ,等. 植物保护学报 , 1982, 9 (1) : 15～19.
4　 许志刚 , Goodman RM, Polston JE. 南京农学院学报 , 1983, 3:
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5　尚佑芬 ,赵玖华 , 杨崇良 , 等. 植物病理学报 , 1999, 29 ( 2 ) :
115～119.
6　郭东全 ,智海剑 ,王延伟 ,等. 大豆科学 , 2006, (3) : 218～221.
7　黎昊雁 ,陈炯 ,陈剑平. 科技通报 , 2003, (02) : 90～93.
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12　萨姆布鲁克 J,沸里奇 EF,曼尼阿蒂斯 T,分子克隆实验指南. 北
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北京 :科学出版社 , 1998, 213～234.
(上接第 91页 )
25　高松洁 ,郭天财 ,吴雪峰 ,等. 河南农业大学学报 , 2002, 36 ( 4 ) :
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