全 文 ：　　文章编号: 0412-0914( 2001) 03-0257-08
抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的培育
朱常香 ,宋云枝 ,张 松 ,郭兴启 ,温孚江*
(山东农业大学生命科学学院 , 泰安 271018)
摘要: 以大白菜栽培品种“福山大包头”的子叶柄为供试材料 ,对影响大白菜植株再生和基因转化频
率的因素进行了研究。 在此基础上 ,建立了大白菜高效再生体系和有效的基因转化体系 ,并将芜菁花
叶病毒的 CP基因 ( TuMV-CP)导入大白菜中 ,获得转化植株。 PC R检测和 Southern杂交分析证明
TuMV-CP基因已整合于大白菜的基因组中 ; N or thern杂交分析及 ELISA检测表明 TuMV-C P基因
在转录和翻译水平上进行了有效表达。转基因植株 T1代的遗传分析表明 ,外源基因在转基因植株后
代中遵循 3∶ 1的分离规律。 抗病性测定结果显示 ,转基因植株具有明显的抗病毒侵染能力。
关键词: 大白菜 ; TuMV-CP基因 ; 根癌农杆菌 ; 基因转化
中图分类号: S436. 341. 11; Q943. 2　　　文献标识码: A
PRODUCTION OF TRANSGENIC CHINESE CABBAGE BY TRANSFORMATION
WITH THE CP GENE OF TURNIP MOSAIC VIRUS
ZHU Chang-x iang , SON G Yun-zhi, ZHANG Song , GUO Xing-qi , WEN Fu-jiang
( Col leg e of Life Sciences , Sh andong Ag ricul tural Univ ersi ty, Taian 271018, Ch ina)
Abstract: Using cotyledonary petioles of Chinese cabbage [ Brassica campestris L. ssp.
pekinensis ( Lour ) Olsson ] “ Fushan Dabaotou” as material, w e investiga ted the facto rs affec-
ting plant regeneration and genetic transforma tion media ted by Agrobacterium tumefaciens. As
a result , an ef ficient sy stem for plant reg eneration and genetic t ransforma tion w as established,
and the TuMV-CP gene w as int roduced into Chinese cabbage. Preliminary mo lecula r analysis
indica ted tha t fiv e of the 32 putative transgenic plants w ere PCR positiv e. The fiv e plants w ere
then subsequently analy zed by Southern blo t. The resul ts show ed tha t the TuMV-CP gene w as
integ rated into the chromosomes of the plants. No rthern blo t analysis and ELISA test indica ted
that the TuMV-CP gene was expressed a t both t ranscriptional and translational lev els. Further
studies indicated that the TuMV-CP gene w as seg regated a t a 3∶ 1 ratio in T1 generation. Re-
sistance assay revealed that the plants of T1 genera tion show ed high lev el of resistance to
TuMV infection.
Key words: Chinese cabbage; TuMV-CP gene; Agrobacterium tumefaciens; g enetic transfor-
ma tion
　　收稿日期: 2000-07-05; 修回日期: 2000-12-18
　　基金项目: 国家“九五”科技攻关项目 ( 01-02-03-01) ;山东省“三 0工程”资助项目
　　* 项目主持人 ,本文通讯联系作者
　　作者简介: 朱常香 (1970- ) ,女 ,山东龙口人 ,山东农业大学生命科学学院讲师 ,硕士 ,主要从事植物基因工程研究。
第 31卷　第 3期
2001年　 8　 月
植　物　病　理　学　报
ACT A PHYTOPATHOLOGICA SIN IC A
　 Vol. 31　 No. 3
　 Aug. 　　 2001
DOI : 10. 13926 /j . cnki . apps . 2001. 03. 012
　　大白菜病毒病是大白菜的三大病害 (病毒病、霜霉病和软腐病 )之一。现已证明其主要病原为
芜菁花叶病毒 ( turnip mosaic vi rus, TuMV )。 TuMV是马铃薯 Y病毒属的一个种。 TuMV的侵
染可造成大白菜植株不能结球 ,严重影响大白菜的产量和品质。常规的防治措施是喷施农药来灭
杀传毒蚜虫 ,但通常防效不明显 ,且加重了对环境的污染。培育抗病品种是防治病毒病的最佳途
径。虽然目前使用的杂交种对 TuMV具有一定的抗性 ,但杂交大白菜品质、口感以及风味等远远
不及传统的“胶东大白菜”。 利用常规育种方法改良优良的地方品种面临很多困难。
基因工程技术的发展为植物病毒病的防治提供了一条新途径。在植物抗病毒基因工程中 ,外
壳蛋白 ( C P)基因策略是最早获得成功、也是至今应用最为广泛的一种策略。这一策略已在 10个
属 30余种病毒上获得成功。采用这一方法培育成功的抗病毒转基因植物有烟草、番茄、苜蓿、马
铃薯等。在十字花科芸薹属植物的抗病毒基因工程中 ,已将 TuMV-CP基因转入了甘蓝型油菜
中 ,转基因植株对 TuMV有明显的抗性 [1 ]。 但由于大白菜植株再生及基因转化体系难以建立等
原因 ,至今尚未见大白菜抗病基因工程的研究报道。
本研究在建立了大白菜高频再生体系和有效基因转化体系的基础上 ,利用农杆菌介导法 ,将
芜菁花叶病毒的外壳蛋白 ( TuMV-CP)基因导入了栽培品种“福山大包头”中 ,获得了抗病毒工
程植株 ,并在此基础上对 CP基因的遗传等方面进行了研究。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植物　供试材料为典型的优质“胶东大白菜”栽培品种“福山大包头”带子叶的子叶柄 (以
下简称子叶柄 )。
1. 1. 2　农杆菌菌株及表达载体　农杆菌菌株为 LBA4404;表达载体质粒为 pBTu,内含有
TuMV-CP基因 ,双 CaMV 35S启动子 , N PTⅡ标记基因 , NO S终止子 (图 1)。 该质粒由中国科
学院莽克强先生和陈正华先生惠赠。
图 1　 pBTu质粒图谱
Fig . 1　 Construc tion o f pBTu
1. 1. 3　 PCR引物　用于 PCR检测的 2个引物分别为: CaMV 35S启动子的部分序列 CG-
T AAGGGATGACGCACAA和 NO S终止子中一段互补的序列 CGCAAGACCGGCAACAGG。
1. 1. 4　病毒和抗血清　病毒 TuMV和 TuMV抗血清均由本研究室分离、纯化和制备。
1. 2　方法
1. 2. 1　农杆菌菌液的制备及大白菜的转化　取保存的农杆菌 LBA4404( pBTu) ,接种于 Y EP
258 植　　物　　病　　理　　学　　报 31卷
培养基 (含有卡那霉素 50 mg /L,利福平 20 mg /L)中 ,在 28℃条件下 ,摇动培养 24～ 30 h( 250
r /min) ,至对数生长期。将菌液离心 15 min( 3 000 r /min) ,去上清 ;用无激素 MS培养液重新悬
浮菌体 ,稀释至 OD600为 0. 6～ 0. 8,备用。在无菌的条件下 ,切取苗龄 4～ 5 d的无菌幼苗子叶柄 ,
插置于预培养基 ( M S+ N AA 0. 5 mg /L+ BA 2. 0 mg /L+ AgNO3 4. 0 mg /L)中。将预培养后的
子叶柄在菌液中浸泡 5 min,用滤纸吸干 ,转入共培养基 ( M S+ N AA 0. 5 mg /L+ BA 2. 0 mg /L
+ 乙酰丁香酮 10 mg /L)。 共培养后的子叶柄 ,先用无菌水 (附加羧苄青霉素 500 mg / L)漂洗 4
次 ,再用无激素 MS培养液 (附加羧苄青霉素 500 mg / L)漂洗 1次后 ,转入恢复培养基 ( M S+
N AA 0. 5 mg /L+ BA 2. 0 mg /L+ AgNO3 4. 0 mg /L+ 羧苄青霉素 250 mg /L)。 5～ 7 d后 ,转移
到选择培养基 ( M S+ N AA 0. 5 mg /L+ BA 2. 0 mg /L+ AgNO3 4. 0 mg /L+ 羧苄青霉素 250
mg /L+ 卡那霉素 10 mg /L)上 ,筛选卡那霉素抗性芽。
1. 2. 2　 TuMV-CP基因的整合分析　植物基因组 DNA的提取按刘学春等 [ 2]的方法进行。 PCR
扩增反应按标准方法进行 [3 ]。扩增条件: 94℃变性 1 min, 50℃复性 1 min, 72℃延伸 2 min,共 35
个循环。 PCR结束后 ,产物进行 1%琼脂糖电泳检测。 Southern杂交程序按《分子克隆》上的方法
进行 [3 ]。杂交探针为 HindⅢ酶切质粒 pBTu产生的包含双 CaMV 35S启动子和 TuMV-CP基因
区段 ,约 1. 8 kb(图 1)。
1. 2. 3　 TuMV-CP基因转录水平分析　植物总 RNA提取参照 Chirgw in等 [ 4]的方法。 Northern
杂交程序参照《分子克隆》上的方法进行 [ 3]。
1. 2. 4　 TuMV-CP基因翻译水平的检测　 TuMV-CP基因翻译水平的检测采用间接 ELISA
法 ,第一抗体用兔抗 TuMV,工作浓度为 1∶ 2 000;第二抗体用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶
标抗体 ,工作浓度为 1∶ 1 000。取转基因植株和非转化植株叶片称重、研磨后 ,用 0. 05 mol /L pH
9. 6的碳酸盐缓冲液稀释 10倍 , 8 000 r /min离心 5 min。取上清包埋酶联板 ,每个样品重复 6
孔 , 37℃放置 4 h;用 0. 02 mol /L pH7. 0的磷酸盐缓冲液洗板 3次。加第一抗体 , 37℃放置 4 h,
洗板同上。加第二抗体 , 4℃过夜 ,洗板同上。加底物邻苯二胺 ( OPD) ,室温显色 30 min。加 4 mo l /
L的 H2 SO4终止反应 ,用 DG3022A型酶联免疫检测仪测 OD490nm吸收值。
1. 2. 5　转基因植株的遗传分析　取转基因大白菜的种子和非转化大白菜的种子 ,分别在温室内
播种。 5～ 6叶期时 ,取少量叶片提取基因组 DNA,用 PCR检测 TuMV-CP基因在转基因后代中
的分离情况。
1. 2. 6　转基因植株的抗病性检测　用感染 TuMV的油菜病汁液 (估测病毒浓度 100μg /ml )摩
擦接种 T1代 PCR阳性植株 ,以未转化植株作为对照。 接种后观察发病情况 ,并于接种后 15、 30
和 45 d,用 ELISA法检测植株中病毒含量。
2　结果与分析
2. 1　大白菜高频再生体系的建立
在已有研究的基础上 [ 5] ,建立了大白菜高频再生体系。在该体系中 ,最佳的外植体为苗龄 4
～ 5 d的幼苗子叶柄 ;最佳的接种方式是将子叶柄插入培养基中 ;最佳的培养基为 MS+ NAA
0. 5 mg /L+ BA 2. 0 mg /L+ AgNO3 4. 0 mg /L;最佳的培养条件为 25℃ , 16 h光照 , 8 h黑暗。采
用该体系对不同大白菜品种的再生试验表明 ,该体系适于多数供试品种 ,特别是卵圆型品种 ,如
福山大包头、福山核桃纹、济南大根等 ,这些品种不定芽的分化频率均在 70%以上。
2593期 朱常香等 : 抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的培育
2. 2　农杆菌介导的大白菜基因转化及转化植株的获得
为了提高转化效率 ,对影响农杆菌介导的大白菜基因转化频率的几个重要因素进行了研究。
结果表明 ,预培养对于农杆菌介导的大白菜基因转化是必须的 ,最佳的预培养时间为 2～ 3 d。预
培养时间过短或过长均会导致抗性芽再生频率的降低 ,未经预培养或预培养 5 d的子叶柄均未
获得抗性芽。共培养阶段是农杆菌直接感染外植体组织的阶段 ,感染时间的长短直接影响着转化
频率的高低。 在农杆菌介导的大白菜基因转化中 ,共培养时间以 2 d为宜。共培养时间过短 ( 1
d) ,转化频率低 ;共培养时间过长 ( 4～ 5 d) ,外植体细胞受农杆菌伤害严重 ,细胞褐化死亡 ,无抗
性芽产生。乙酰丁香酮不能提高转化频率 ,反而会降低转化频率。 在菌液和共培养基中添加 4
mg /L或 10 mg /L的乙酰丁香酮 ,抗性芽的转化频率大幅度地降低 ,仅为不加乙酰丁香酮的 1 /5
～ 1 /6。
依据上述优化条件 ,将转化后的子叶柄转入选择培养基中 , 15 d后在子叶柄切口处可分化
出白色非抗性芽和绿色抗性芽。对 336个芽进行统计表明 ,产生绿色抗性芽的子叶柄数占接种子
叶柄数的 12. 5% 。将绿色抗性芽转入生根培养基中 , 20 d左右可分化出大量的不定根 ,发育成完
整的植株。移栽后的转化植株发育正常 ,农艺性状与转化受体 “福山大包头”无明显差异。
2. 3　 TuMV-CP基因整合分析
2. 3. 1　转化植株的 PCR检测　对所获得的 32株卡那霉素抗性植株进行 PCR扩增。结果有 5
株扩增出了 1. 3 kb的 DNA片段 ,其大小与用质粒 pBTu为模板扩增的片段相同 (图 2)。
图 2　转化植株的 PCR检测
Fig . 2　 Assay PCR o f tr ansgenic plants
TR1～ TR5: 转基因植株基因组 DN A; N: 非转化植株基因组 DN A; P: 质粒 pBTu; L:分子量标准 ( 1kb DNA
Ladd er)。
TR1- TR5: Genome DN A of transg enic plants; N: Genome DN A of u nt rans formed plant; P: Plasmid DN A( pB Tu ) ;
L: 1kb DN A Ladder.
2. 3. 2　转基因植株的 Southern杂交分析　 PCR阳性植株基因组 DNA和非转化植株基因组
DNA经 HindⅢ ( 2个酶切位点 )或 KpnI(单个酶切位点 )酶切 ,电泳后 ,转移到 HybondTm-N尼龙
膜 ( Amersham )上 ,用 DNA探针进行 Southern杂交分析。 Southern杂交结果显示 , PCR阳性植
株基因组 DNA的 HindⅢ 酶切片段为一条带 ,分子大小约为 1. 8 kb,与质粒 DN A杂交片段大小
相同 ,表明转基因植株中存在完整的 TuMV-CP基因 (图 3-A) ;不同植株经 KpnI单酶切的片段
显示 2～ 3条带 ,这表明 TuMV -CP基因在不同转基因植株的基因组 DNA内存在 2～ 3个插入
位点 ,在不同转基因植株中至少存在 2～ 3个拷贝 (图 3-B)。
260 植　　物　　病　　理　　学　　报 31卷
2. 4　 TuMV-CP基因转录水平分析
对所获得的 5株转基因植株中的 4株 ( T R1、 TR3、 TR4和 TR5)进行了 Nor thern杂交分析。
转基因植株和非转化植株的总 RNA经甲醛变性凝胶电泳后 ,转移到 HybondTm-N尼龙膜
( Amersham )上 ,用 DNA探针进行杂交。杂交结果显示 (图 4): 4株转基因植株均出现明显的杂
交信号 ,杂交带大小约为 0. 8 kb,与期望值大小相符 ;而 2株非转化植株未出现杂交信号。这表明
TuMV-CP基因在转录水平上进行了有效表达。
2. 5　 TuMV-CP基因翻译水平检测
ELISA检测结果显示:以 8μg /m l纯化病毒为阳性对照的 OD490值为 0. 700,而阴性对照 (非
2613期 朱常香等 : 抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的培育
转化植株 )为 0. 085, 4株转基因植株 TR1、 TR3、 TR4和 TR5的 OD490则分别为 0. 573、 0. 265、
0. 410、 0. 197,表明 TuMV -CP基因在翻译水平上进行了有效表达。 各转基因植株间 CP的积累
量存在一定的差异 , TR1和 TR4中 TuMV-CP的积累量明显高于 TR3和 TR5。
2. 6　转基因植株的遗传分析
4株转基因植株仅有 2株 ( T R1和 TR5)通过春化 ,正常开花结实。对 TR1和 T R5两个株系
T1代部分植株的 PCR扩增结果 (表 1)显示 , TuMV-CP基因在子一代发生分离 ,阳阴性分离比
基本符合 3∶ 1。这表明 T0代转基因植株的基因型为杂合体 ,且多个外源基因是作为一个单显性
基因遵循孟德尔分离规律。
表 1　 TuMV-CP基因在自交 T1代的分离
Table 1　 Segregation of TuMV-CP gene in T1 progeny plants
株系
Lines
阳性植株
Transgenic plants
阴性植株
Nont ransgenic plants
比值
Ratio
χ2 P值
P value
T R1-T1 16 7 3∶ 1 0. 368 > 0. 50
T R5-T1 16 6 3∶ 1 0. 061 > 0. 80
　　 TR1-T1, TR5-T1:分别来自 T0转基因植株 T R1和 T R5的 T1代植株。
　　 TR1-T1, TR5-T1: Plants of T1 gen eration f rom T0 t ransgenic plan ts of T R1 and T R5, respect ively.
2. 7　 T1代转基因株系 CP积累量及抗病性检测
对 TR1和 TR5两个株系 T1代 PCR阳性植株中的 CP积累量进行了 ELISA检测。结果显
示 (表 2): TuMV-CP基因在 T1代转基因植株中同样进行了有效表达 , T R1-T1株系中 CP积累
量明显高于 TR5-T1株系。攻毒试验显示 , 2个转基因株系的抗性水平无明显差异 ,均表现出明
显的抗病毒侵染的能力。非转化植株接种病毒后 20 d表现感病症状 , 30 d时出现明显的花叶 ,叶
片严重皱缩畸形 ;而转基因植株至 45 d左右才出现轻微的花叶症状 ,且症状不随植株的发育呈
加重趋势。接种后 15、 30和 45 d的 ELISA检测结果显示 ,转基因植株体内病毒的含量明显低于
非转化植株 (表 2)。
表 2　转基因株系的抗病性检测 (ELISA)
Table 2　 ELISA testing of transgenic plant lines
株系
Lines
接种病毒前 ELISA
测试结果 ( OD490) 1
EL ISA tes t ( OD490 )
befo re inoculat ion
接种病毒后 ELISA检测结果 (OD490 ) 2
ELISA tes t ( OD490 ) af t er inoculation
15天
15 days
30天
30 days
45天
45 days
CK( - ) 0. 090± 0. 011 0. 095± 0. 008 0. 090± 0. 010 0. 105± 0. 013
TR1-T1 0. 553± 0. 049 0. 115± 0. 010 0. 145± 0. 018 0. 255± 0. 021
TR5-T1 0. 207± 0. 034 0. 100± 0. 013 0. 120± 0. 014 0. 210± 0. 015
CK(+ ) —— 0. 255± 0. 012 0. 400± 0. 031 0. 610± 0. 017
　　 1叶片提取液稀释 10倍 ( Leaf ext ract s were di lu ted 10 folds ) , 2叶片提取液稀释 50倍 ( Leaf ex t racts w ere di luted 50 folds ) ;
　　 CK( - ): 未接种病毒的非转化对照植株 ( 5株 ) , CK(+ ) : 接种病毒的非转化对照植株 ( 10株 ) , TR1-T1: 来自 T0代转基因
植株 T R1的 T1转基因植株 ( 16株 ) , TR5-T1: 来自 T0代转基因植株 TR5的 T1转基因植株 ( 16株 )。
　　 CK( - ): Unt rans formed plants wi th out vi ru s inoculat ion ( 5 plants ) ; CK(+ ): Virus in oculated un transformed plants (
10 plants ) ; TR1-T1: Trans genic plan ts of T1 g eneration f rom T0 plants of TR1 ( 16 plan ts ) ; TR5-T1: Transgenic plants of T1
gen eration f rom T0 plan ts of T R5 ( 16 plan ts ) .
262 植　　物　　病　　理　　学　　报 31卷
3　讨　　论
本研究首次将 TuMV -CP基因导入了我国“胶东大白菜”优质栽培品种中 ,获得了抗病毒病
的工程植株 ,为大白菜抗病毒育种和优良地方品种的改良奠定了基础。
在长期的栽培过程中 ,大白菜逐渐形成了适应不同气候条件的 3种生态型: 直筒型、卵圆型
和平头型。目前已发现的对 TuMV具有抗性的品种多为直筒型大白菜 ,虽已通过杂交的方法将
抗病性转移到了其它类型的品种中 ,获得了部分抗性 ,但杂交大白菜却无法保持优良地方品种
(卵圆型 )的品质和风味。利用基因工程技术培育的抗病毒大白菜既具有显著抗病毒侵染能力 ,又
可保持其原有的优良品质 ,因此有着更为广阔的应用前景。
提高再生和基因转化效率是植物基因工程的基础 ,也是大白菜抗病基因工程的难点之一。本
研究针对山东种植的大白菜品种 (特别是优质农家品种 )建立了较为理想的植株再生和基因转化
体系。对该体系的研究表明 ,不同激素的配合及配比、外植体的类型及接种方式、 AgNO3处理、不
同的光照培养条件等对大白菜的植株再生频率均有着显著影响。在农杆菌介导的基因转化中 ,预
培养及共培养时间对基因转化效率影响显著。外植体的预培养直接影响细胞的生理状态 ,进而影
响转化效率 [6 ]。共培养的时间长短决定着 T-DNA能否充分转移和整合以及农杆菌对外植体的
伤害程度 ,从而决定了转化效率的高低。为了提高转化频率 ,一些酚类化合物 (如乙酰丁香酮 )被
广泛用于单子叶植物的基因转化 ,但在双子叶植物基因转化中的作用众说不一。有研究表明甘蓝
型油菜的外植体与农杆菌共培养时 ,添加乙酰丁香酮对提高转化效率有一定的作用 [ 7]。然而
Moloney
[8 ]等认为 ,在共培养基中无需加入乙酰丁香酮一类物质。 我们的研究结果显示 ,在农杆
菌介导的大白菜遗传转化中 ,添加乙酰丁香酮不但没能提高转化频率 ,反而大幅度地降低转化频
率。出现上述结果的原因尚不清楚。推测可能是因为不同物种或品种的外植体受伤后 ,在伤口处
乙酰丁香酮等酚类物质的积累量存在一定的差异。在低积累量的情况下 ,添加外源的乙酰丁香酮
能够促进农杆菌的转化 ;而在高积累量的情况下 ,添加乙酰丁香酮会造成酚类物质浓度过高 ,对
细胞产生了直接毒害作用 ,引起细胞死亡 ,从而降低转化频率。
外源基因在转基因植株后代中的遗传稳定性是决定工程植株能否应用于农业生产的关键因
素之一。本研究结果显示 , TR1和 TR5两株转基因植株中虽至少存在着 2个拷贝的 TuMV-CP
基因 ,但用 PCR检测的结果表明 TuMV-CP基因在其 T1代转基因植株中仍表现为 3∶ 1的遗传
分离规律 ,说明插入的多拷贝的 CP基因可能呈连锁遗传。多拷贝外源基因在转基因植株后代呈
连锁遗传是一种常见的现象 [9 ] ,这种外源基因连锁整合的机制尚不清楚。对 T1代转基因植株 CP
蛋白及其抗病性检测结果表明 , TuMV-CP基因在 T1代转基因植株中同样进行了有效表达 ,转
基因植株具明显的抗病毒侵染能力。 CP基因及其抗性的稳定遗传为抗病毒转基因大白菜的应
用提供了前提条件。目前我们正在对 CP基因在转基因植株 T2代以后的后代中的遗传行为进行
研究。
CP介导的抗病性质与病毒弱株系对强株系的交互保护作用相类似。 采用此方法得到的转
基因植物通常不能获得对病毒的完全抗性 (免疫 ) ,但能获得高水平的抗性 [10 ]。 我们的研究结果
也证实了这一点。所获得的转基因大白菜 ,对 TuMV虽不表现为免疫 ,但可延迟发病 20～ 30 d,
转基因植株仅表现轻微花叶 ,植株的生长状况基本上与未接种病毒的非转化植株相似 ;植株体内
的病毒含量也明显低于非转化植株 ,约为非转化植株病毒含量的 1 /3。圆筒型大白菜生长期一般
2633期 朱常香等 : 抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的培育
为 100～ 110 d,幼苗期和莲座期 40 d左右 ,为主要感病时期。推迟发病和减轻发病症状对确保大
白菜的产量与品质具有重要的意义。 另有研究表明 [11 ] ,非翻译 RNA可介导对病毒的完全抗性
( RN A介导的抗病性 ) ,我们拟在这方面进行探索 , 期望培育出更高抗性水平的转基因大白菜。
对于 CP介导的抗性 ,目前尚没有一个统一的模型来解释其机制。早期的研究认为病毒外壳
蛋白的积累水平与抗性水平呈正相关 ,因此推测转入植物的外壳蛋白封闭了病毒基因组的脱壳
过程 ,使病毒基因组的 5′端难以释出 ,阻止了病毒的基因表达 [10 ]。 但随着研究的深入 ,人们发现
许多实验结果并不符合这一推测 ,即抗性水平与病毒外壳蛋白的表达水平并无直接的线性相关
性。现在认为 ,在转基因植株中 ,转录的 RNA可能扮演了比 CP更大的作用 [12 ] ,即 RNA介导的
抗性可能是抗病性产生的主要形式。 本研究中 , TR1和 TR5两个转基因株系中 TuMV-CP
RNA积累水平差异不明显 ,而 TuMV-CP积累量差异较大 ,但攻毒试验显示转基因植株抗性较
为一致。这是否表明转基因植株的抗性与转录的 RNA有关 ,而与 CP积累量关联不大或无关 ,有
待于进一步证实。
参　考　文　献
[1 ]　卢爱兰 ,陈正华 ,孔令洁 , 等 . 抗芜菁花叶病毒转基因甘蓝型油菜的研究 [ J]. 遗传学报 , 1996, 23( 1): 77-83.
[2 ]　刘学春 ,宋云枝 ,温孚江 , 等 . 一种单子叶植物总 DNA提取方法的改进及应用 [ J ].山东农业大学学报 , 1995, 26( 4): 491-
495.
[3 ]　 SAM BROOK J, FRITSCH E F, M AN IATIS T. M olecular cloning: a laboratory manual . 2nd ed. [M ]. New Yo rk: Cold
Spring Harbor Labo ratory Press , 1989.
[ 4 ]　 CHIRGWIN J M, PRZYBYL A A E, M acDON ALD R J, et al . Isolat ion of biologically active ribonucleic acid f rom
sources enrich ed in ribonuclease [ J] . Biochemis try, 1979, 18: 5294-5299.
[5 ]　张松 , 魏毓棠 ,温孚江 , 等 . 利用乙烯抑制剂 AgNO3建立大白菜高频植株再生体系 [ J ]. 园艺学报 , 1997, 24 ( 1) : 94-
96.
[6 ]　 DAM GAARD O V E, JEN SEN L H, RASM USSEN O S. Agrobacterium tumefaciens-mediated t ransformation of B rassi-
ca napus winter cul tivars [ J ]. Tran sgenic Research, 1997, 6: 279-288.
[7 ]　 CHAREST P J, HO LBROO K L A, GABARD J, et al . Ag robacterium-m ediated transformation of thin cell layer explan ts
f rom Brassica napus L [ J] . Th eor. Appl. Genet. , 1988, 75: 438-445.
[8 ]　 MOLONEY M M , WALKER J M, SHARM A K K. High ef fi cient t ransformation of B rassica napus using Agrobacteri-
um vectors [ J] . Plant Cell Repor t, 1989, 8: 238-242.
[9 ]　 PENG J Y, WEN F J, LIST ER R L, et a l. Inh eri tance of gusA and neo genes in t rans genic rice [ J] . Plant Molecular
Biology, 1995, 27: 91-104.
[10 ] ABEL P P, N ELSON R S, DE B, et al . Delay of di seas e dev elopm en t in t rans genic plants that ex pres s th e tobacco m osa-
ic vi rus coat protein gene [ J] . Science, 1986, 232: 738-743.
[11 ] SM ITH H A, SWAN EY S L, PARKS T D, et al . Transgenic plan t virus resi s tance mediated by unt ranslatable s en se
RN As: expression , regulation and fate of non ess en tial RN As [ J ]. Plant Cel l, 1994, 6: 1441-1453.
[ 12 ] BAKER C N. Relationship betw een t ranscript production and vi rus resis tance in t ransgenic tobacco ex pres sion po tato
leaf roll virus coat protein gen e [ J]. Plan t Cel l Report , 1993, 13: 54-58.
264 植　　物　　病　　理　　学　　报 31卷