全 文 ：中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2008, 28( 2): 96~ 100
侵染落葵的黄瓜花叶病毒分离物 CP基因序列分析*
牛立霞 牛胜鸟 王健华 刘志昕**
(中国热带农业科学院热带生物技术研究所 热带作物生物技术国家重点实验室 海口 571101)
摘要 通过间接酶联免疫法 ( ID-ELISA)检测到染病落葵病样中存在黄瓜花叶病毒 ( cucumber
mosaic virus, CMV)。从病叶中提取总 RNA, 用 RT-PCR方法扩增得到 657bp的 CMV CP基因片
段,将扩增产物与 T载体连接并进行测序。用 DNAMAN将得到的 CP基因序列与 GenBank收录
的黄瓜花叶病毒两亚组部分株系或分离物的 CP基因序列进行比较, 结果表明该 CP基因与 CMV
亚组 Ñ、亚组Ò 之间的核苷酸序列同源性分别为 91. 17% ~ 95. 43%和 75. 30% ~ 75. 76% ,推导氨
基酸序列同源性分别为 95. 41% ~ 97. 71%和 81. 28% ~ 81. 74% ,表明 CMV-Ba与亚组 Ñ 同源关
系密切。
关键词 落葵 黄瓜花叶病毒 CP基因 序列分析
中图分类号 Q78
收稿日期: 2007-10-12 修回日期: 2007-11-23
* 国家 /十一五 0科技支撑计划资助项目 ( 2007BAD48B01)
** 通讯作者,电子信箱: tpmvp lab@ 163. com
落葵 (Basella rubra L. ) 属落葵科植物,为一年生
藤本植物,俗名木耳菜、藤菜、承露、胭脂菜、御菜等, 在
我国各地均有栽培, 亚洲其它地区、非洲、美洲也有分
布 [1 ]。落葵不仅具有质地嫩滑、味道鲜美、营养丰富等
特点,而且还具有一定的清凉解热、解毒缓泄功能, 可
算是一类药菜两用的蔬菜, 深受广大人民的青睐, 而且
成为宾馆饭店餐桌上具有新口味的高档蔬菜 [2 ]。
但在生产过程中,无论采用何种栽培模式, 落葵都
或轻或重受到多种病害的危害。已见报道的有顶套菌
属 [3 ]、炭疽菌属和叶点霉属 [2]、尾孢属 [2, 4~ 7 ]、琏格孢属
和色二孢属 [8 ]以及短小杆菌属 [ 9]真菌引起的叶斑病,
腐霉属真菌引起的霜霉病 [ 2, 6], 葡萄孢属真菌引起的灰
霉病 [2, 5, 6],根结线虫引起的根结线虫病 [ 10 ],而落葵病
毒病,仅见 2006年 Huang等 [ 11 ]报道马铃薯 Y病毒引起
的皱缩花叶病。这些病害严重影响了落葵的品质和产
量,制约了农民栽培的积极性。其中, 近几年落葵花叶
病发生普遍,种植效益随之下降。为了确定海南落葵
花叶病的病原,为以后的防治工作打下基础, 作者从症
状为全株发病,叶片变小皱缩,叶面泡状突起, 叶背脉
明显突起,甚至变形弯曲, 叶色呈浓淡不均的花叶斑驳
状的落葵植株上采集了病叶,得到病毒分离物 ( CMV-
Ba),并将克隆得到的 CMV-Ba外壳蛋白 ( coat p ro tein,
CP) 基因与已报道的 CMV 2个亚组的部分成员的 CP
基因进行了序列分析和比较。
1 材料与方法
1. 1 材 料
1. 1. 1 材料 罹病材料采自海南海口的菜地,置于 -
20e 冰箱保存备用。
1. 1. 2 抗血清和酶标抗体 一抗为本实验室制备的
CMV亚组Ñ 多克隆抗血清 B3,酶标记羊抗兔 IgG为博
士德生物工程有限公司生产的碱性磷酸酯酶标记的
二抗。
1. 1. 3 酶与试剂 AMV逆转录酶、RNA 酶抑制剂
( Rnasin)、dNTPs为 TaKaRa公司产品, TaqDNA聚合酶
购自 P romega公司, PCR产物回收试剂盒为 TIANGEN
公司产品。
1. 1. 4 载体与菌株 pMD 18-T载体购自 TaKaRa公
司,大肠杆菌 DH5A菌种由本实验室保存。
1. 1. 5 合成引物 根据 CMV亚组 Ñ 外壳蛋白基因序
列设计引物, 由上海生工合成。 5c端同源引物: 5c-
GACAAATCTGAATCAACCAG- 3c, 3c端互补引物: 5c-
TCAAACTGGGAGCACCCCTG- 3c。
DOI：10.13523/j.cb.20080218
2008, 28( 2) 牛立霞 等: 侵染落葵的黄瓜花叶病毒分离物 CP基因序列分析
1. 2 方 法
1. 2. 1 间接酶联免疫吸附法检测 用液氮研磨采集
的样品, 以间接酶联免疫法 ( ID-ELISA )进行检测 [12]。
CMV亚组 Ñ 多克隆抗血清 B3的工作浓度为 1B300, 酶
标记羊抗兔 IgG的工作浓度为 1B3000。
1. 2. 2 总 RNA的提取 称取 0. 2g病叶用液氮研磨成
粉,迅速加入两倍体积的水饱和酚 /氯仿 /异戊醇 ( 25B
24B 1 )混合液和 两倍体积的 LiC l提取缓冲 液
( 100mmol /L LiC,l 100mmol /L Tris-C l pH8. 0, 10mmol /L
EDTA, 1% SDS, 1% Na2 SO3 ), 混匀, 冰 浴 10m in,
12000r /m in, 4e 离心 20m in,上清转移至离心管中, 加
入等体积 4mol /L LiC ,l混匀后置 4e 沉淀过夜, 4e 离心
20m in,沉淀用 70%的乙醇漂洗,吹干,用适量 DEPC处
理水悬浮。
1. 2. 3 单链 cDNA的合成 按 TaKaRa公司的操作说
明, 20L l的反应体系中,加入上述提取的 RNA 1Lg, 3c
端互补引物 1L ,l 10mmol /L dNTPs 1L ,l 5 @Buffer 4L ,l
RNA酶抑制剂 20U, AMV 逆转录酶 100U, 42e 反应
60m in后, 70e保温 15 m in,然后置 - 20e保存。
1. 2. 4 PCR体外扩增 在 20L l反应体系中加入 10 @
PCR Buffer 2L ,l加 3c端互补引物和 5c端同源引物各 0.
5L ,l 10mmol /L dNTPs 0. 5L ,l Taq聚合酶 2U,补加双蒸
水至 20L l。在 PCR仪上进行反应, 扩增反应条件为:
94e , 2m in;然后 94e变性 45s, 58e 退火 50s, 72e 延伸
60s,从变性到延伸完成 35个循环后, 72e 保温 7m in。
用 1%的琼脂糖凝胶电泳检查分析。
1. 2. 5 CP基因的克隆和序列分析 PCR扩增产物经
DNA回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收, 回收的 PCR产
物和 T载体经 T4 DNA连接酶连接后, 转化大肠杆菌
DH 5A感受态细胞,涂布在 LB固体培养基 (含氨苄青
霉素 100Lg /m ,l X-gal、IPTG), 37e 过夜培养, 挑取白色
菌落接种于含 100mg /L氨苄青霉素的 LB培养液中,
37e , 250r /m in震荡培养 3h, 取少量菌液进行 PCR检
测,将阳性菌系进行穿刺培养, 送北京三博远志生物技
术有限责任公司测序。用 DNAMAN软件比较所克隆
的 CP基因与 GenBank中部分已收录的 CMV CP基因
的核苷酸和推导氨基酸的序列同源性。
2 结 果
2. 1 间接酶联免疫吸附法检测
以 CMV香蕉分离物为阳性对照 ( CK+ ),以健康落
葵为阴性对照 ( CK- ), 0. 05mmol /L碳酸盐缓冲液为空
白对照 ( B lank),用本实验室制备的 CMV亚组 Ñ 多克
隆抗血清 B3血清检测, 反应结果见表 1。由表 1可以
看出,病样 1和病样 2与阳性对照一样,检测的 OD405值
明显高于阴性对照 2倍,也就是说它们都与本实验室
制备的 CMV亚组 Ñ多克隆抗血清呈阳性反应,都属于
亚组 Ñ 。
表 1 病毒分离物的 ID-ELISA测定 ( A405吸收值 )
T ab le 1 ID-EL ISA de term ina tion of sam p le s
( absorb ing va lue of A405 )
Samp les
An tiserum
B3
Read s
Ñ Ò Average React ion s
Blank 0. 439 0. 433 0. 436 -
CK+ 2. 252 2. 448 2. 350 +
CK - 0. 546 0. 533 0. 539 -
Sample 1 1. 227 1. 238 1. 233 +
Sample 2 2. 052 2. 133 2. 092 +
2. 2 CMV-Ba CP基因的克隆
RT-PCR扩增产物的电泳结果显示,在 1%的脂糖
凝胶上, 2个病样的扩增产物均呈现一条分子量约为
650bp的 DNA条带 (图 1),其大小与已报道的 CMV CP
基因分子量基本相同。将扩增得到的基因片段克隆于
pMD 18-T载体后,转化大肠杆菌 DH5A。挑取白色菌
落,进行菌落 PCR检测,获得部分 PCR阳性克隆。
图 1 CMV CP基因 RT-PCR扩增产物
F ig. 1 RT-PCR amp lifica tion ofCM V CP gene
M: Marker DL2000; 1: Negative contro;l
2: D iseased samp le 1; 3: D iseased samp le 2
2. 3 CMV-Ba CP基因的序列分析
分别随机挑取 2个病样的 PCR阳性菌系穿刺培
养,进行双向测序序列。测定结果表明, 2个病样的 CP
基因序列完全一致。所得 CMV落葵分离物 CP基因全
长 657bp( GenBank上登陆号为 EF424776), 编码 218
个氨基酸 (图 2)。
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中国生物工程杂志 China Biotechnology Vo.l 28 No. 2 2008
图 2 CM V-Ba CP基因核苷酸序列以及推导的氨基酸序列
F ig. 2 The nucleotid e and p red icted am ino ac id sequence of CMV -Ba isola te CP gene
2. 4 CMV-Ba CP基因与 CMV两亚组部分 CP基因
序列的比较
将 CMV-BaCP基因与其它 22个 CMV株系或分离
物的 CP基因序列进行同源性比较 (表 2), 并根据它们
的核苷酸序列同源性,绘制系统进化树 (图 3)。从表
2,可以看出 CMV-Ba CP基因与亚组 Ñ 各株系或分离物
CP基因之间的核苷酸序列同源性为 91. 17% ~
95. 43%, 推导氨基酸序列的同源性为 95. 41% ~
97. 71%。与亚组 Ò 各株系或分离物 CP基因之间核苷
酸序列同源性为 75. 30% ~ 75. 76% ,推导氨基酸序列
的同源性为 81. 28% ~ 81. 74%。表明 CMV-Ba与亚组
Ñ株系或分离物同源性关系更密切,因而属于亚组Ñ 。
表 2 CMV-Ba CP基因与 CMV两亚组部分株系或分离物 CP基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性
Tab le 2 N ucleotid e and am in o acid sequen ce h om ology of CP gen e amon g CM V-Ba and
som e CM V stra in s or isla tes of sub group Ñ and sub group Ò
Strain or Isolate A ccession No. O rigin Nucleotid eH omology(% ) Amino acidH omology(% ) Subgroup
BX DQ399550 China 91. 17 95. 87 Ñ
CS AY429437 China 91. 63 95. 41 Ñ
Fny NC_002034 Un ited States 92. 85 96. 79 Ñ
K AF127977 Un ited States 92. 24 97. 71 Ñ
KPS10 EF608461 Thailand 94. 98 97. 25 Ñ
Maharastra DQ640743 Ind ia 95. 13 96. 33 Ñ
Phy DQ412732 China 93. 30 96. 79 Ñ
Pl-1 AM183116 Spain 93. 15 96. 79 Ñ
Rauvolfia DQ914877 Ind ia 95. 43 97. 25 Ñ
SD AF071551 China 93. 46 97. 25 Ñ
SG15 AY560556 Thailand 95. 13 97. 25 Ñ
LY AF198103 Au stralia 75. 30 81. 74 Ò
Q M21464 Au stralia 75. 76 81. 74 Ò
TN AB176847 Japan 75. 45 81. 74 Ò
WL D00463 Un ited States 75. 30 81. 28 Ò
Xb AF268598 China 75. 61 81. 28 Ò
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2008, 28( 2) 牛立霞 等: 侵染落葵的黄瓜花叶病毒分离物 CP基因序列分析
图 3 CMV-Ba CP基因与 CMV两亚组部分株系或分离物 CP基因的核苷酸序列同源图示
F ig. 3 Sequ ence r e la t ion sh ip dend rogram produced from nuc leotid e sequen ce hom ology of CP gen e
am ong CMV-Ba and som e CMV str a in s or isla tes of subgroupÑ and sub groupÒ
3 讨 论
植物病毒 ELISA血清学反应在病毒鉴定上被广泛
采用,并主要用于快速测定病毒病的发生,而核苷酸序
列分析方法则可更准确检测病毒,将具有极其微小差别
的 2个或多个株系区分开,确定病毒的分类, 是区分和
鉴定病毒株系的最可靠的方法 [13]。由于 CMV基因组序
列变异较大, 株系繁多, 分离自不同地区、不同寄主的
CMV在生物学和分子生物学特征上均具很大差别, 使得
抗 CMV工作难度大为增加,因此对病毒所属亚组进行
鉴定是很有必要的。为此,作者采用 ELISA血清学反应
和核苷酸序列分析方法相结合,对落葵花叶病病原进行
分析。
CMV是雀麦花叶病毒科 (Bromoviridae)黄瓜花叶病
毒属 (Cucumovirus)的典型成员,是分布最广的植物病毒
之一,基因组包括 3个正单链 RNA和第 4个亚基因组
RNA。根据血清学关系和核苷酸序列分析等可将 CMV
分为 2个亚组 (亚组 Ñ和 Ò ) [14]。CMV核苷酸序列和氨
基酸序列同源性在亚组间的株系中为 76% ~ 84%, 而在
亚组内株系间却达 90%以上 [15]。通过 CP基因序列同
源性比较, CMV-Ba与印度分离物 CMV-Rauvolfia的核苷
酸序列和氨基酸序列同源性相对较高,核苷酸序列同源
性为 95. 43% ,氨基酸序列同源性为 97. 25%, 与 ELISA
血清学检测结果一致,验证其属于亚组Ñ 。
国内外至今对由黄瓜花叶病毒引起的落葵花叶病
未见有报道,本文是首次对此病害及其病原进行了比较
系统地研究和报道,确定其属于 CMV亚组 Ñ 的成员,为
本地区 CMV流行学研究奠定了基础。
参考文献
[ 1 ]周淑荣,魏国先.落葵的栽培与利用.特种经济动植物, 2001,
( 8 ): 29
Zhou S R, W eiG X. Special Economic An imal and Plan,t 2001,
( 8 ): 29
[ 2 ]张宝棣,彭庆平. 广州地区落葵病害初步调查. 广东农业科
学, 1996, ( 2): 29~ 31
Zhang B L, PengQ P. Gu angdong Agricu ltu ral Sciences, 1996,
( 2 ): 29~ 31
[ 3 ] A lvarez Garcia LA. Acrothecium leaf spot ofBa sella rubra L. Jour
Agric UnivPuerto Rico, 1943, 27 ( 4): 149~ 164
[ 4 ]周晓燕.落葵紫斑病的防治.云南农业科技, 2000, ( 6): 29
Zhou X Y. Yunnan Agricu ltu ral Scien ce and Technoiogy, 2000,
( 6 ): 29
[ 5 ]雷文标.落葵主要病虫害的发生与综合防治技术. 福建热作
科技, 2004, 29( 1): 19~ 20
LeiW B. Fu jian Science& Technology of T ropica lCrop s, 2004,
29( 1 ): 19~ 20
[ 6 ]卢隆杰, 苏浓,岳森,等.落葵常见病虫害的防治. 植物医生,
2006, 19( 1): 14~ 16
Lu L J, Su N, Yue S, et a.l Plant Doctor, 2006, 19( 1 ): 14~ 16
[ 7 ]姜海平,桑芝萍,孙建东,等. 落葵蛇眼病的发生与综合防治
技术.植保技术与推广, 2000, 20( 2 ): 19
J iangH P, Sang Z P, Sun J D, et a.l P lan t Protection Technology
and E xtension, 2000, 20( 2): 19
[ 8 ]刘文珍,高振江,吕佩珂,等.落葵的几种叶部病害 (下 ). 长江
蔬菜, 1996, ( 8): 13~ 14
Liu W Z, Gao Z J, Lu P K, et a.l Jou rnal of Changjiang
Vegetab les, 1996, ( 8 ): 13~ 14
[ 9 ]陈永芳, 郭坚华, 方中达, 等. 落葵上发现短小杆菌属
99
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vo.l 28 No. 2 2008
(Curtobacterium )一个新的致病变种.植物病理学报, 2000, 30
( 2): 171~ 175
Chen Y F, Guo J H, Fang Z D, et a.l Acta Phytopath olog ica
Sin ica, 2000, 30( 2 ): 171~ 175
[10 ]赖贝元.落葵新病害根结线虫病初步鉴定.广东农业科学,
1997, ( 2): 38~ 39
LaiB Y. GuangdongAgricu ltu ralSciences, 1997, ( 2 ): 38~ 39
[11 ] Hu ang C H, Chang Y C. Ba sella rugose mosaic virus, a new
potyviru s in fectingBa sella rubra. Plan tPathology, 2006, 55: 819
[12 ] Koenig R. Ind irect ELISA methods for the broad specificity
d etect ion of p lant viruses. Gen V iro,l 1981, 55: 53~ 62
[13 ]李志勇,夏蕙娟,董金皋,等.北京、宁夏甜椒上分离的黄瓜花
叶病毒 CP基因序列分析及亚组鉴定. 河北农业大学学报,
2005, 28 ( 4): 89~ 92
Li Z Y, X ia H J, Dong J G, et a.l Jou rnal of Agricu ltrual
Un iversi ty ofH eb e,i 2005, 28 ( 4): 89~ 92
[14 ] BhatA I, H areesh P S, Madhub ala R, et a.l Sequencing of coat
p ro tein gen e of an isolate of cu cumbermosaic viru s infect ing b lack
pepper ( P iper n igrum L ) in India. J P lant Biochemistry&
Biotechnology, 2005, 14: 37~ 40
[15 ] 崔连民,张福进,刘学春,等.黄瓜花叶病毒山东分离物外壳
蛋白基因的克隆及序列分析.山东农业科学, 2005, ( 4): 3 ~ 6
Cu i L M, Zhang F J, Liu X C, et a.l Sh andong Agricu ltu ral
Sciences, 2005, ( 4): 3~ 6
Sequence Ana lysis of Coa t P rote in G ene of Cucumber M osa ic
V iru s Isola te In fectingBasella rubra L.
NIU Li-xia NIU Sheng-niao WANG Jian-hua LIU Zhi-xin
( State Key Laboratory of Trop icalCrop Biotechno logy, In stitu te of Trop ical Bioscience and Biotechnology, H aik ou 571101, Ch ina)
Ab str act Cucumber mosaic virus was detected from in fec ted Basella rubra L. with the ind irect enzyme-
linked immunosorbent assay. Tota lRNA was extracted from infected leaves and the cDNAs of coat p rotein gene of
CMV-Ba were ob tained by RT-PCR. The amp lified cDNA fragmentswe re then cloned into pMD 18-T vec tor and
sequenced, the resu lt showed that the CP genewas 657 nucleotides in length. Th is sequencewas a lignedw ith the
obtained CP gene and some CMV strains or isola tes of subgroup Ñ and subgroup Ò in GenBank usingDNAMAN
softwa re. The results showed that CMV-Ba shared 90. 9% ~ 93. 8% and 76. 1% ~ 76. 9% identity w ith the
known CP genes of subgroup Ñ and Ò respec tive ly in nucleotide leve,l on the other hand, am ino acids deduced
from CMV-Ba CP gene sha red 92. 7% ~ 97. 7% and 72. 4% ~ 78. 1% identity w ith the known CP prote in of
subgroup Ñ and Ò , respective ly. Th is suggested tha tCMV-Ba CP gene be longs to CMV subgroupÑ .
K ey word s Basella rubra L. Cucumbermosa ic virus Coat prote in gene Sequence analysis
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